Enzyme benötigen zusätzliche Komponenten für eine einwandfreie Funktionsweise. Es gibt zwei Klassen solcher Moleküle: Kofaktoren und Koenzyme. Kofaktoren sind Metallionen und Coenzyme sind organische Moleküle, die keine Proteine sind. Beide Arten dieser Hilfsmoleküle können fest an das Enzym gebunden sein oder nur dann gebunden werden, wenn das Substrat bindet.

Kofaktoren sind in ca. 30 % aller reifen Proteine vorhanden. Sie werden häufig in ein gefaltetes Enzym eingebaut und sind an der katalytischen Aktivität des Enzyms beteiligt. Magnesium ist ein essenzieller Kofaktor für über 300 Enzyme des menschlichen Körpers. Auch für die DNA-Polymerase ist es notwendig. In diesem Fall hilft das Magnesium-Ion bei der Bildung der Phosphodiester-Bindung des DNA-Gerüsts. Eisen, Kupfer, Kobalt und Mangan sind weitere übliche Kofaktoren.

Viele Vitamine sind Coenzyme. Sie sind keine Proteine, sondern organische Hilfsmoleküle für Enzyme. So ist beispielsweise Biotin, ein Typ der B-Vitamine, in vielen Enzymen wichtig, die Kohlenstoffdioxid von einem Molekül auf ein anderes übertragen. Biotin, Vitamin A und andere Vitamine müssen mit der Nahrung aufgenommen werden, da sie nicht von menschlichen Zellen hergestellt werden können.