Diagnóstico de Ecto e Endoparasitas em ratos de laboratório e Ratos

Resumo

Este artigo descreve vários procedimentos para ratos e camundongos de triagem para detectar endo-ou ectoparasitism. Vários ensaios de diagnóstico será demonstrado, tanto os adequados para uso de animais vivos e aqueles usados ​​após a eutanásia do animal. Fotografias para auxiliar na identificação de parasitas ratos e camundongos serão incluídos.

Resumo

Parasitas internos e externos continuam a ser uma preocupação significativa em instalações de roedores de laboratório, e instalações de pesquisa muitas porto alguns animais parasitados. Antes de embarcar em um exame de animais para parasitas, duas coisas devem ser consideradas. Um: o uso será feito das informações coletadas, e dois: que teste é o mais adequado. Sabendo que os animais são parasitados pode ser algo que a instalação aceita, mas muitas vezes há a necessidade de tratar os animais e, em seguida, para determinar a eficácia do tratamento. Parasitas podem ser detectados em animais através de várias técnicas, incluindo amostras colhidas em animais vivos ou mortos. Historicamente, os testes com maior sensibilidade diagnóstica necessária a eutanásia do animal, apesar de PCR tem permitido testes de alta sensibilidade para vários tipos de parasita. Este artigo demonstra os procedimentos para a detecção de endo e ectoparasitas em camundongos e ratos. Os mesmos procedimentos são aplicáveis ​​a outros roedores, embora as espécies de parasitas encontrados serão diferentes.

Protocolo

1. Endoparasitos exame (Tabela 1)

1. Teste de fita perianal (ver também a secção 5, estes são normalmente realizados ao mesmo tempo)

1. Retire um pedaço de clara, não fosco, fita de celofane de um distribuidor. A fita deve ser longa o suficiente para lidar por uma extremidade, sem tocar no meio (aproximadamente 5 cm). Pode ser mais fácil para dispensar vários comprimentos de uma só vez, anexando-os à beira de uma superfície de trabalho limpa e usar quando necessário.
2. Levante um rato de sua gaiola e coloque sobre a tampa da gaiola, segurando-o pelo rabo. Executar esta ação em uma câmara de fluxo laminar ou gabinete de biossegurança se o estado de saúde do animal exige.
3. Contenha o rato pela cauda, ​​levantando as patas traseiras da jaula. Segure a extremidade da fita entre o polegar eo indicador, em seguida, aplicar o meio da fita firmemente ao períneo o rato, incluindo a área perianal várias vezes. O cabelo deve ser visto para ser aderente a fita para o teste seja considerado bem sucedido.
4. Coloque a parte traseira do rato na gaiola.
5. Coloque uma gota de óleo mineral em uma lâmina de vidro escrito limpo, aplicar a fita para o slide, e depois outra gota de óleo mineral. Cubra com uma lamínula de vidro.
6. Leia a lâmina de microscópio com objetivas 10x e 40x em um microscópio de luz. O teste de fita perianal é melhor na detecção de ovos Syphacia, embora outros ovos do parasita são encontrados às vezes.

2. De flutuação fecal

1. Montar solução de flutuação, um frasco de fundo chato (frasco de pílulas ou dispositivo de flutuação fecal como Ovatector), placa de Petri, lamínula, lâmina de microscópio e aplicador / sticks mexendo. Solução de flutuação, como Fecasol, deve ter um peso específico de 1,20-1,30 e pode ser feita a partir de vários sais de sódio, açúcar, sulfato de zinco, ou adquiridos comercialmente. (Tabela 2)
2. Coletar 2-5 pelotas fecais da gaiola ou fresco do animal (s) na câmara de flotação. Se as fezes estão extremamente seco, seja devido à idade ou espécies produzindo a matéria fecal, umedecendo as fezes com 500 mL de solução salina 0,9% pode ser benéfico.
3. Coloque o frasco na placa de Petri para proteger a superfície de trabalho do excesso de fezes dissolvidas. Adicionar um pequeno volume de meio de flutuação e mash e mexa bem. Sem grandes pedaços de material deve permanecer. Continuar a adicionar médio de flutuação até formar uma menisco acima da borda do frasco.
4. Coloque a lamínula sobre o menisco e incubar à temperatura ambiente por 15 minutos. Ovos do parasita e alguns oocistos protozoário vai subir até o topo e aderir à lamínula.
5. Após a incubação, elevador e inverter a lamínula. Coloque a lamínula sobre uma lâmina de vidro.
6. Examine o slide usando os objetivos de 10x e 40x em microscópio de luz.
7. Embora de baixa tecnologia e fácil de executar, em geral, esta técnica não é recomendada para camundongos ou ratos. Como regra, é mais adequado para animais que produzem um maior volume de fezes.

