Enzymy wymagają dodatkowych składników do prawidłowego funkcjonowania. Istnieją dwie takie klasy cząsteczek: kofaktory i koenzymy. Kofaktory to jony metali, a koenzymy to niebiałkowe cząsteczki organiczne. Oba te typy cząsteczek pomocniczych mogą być ściśle związane z enzymem lub związane tylko wtedy, gdy substrat się wiąże.

Kofaktory są obecne w ~30% dojrzałych białek. Są one często włączane do enzymu podczas jego fałdowania i biorą udział w aktywności katalitycznej enzymu. Magnez jest niezbędnym kofaktorem dla ponad 300 enzymów w organizmie człowieka, w tym polimerazy DNA. W tym przypadku jon magnezu pomaga w tworzeniu wiązania fosfodiestrowego na szkielecie DNA. Żelazo, miedź, kobalt i mangan to inne popularne kofaktory.

Wiele witamin to koenzymy, ponieważ są to niebiałkowe, organiczne cząsteczki pomocnicze dla enzymów. Na przykład biotyna – rodzaj witaminy z grupy B – jest ważna w wielu enzymach, które przenoszą dwutlenek węgla z jednej cząsteczki do drugiej.  Biotyna, witamina A i inne witaminy muszą być spożywane w naszej diecie, ponieważ nie mogą być wytwarzane przez ludzkie komórki.