Rotulagem e Células de imagem no rombencéfalo Zebrafish

Resumo

Chave para a compreensão dos processos morfogenéticos que forma o embrião precoce é a capacidade de células de imagem em alta resolução. Descrevemos aqui uma técnica para a rotulagem células isoladas ou pequenos aglomerados de células em embriões de peixe-zebra inteira com membrana-alvo Proteína Fluorescente Verde.

Resumo

Chave para a compreensão dos processos morfogenéticos que forma o embrião de vertebrados precoce é a capacidade de células de imagem em alta resolução. Em embriões de peixe-zebra, a injeção de DNA plasmídeo resultados na expressão de mosaico, permitindo a visualização de células isoladas ou pequenos aglomerados de células

Protocolo

1.Microinjection

1. Diluir plasmídeo codificando membrana-alvo proteína fluorescente verde (mGFP, cortesia de Richard Harland) a uma concentração de 40 ng / ml. DNA é preparada por linearização do plasmídeo (mGFP/PCS2 + cortesia, de Richard Harland) purificado usando o kit Qiagen Prep Maxi. Além do vermelho de fenol (diluído 1 / 10 do volume total) para a solução é o preferido para visualizar a solução. Mantenha a solução de DNA em gelo.
2. Sob microscópio estereoscópico, calibrar a agulha de injeção (90mm capilares de vidro de Narishinge Científico; Cat. NA-GD-1), alinhando a agulha em um slide graduado e batendo a parte da agulha onde o diâmetro é de 1 Hm usando uma navalha limpa blade (para obter uma ponta de tamanho apropriado).
3. A fim de calibrar a agulha para injetar um volume conhecido (2nl), conecte a agulha para o aparelho de microinjeção (PCI 100 microinjetor; Harvard Apparatus) e frente preencher a agulha com 0.5μl de uma solução contendo vermelho de fenol e água colocada em um pedaço de parafina. A solução pode ser dispensado através de um pedal. Ajuste a pressão para 7 KPa e variar o tempo (10mseg 30msec), de modo que é preciso dispensar 250 pedais 0.5μl da solução.
4. Colocar cuidadosamente a agulha calibrada em uma tira de cera em um prato de 100 milímetros umidificado Petri. Para umidificar o prato, coloque Kimwipes molhados em torno das bordas (isso evita a evaporação da solução na agulha).
5. Use uma micropipeta para carregar 0,5 1μl de DNA na extremidade da agulha (a fim de que não foi calibrado).
6. Uma vez que a solução atingiu a ponta da agulha, ligue a extremidade da agulha que foi usado para o carregamento a um aparelho de microinjeção. Ajustar as configurações no microinjetor para entregar cerca de 2 nl injecção / usando um pedal.
7. Em seguida, a posição de embriões zebrafish no meio de uma placa de Petri cheia de Medium Embrião (Stock 1,0 ml de Hank # 1, 0,1 de stock ml de Hank # 2, Stock 1,0 ml de Hank # 4, 95,9 ml DDH ₂ O, Stock 1,0 ml de Hank # 5 , Stock 1,0 ml fresco Hank # 6, Use cerca de 10 gotas de NaOH 1 M pH 7,2).
8. Uma vez que os embriões se desenvolveram ao estágio desejado, gentilmente pega o córion com uma pinça fina e situar a agulha na área de segmentação injectável. Para a expressão ampla gama mGFP, injetar DNA na gema ou do citoplasma na fase 1CELL. Para restringir a expressão de mGFP a uma região menor, injetar DNA em 4 (ou mais) células estágio para o citoplasma de uma única célula.
9. Pressione o pedal do aparelho de microinjeção e entregar cerca de 2 nl, garantindo que a solução (visível devido à adição de vermelho de fenol) é adequadamente injetado.
10. Remova cuidadosamente a agulha do embrião.
11. Repita o procedimento para todos os embriões na placa de Petri.
12. Permitir que os embriões a desenvolver-se 28,5 ° C para o estágio desejado.
13. Embriões Dechorionate suavemente descascando o córion usando uma pinça fina (se os embriões são mais jovens do que 24hpf, dechorionating numa placa de Petri de vidro aumenta a taxa de sobrevivência de embriões).
14. Remover córion vazio da placa de Petri, utilizando uma pipeta de vidro.