3. Concentração fecal e centrifugação

1. Montar solução de flutuação, tubo de ensaio, lamínula, lâmina de microscópio e aplicador / sticks mexendo e tampas de tubo. Solução de flutuação deve ter um peso específico de 1,18-1,30 e pode ser feita a partir de vários sais de sódio, açúcar, sulfato de zinco, ou adquiridos comercialmente. (Tabela 2)
2. Coletar 10/02 pelotas fecais da gaiola ou fresco do animal (s) em um tubo de coleta. Se as fezes estão extremamente seco, seja devido à idade ou espécies produzindo a matéria fecal, umedecendo as fezes com 500 mL de solução salina 0,9% ou com a solução de flutuação que você está usando pode ser benéfica.
3. Mix de amostra em uma solução de flutuação apropriado dentro de um tubo de centrífuga de vidro. Agitação mecânica com um vortexer pode ser usado para misturar amostras. Se um vortexer é usado, snap caps devem ser colocadas nos topos do tubo para evitar derramamento e contaminação cruzada. Rotineiramente, as amostras são preparadas em 1,18 sulfato de zinco gravidade específica, no entanto outras soluções podem ser utilizadas em adição (em um tubo de preparação separada), ou em substituição.
4. Adicionar solução de flutuação adicional para cada tubo para formar um menisco ligeiramente positiva em cada tubo. Aplique uma lamínula de plástico a cada tubo, e assegurar que o contato pleno com lábio tubo é feita. Coloque o tubo (s) na centrífuga.
5. Centrifugar a aproximadamente 616-760 RCF por 10 minutos. Se lamínulas são perdidos ou quebrados durante o processo de centrifugação, uma lamínula novo pode ser colocado no tubo de amostra eo tubo pode ser levemente inclinada de modo que o menisco toca a lamínula novo. Sem centrifugação adicional é necessária.
6. Remova a tampa deslizar de tubo de centrífuga e coloque em uma lâmina de microscópio rotulada, limpar o vidro. Se as soluções centrifugação múltiplos foram utilizados para avaliar uma amostra fecal, duas lamínulas podem ser colocados no mesmo slide.
7. Mancha o slide com iodo. Isto permite uma eAsier identificação de cistos.
8. Examine o slide usando objetivas 10x e 40x em um microscópio de luz.

