Enzimler, düzgün çalışması için ek bileşenlere ihtiyaç duyar. Bu tür iki molekül sınıfı vardır: kofaktörler ve koenzimler. Kofaktörler metalik iyonlardır, koenzimler ise protein olmayan organik moleküllerdir. Bu yardımcı molekül türlerinin her ikisi de enzime sıkıca bağlanabilir veya yalnızca substrat bağlandığında bağlanabilir.

Kofaktörler, olgun proteinlerin ~% 30'unda bulunur. Katlandıklarında sıklıkla bir enzime dahil edilirler ve enzimin katalitik aktivitesinde yer alırlar. Magnezyum, insan vücudundaki DNA polimeraz dahil 300'den fazla enzim için gerekli bir kofaktördür. Bu durumda magnezyum iyonu, DNA omurgasında fosfodiester bağının oluşumuna yardımcı olur. Demir, bakır, kobalt ve manganez diğer yaygın kofaktörlerdir.

Pek çok vitamin, protein olmayan, enzimler için organik yardımcı moleküller oldukları için koenzimdir. Örneğin, biotin, bir B vitamini türü, karbondioksiti bir molekülden diğerine aktaran çeşitli enzimlerde önemlidir.   Biyotin, A vitamini ve diğer vitaminler insan hücreleri tarafından yapılamayacağı için diyetimizde alınmalıdır.