2. Imagem mGFP marcado seções vibratome

1. Use uma pipeta de vidro para o transporte de embriões em paraformaldeído (fixador de 4% em solução de 1X tampão fosfato (PBS). Fix embriões a 4 ° C durante a noite.
2. Lavar embriões em 1X PBS 3 vezes por 5 minutos cada.
3. Coloque os embriões em Placa de Petri e, usando uma pinça fina, retire a gema, sem danificar o embrião. Remover como gema tanto quanto possível.
4. Prepare 4% baixo-melt agarose em H ₂ O.
5. Lugar agarose derretida no molde de corte de plástico.
6. Use uma pinça fina para levantar um embrião injetados a partir da placa de Petri e colocar e orientar na agarose. O embrião deve ser posicionado para uma extremidade do molde.
7. Uma vez que a agarose é endurecido, use uma ferramenta de superfície plana, como uma espátula, para remover o bloco de agarose do molde.
8. Corte a extremidade inferior do bloco de agarose com uma lâmina de barbear para que ele seja mesmo.
9. Adicionar uma gota de super-cola para o palco vibratome e colocar o bloco de agarose sobre ele (o lado do bloco que foi nivelado fora com a navalha deve enfrentar a cola). Para cortar vários embriões, montar várias agarose-embedded espécimes no palco.
10. Anexar o estágio vibratome ao vibratome (Vibratome, Inc.).
11. Definir os parâmetros do vibratome (configurações comuns: velocidade-3; espessura de 50 ìm). Se o corte vários embriões, alinhar blocos de agarose no palco e assegurar que a lâmina atravessa o embrião todo, mas não por toda a largura dos blocos de agarose (de forma que as seções correspondentes ao embrião mesmo permanecerá em conjunto).
12. Despeje 1X PBS na fase vibratome.
13. Seção.
14. Uma vez que os embriões são sectioned, remova o bloco de agarose (s) a partir da fase vibratome.
15. Separe cuidadosamente cada seção cortando parte de trás do bloco de agarose (s).
16. Use uma pinça fina para selecionar seções desejado e coloque em um PBS 1X cheio de multi-prato bem (use poços diferentes para seções correspondentes aos embriões diferentes).
17. Repita para cada embrião.
18. Prosseguir com a rotulagem de anticorpos, embora as etapas 19 23, para melhorar a imagem mGFP (este passo pode não ser necessário se seções são gravadas dentro de um dia ou dois de preparação).
19. Tratar seções de 30 minutos em temperatura ambiente com solução de bloqueio em 1X PBS para bloquear ligações não específicas.
20. Seções Incubar com anticorpo primário (um coelho-GFP, Invitrogen Cat. A11122) diluído 1:200 @ na solução de bloqueio em um agitador por 5 horas em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.
21. Lavar quatro vezes (10 min, 15 min, 30 min e 60 min, cada) em 1% BSA/1X PBS / 1% de solução de DMSO.
22. Tratar seções com anticorpo secundário apropriado em solução de bloqueio por 5 horas em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.
23. Lavar quatro vezes (10 min, 15 min, 30 min e 60 min, cada) em 1% BSA/1X PBS / 1% de solução de DMSO.
24. Trate as seções com DAPI (0,1% em DAPI 50ml 1X PBS; Invitrogen Cat. D1306) por 30 minutos para corar os núcleos.
25. Lavar três vezes em 1X PBS por 5 minutos cada.
26. Montagem no slide.
27. Imagem utilizando microscopia confocal.

3. Ao vivo de imagens

1. Dechorionate vivos, embriões injetados 30 minutos antes de chegar ao estágio desejado desenvolvimento. Coloque os embriões em solução sedativos (0,01% tricaina em Meio Embryo) por 15 min.
2. Coloque uma gota de agarose 1% em uma placa de cultura 35 milímetros de vidro de fundo (Mattek; Part No. P35G-o-20-C).
3. Permitir agarose para solidificar.
4. Tubo de calor capilar mais chama para fazer 3 furos em agarose (outros objetos, como dicas micropipeta pode ser usado para fazer os furos). Garantir que não há agarose residual no fundo buraco.
5. Encha o prato de Petri com meio de embriões.
6. Use uma pipeta de vidro para colocar o embrião no buraco.
7. Em seguida, oriente o embrião usando uma pinça fina para que a área a ser trabalhada (cabeça dorsal) está em contato com o vidro.
8. Cuidadosamente a placa de Petri de transporte para o estágio do microscópio (coloque a tampa sobre a placa de Petri para evitar a evaporação).
9. Enquanto imagem, certifique-se que os embriões estão em 28,5 ° C.

4. Resultados

Descrevemos aqui uma abordagem direta às células de uma única imagem no tubo neural zebrafish usando a expressão de mosaico. Apesar da transparência óptica do embrião zebrafish, descobrimos que a visualização de células neurais é bastante reforçada em secções transversais obtidas por meio de vibratome. Estas seções são grossas (50 mm) permitindo a criação de imagens de extensão celular a partir de uma determinada célula em diferentes planos focais utilizando um microscópio confocal. Resultados utilizando esta metodologia ter sido publicado anteriormente ^2, mas as imagens representativas das células do tubo neural de um embrião WT (Figura 1) e uma N-caderina (N-cad) mutantes (Figura 2) são fornecidos. Este último revela que as células em regiões lateral da placa neural em N-cad mutantes não orientar corretamente para a linha média (Figura 2). Em contraste com esta rotulagem mosaico, a imunocoloração neuroepitélio com um marcador geral da superfície celular, tais como beta-catenina não permite a morfologia das células individuais para ser visualizada (Figura 3).

Imagem lapso de tempo de embriões vivos complementou a rotulagem mosaico de espécimes fixa, permitindo uma melhor compreensão da dinâmica celular que ocorrem durante a neurulação. Filme 1 revelaram que as células WT ativamente migrar para a linha média, estendendo saliências medialmente orientada membrana.

Figura 1. Expressão mGFP no tubo neural de um embrião zebrafish WT.

Figura 2. Expressão mGFP no tubo neural de um embrião de peixe-zebra N-caderina.

Figura 3. B-catenina coloração imuno da neuroepitélio.

Discussão

Em conclusão, as técnicas descritas aqui rotulagem permitem uma análise única célula de processos morfogenéticos no embrião do zebrafish. A ênfase principal deste protocolo é sobre os métodos de células imagem rotulada no tubo neural usando mGFP sob o controle de um promotor onipresente. Para aplicações adicionais leitores deste ensaio transiente expressão deve se referir a um artigo recente de Andersen et al. ^3.

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