4. Exame direto do intestino por helmintos e protozoários

1. Posicione o mouse sacrificados ou carcaça de rato em decúbito dorsal em uma placa de dissecação limpa ou superfície de trabalho similar.
2. Utilizando uma pinça, levante a parede abdominal na área genital. Com uma tesoura, cuidadosamente inciso parede abdominal ventral da área genital para a base da caixa torácica de remover a pele e músculo e expondo os intestinos. Remova os intestinos, começando no duodeno (segmento do intestino início na saída do estômago) e continuando até o cólon descendente (o segmento do intestino, que termina no ânus e, geralmente, contém fezes formadas).
3. Intestinos lugar em uma placa de Petri 100 ml. Coletar uma porção do duodeno e ceco do animal sacrificado e coloque em um tabuleiro de dissecação. Inciso cada segmento intestinal longitudinalmente para expor a mucosa.
4. Com uma tesoura, cortou os intestinos restante em pequenos troços. Adicionar água suficiente para tocar o prato para mal submergir o tecido coletado.
5. Incubar a mistura da amostra a 35-40 ° C em um forno de laboratório ou incubadora para um mínimo de 10 minutos. Isto irá liberar e expor helmintos luminal. Enquanto a amostra é incubada, executar os passos seguintes.
6. Coloque duas gotas de soro fisiológico 0,9% lado a lado em um único slide rotulados, para permitir a preparação de amostras a partir de dois segmentos intestinais (duodeno e ceco).
7. Calor e frio esterilizar um loop inoculação ou equivalente.
8. Raspar a mucosa do duodeno e coloque o raspado no lado esquerdo do slide (lado mais próximo da borda fosco).
9. Raspar a mucosa do ceco e coloque a raspa de no lado direito do slide.
10. Top da raspados com uma lamínula. Examine slides preparados usando a objetiva de 40x em um microscópio de contraste de fase); ampliação aumentar conforme necessário para a identificação. Se os parasitas sejam detectados, identificar com base na morfologia.
11. O conteúdo prato estará pronto para exame por este ponto. Examinar o conteúdo prato sob um microscópio de dissecação. Use uma sonda ou aplicador quanto necessário para mover o conteúdo dentro do prato para concluir uma análise aprofundada. Se pinworms estão presentes eles aparecerão como pequenas, brancas, cabelo-como worms. Se tapeworms estão presentes, eles aparecerão como segmentado, worms plana (maior do que o pinworms fio-like).
12. Se helmintos são detectados ou suspeitos, coletar a amostra com um pequeno par de fórceps.
13. Monte o espécime em uma lâmina de vidro rotulados, limpos em uma gota de óleo de parafina ou mineral e coloque uma lamínula sobre a amostra. Examine o slide usando objetivas 10x e 40x em um microscópio de luz.

2. Ectoparasita exame (Tabela 3)

5. Fur colher exame de ectoparasitas (teste de fita)

1. Retire um pedaço de clara, não fosco, fita de celofane de um distribuidor. A fita deve ser longa o suficiente para lidar por uma extremidade, sem tocar no meio (aproximadamente 5 cm). Pode ser mais fácil para dispensar vários comprimentos de uma só vez, anexando-os à beira de uma superfície de trabalho limpa e usar quando necessário.
2. Levantar um mouse ou rato de sua gaiola e coloque sobre a tampa da gaiola, segurando-o pelo rabo. Executar esta ação em uma câmara de fluxo laminar ou gabinete de biossegurança se o estado de saúde do animal exige.
3. Contenha o rato ou o rato. Segure a pele com hemostats e gentilmente arrancar pêlo da região escapular do mouse, região cervical ventral, região axilar, região inguinal, e alcatra dorsal. Coloque o fur na fita. O cabelo deve ser visto para ser aderente a fita para o teste seja considerado bem sucedido. Posicione o mouse ou rato de volta em sua gaiola.
4. Coloque uma gota de óleo mineral em uma lâmina de vidro escrito limpo, aplicar a fita, em seguida, mais uma gota de óleo mineral. Cubra com uma lamínula de vidro.
5. Leia a lâmina de microscópio com objetivas 10x e 40x em microscópio de luz.
6. Este exame é melhor para detectar ácaros de pele, tais como Radfordia, Myobia e Myocoptes.

6. Raspar a pele

1. Montar os seguintes materiais: animal a ser testado, óleo mineral, lâmina de microscópio, lamínulas, bisturi e tesoura. Se este teste deve ser realizado em animais vivos, devem ser anestesiado antes de começar.
2. Amostra do dorso perto da base da cauda e região temporal da cabeça. Alternativamente, lesões de pele e / ou outros sites podem ser raspados.
3. Profundamente raspar a pele com a lâmina de bisturi no sentido oposto do crescimento do cabelo, a corroer a epiderme. Aparando o pêlo antes da raspagem pode melhorar a sensibilidade de triagem, reduzindo a obstrução visual (excesso de pêlos) naslide.
4. Coloque uma gota de óleo no slide. Aplicar a amostra para a gota de óleo limpando a lâmina (com amostra em anexo) sobre a superfície da lâmina. Adicione o óleo adicional para o slide, se necessário, e cubra com uma lamínula.
5. Leia a lâmina de microscópio com objetivas 10x e 40x em microscópio de luz.
6. A raspagem da pele é geralmente usado para detectar Demodex (e fungos dermatófitos).

7. Exame direto da pelagem

1. Posicione o mouse eutanásia ou o rato sobre o estágio de um microscópio de dissecação.
2. Examine os cabelos da pele em cerca de 10 vezes usando um aplicador ou instrumento similar a uma parte do cabelo e observar a base da haste capilar.
3. Examinar a região craniana, entre os olhos eo pinas, entre as orelhas, entre as escápulas, sob o queixo, e as áreas inguinal e axilar. Alternativamente, toda a carcaça pode ser examinada.
4. Recolher qualquer ectoparasitas ou material suspeito visto usando um pequeno par de fórceps. Ectoparasitas podem freqüentemente se parecem com caspa ou um acúmulo de cera amarela na base de um fio de cabelo ou diretamente sobre a pele.
5. Monte o espécime em uma lâmina de vidro limpa em uma gota de óleo de parafina ou mineral e coloque uma lamínula sobre a amostra. Examine o slide usando os objetivos de 10x e 40x em microscópio de luz.

3. Resultados representativos:

Ver os arquivos anexados identificar os parasitas seguinte: (Nota: esses procedimentos irão detectar qualquer ovo, helmintos, ou apresentar cisto nas fezes ou no pêlo e da pele, apenas alguns destes estão listados abaixo)

Endoparasitas:

Syphacia Muris (ovo, worm)	Chilomastix bettencourti
Syphacia obvelata (ovo, worm)	Hexamastix Muris
Aspiculuris tetraptera (ovo, worm)	Retortamonas sp.
Rodentolepis nana (ovo, worm)	Giardia spp.
Tritrichomonas Muris	Spironucleus Muris
Entamoeba Muris

Ectoparasitas:

Myocoptes musculinis	Radfordia affinis
Myocoptes musculinis	Radforida Ensifera
Myobia musculi

	Teste de fita	De flutuação fecal	FCC	Exame direto 1	PCR
Protozoários	-	+	+ +	+ + +	+ + + / NA 2
Metazoários
Pinworm	+ / - 3	+ / - 4	+ 4	+ + +	+ + +
Tênia 5	-	+	+ +	+ + +	NA
Lombrigas outros 5	-	+	+ + +	+ + +	NA

^1. Este método requer a eutanásia do animal.
^2. Não há métodos de detecção PCR atualmente disponível para todos os protozoários.
^3. Este método é mais adequado para detectar Syphacia spp.
^4. Este método será mais fácil detectar Aspiculuris, e menos provável para detectar Syphacia.
^5. Tapeworms e lombrigas que não pinworms são muito raros em ratos de laboratório moderno e ratos.

Classe tabela 1. Endoparasitos e de método de detecção adequado. Alguns métodos exigirá a eutanásia do animal. NA indica método não está actualmente disponível para estes parasitas + indica adequação do método para a detecção do parasita em questão, e -. Indica que o método não é recomendado para esse parasita.

Solução	Peso específico	Ingredientes por 1L H 2 O
Cloreto de sódio	1,20	311 g de cloreto de sódio
Nitrato de sódio	1,20	338 g nitrato de sódio
Nitrato de sódio	1,30	616 g nitrato de sódio
Açúcar	1,20	1170 g de sacarose 1
Açúcar é Sheather	1,27-1,30	1563 g de sacarose 1
Sulfato de zinco	1,18	493 g de sulfato de zinco

^1. Estas soluções necessitam de refrigeração ou adição de 9 ml de fenol como conservante.

Tabela 2. Soluções de flutuação fecal (de Smith et al.)

	Fur colher (teste de fita)	Raspar a pele 1	Exame direto 1	PCR
Piolhos	-	-	+ +	NA
Ácaros	+	+	+ + +	+ + + / NA 3
4 pulgas	-	-	+	NA
Carrapatos 4	-	-	+ +	NA

^1. Este método requer anestesia se for para ser executada em um animal vivo.
^2. Este método requer a eutanásia do animal.
^3. Não há métodos de detecção PCR atualmente disponível para cada espécie de ácaro.
^4. Pulgas e carrapatos são extremamente raros em instalações animais moderno laboratório.

Classe tabela 3. Da ectoparasita e método de detecção adequado. Alguns métodos exigirá a eutanásia do animal, e outros métodos que exigem anestesia para realizá-las em animais vivos. NA indica método não está actualmente disponível para estes parasitas. NA indica método não está actualmente disponível para estes parasitas + indica adequação do método para a detecção do parasita em questão, e -. Indica que o método não é recomendado para esse parasita.

Discussão

Quando se trabalha em um laboratório, a segurança deve ser sempre uma preocupação. Lembre-se de usar equipamento de protecção adequado quando se trabalha com animais e para limpar sua estação de trabalho com desinfectante antes e depois. Estes métodos são projetados principalmente para encontrar qualquer parasitas de roedores de laboratório nos locais analisados, ou seja, eles podem detectar parasitas exóticos ou extremamente rara, bem como o pinworms mais comuns e ácaros de pele. Embora eles são igualmente aplicáveis ​​a outras espécies, roedores silvestres podem ter parasitas adicionais em locais como subcutâneo, fígado e cérebro, não avaliados pelos métodos acima.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Tábua	Thermo Electron Corp	Cat # 36114
Tesoura pequena	ROBOZ	RS-5910, G204	Lâminas de 23 milímetros, 3,5 comprimento ", em linha reta
Tesoura médio	ROBOZ	RS-6808, G207	5 "
Pinça-Curved	ROBOZ	RS-8254 (M1/21004)	4.5 ", serrilhada, curva ligeira
Pinça-Microdissecting	ROBOZ	RS-5238	Hudson (EWALD)
Pinça-Pinça	ROBOZ	RS-8160	Dente de rato
Metal sonda	VWR	# Cat 25778-000
Hemostats	Vantagem	V97-48
Varas aplicador	Puritano	Aplicadores 6in, Ref # 807
Microscópio de dissecação	Olimpo	SZ51, Schott, ACE1
Placa de Petri	VWR	Cat, 100mm # 3401PDNL
Lamínulas	VWR	Micro tampa de vidro, Cat # 48366-067
Slides	VWR	Microscópio VistaVision Cat slides # 16004-368
Inoculação de loop	VWR	# Cat 50815-040
Microscópio de luz	Olimpo	Modelo # BX41TF
Forno de laboratório	Quincy Lab Inc.	Forno modelo Lab 10
Centrifugador	Beckman Coulter	Allegra X-12R
Vortexer	VWR	Mini-Vortexer
Tubo de ensaio	Kimble-Chase	15 tubo de centrifugação ml descartáveis, Cat # 73790-15
Lamínulas	VWR	Desliza microscópio cobertura plástica, Cat, 22mm # 48376-049
White Caps	VWR	# Cat 60869-089
Iodo	Rowley instituto de bioquímica	Cat # SO-364
Sulfato de zinco	Sigma Aldrich	Cat # 1000917519, Z4750-500G
Sacarose	Mallinckrodt Chemicals	Cat # 8360-06
Fenol	EMD	Cat # PX0510-1
Fita adesiva	Staples	Fita invisível, Cat # 504712
Óleo mineral	Mallickrodt	Cat # 6358