Diagnostic de l'ecto-et endoparasites chez les rats et les souris de laboratoire

Résumé

Cet article décrit les diverses procédures de dépistage pour les rats et les souris pour détecter l'endo-ou ectoparasites. Plusieurs tests diagnostiques seront démontrés, tant celles qui conviennent pour une utilisation sur les animaux vivants et ceux qui sont utilisés après l'euthanasie de l'animal. Photographies d'aide à l'identification des parasites chez le rat et la souris seront inclus.

Résumé

Les parasites internes et externes demeurent une préoccupation importante dans les installations de rongeurs de laboratoire et des installations de recherche de nombreux ports de certains animaux parasités. Avant d'entreprendre un examen des animaux contre les parasites, deux choses doivent être envisagées. Un: quelle utilisation sera faite des informations recueillies, et deux: le test qui est la plus appropriée. Sachant que les animaux sont parasités peut être quelque chose que l'établissement accepte, mais il est souvent nécessaire de traiter les animaux et ensuite de déterminer l'efficacité du traitement. Les parasites peuvent être détectés chez des animaux par le biais de diverses techniques, y compris les échantillons prélevés sur des animaux vivants ou euthanasiés. Historiquement, les tests avec la plus grande sensibilité de diagnostic nécessaires l'euthanasie de l'animal, bien que la PCR a permis à haute sensibilité des tests pour plusieurs types de parasites. Cet article montre des procédures pour la détection des endo-et ectoparasites chez les souris et les rats. Les mêmes procédures sont applicables à d'autres rongeurs, bien que les espèces de parasites trouvés seront différents.

Protocole

1. L'examen Endoparasite (tableau 1)

1. Test du ruban périanale (voir aussi l'article 5; elles sont généralement réalisées au même moment)

1. Retirer une longueur de clair, pas dépoli, du ruban adhésif à partir d'un distributeur. Bande doit être suffisamment long pour manipuler par un bout, sans toucher au milieu (environ 5 cm). Il peut être plus facile de passer plusieurs longueurs en une seule fois, de les attacher à la lisière d'une surface de travail propre et en utilisant au besoin.
2. Soulever une souris de sa cage et placer sur le couvercle de la cage, en le tenant par la queue. Effectuez cette action dans une hotte à flux laminaire ou enceinte de sécurité biologique si l'état de santé de l'animal l'exige.
3. Retiens la souris par la queue, en soulevant ses pattes arrière de la cage. Saisir l'extrémité du ruban entre le pouce et l'index, puis appliquez le milieu de la bande fermement pour le périnée de la souris, y compris les temps de plusieurs région périanale. Les cheveux doivent être vus pour être adhérent à la bande pour que le test soit considéré comme un succès.
4. Placez le dos de la souris dans la cage.
5. Déposer une goutte d'huile minérale sur une lame de verre propre étiquette, appliquer le ruban à la diapositive, puis une autre goutte d'huile minérale. Couvrir avec une lamelle de verre.
6. Lire la lame de microscope en utilisant les objectifs 10x et 40x sur un microscope optique. Le test du ruban périanale est préférable de détecter les œufs Syphacia, bien que les oeufs du parasite d'autres sont parfois trouvés.

2. Flottaison fécale

1. Assemblez solution de flottation, un flacon à fond plat (flacon de pilule ou de dispositif de flottaison fécale comme Ovatector), boîte de Pétri, lamelle, lame de microscope, et l'applicateur / bâtons remuant. Solution de flottaison, comme Fecasol, devraient avoir un poids spécifique de 1.20 à 1.30 et peut être fabriqué à partir de divers sels de sodium, de sucre, de sulfate de zinc, ou achetés dans le commerce. (Tableau 2)
2. Recueillir 2-5 pelotes fécales de la cage ou frais de l'animal (s) dans la chambre de flottaison. Si les selles sont extrêmement sèches, soit en raison de l'âge ou les espèces produisant les matières fécales, l'humidification des matières fécales avec 500 pi de solution saline à 0,9% peut être bénéfique.
3. Placer le flacon dans la boîte de Pétri pour protéger la surface de travail d'un débordement de selles dissoutes. Ajouter un petit volume de milieu de flottaison et de la purée et mélangez soigneusement. Pas de gros morceaux de matériau doit rester. Continuer à ajouter du milieu de flottaison jusqu'à une forme du ménisque au-dessus du bord du flacon.
4. Placer la lamelle sur le ménisque et incuber à température ambiante pendant 15 minutes. Œufs de parasites et certains oocystes de protozoaires se hisser au sommet et à adhérer à la lamelle.
5. Après incubation, ascenseur et inverser la lamelle. Placer la lamelle sur une lame de microscope en verre.
6. Examinez la lame en utilisant les objectifs 10x et 40x sous un microscope optique.
7. Bien que de faible technicité et facile à exécuter, en général, cette technique n'est pas recommandée pour les souris ou les rats. En règle générale, il est plus approprié pour les animaux qui produisent un plus grand volume de matières fécales.

3. Concentration fécale et centrifugation

1. Assemblez solution de flottation, tube de centrifugeuse, lamelle, lame de microscope, et l'applicateur / bâtons remuant et bouchons tube. Solution de flottation doit avoir une densité de 1.18 à 1.30 et peut être fabriqué à partir de divers sels de sodium, de sucre, de sulfate de zinc, ou achetés dans le commerce. (Tableau 2)
2. Recueillir 20-10 pelotes fécales de la cage ou frais de l'animal (s) dans un tube de collecte. Si les selles sont extrêmement sèches, soit en raison de l'âge ou les espèces produisant les matières fécales, l'humidification des matières fécales avec 500 pi de 0,9% saline ou avec la solution de flottation vous utilisez peut être bénéfique.
3. Mélanger l'échantillon dans une solution de flottation appropriées dans un tube à centrifuger en verre. Une agitation mécanique avec une Vortexer peut être utilisé pour mélanger les échantillons. Si un Vortexer est utilisé, douilles amortisseurs doivent être placés sur les sommets du tube pour éviter les déversements et la contamination croisée. En routine, les échantillons sont préparés dans du sulfate de 1,18 gravité de zinc spécifiques, cependant d'autres solutions peuvent être utilisées en plus (dans un tube préparation séparée) ou en substitution.
4. Ajouter la solution de flottation supplémentaires pour chaque tube pour former un ménisque légèrement positive sur chaque tube. Appliquer une lamelle de plastique pour chaque tube, et de s'assurer que plein contact avec la lèvre du tube est fait. Placer le tube (s) dans la centrifugeuse.
5. Centrifuger à environ 616-760 RCF pendant 10 minutes. Si lamelles sont perdus ou cassés pendant le processus de centrifugation, une lamelle de nouvelles peut être placé sur le tube d'échantillon et le tube peut être doucement incliné de telle sorte que le ménisque touche la lamelle nouvelle. Pas de centrifugation supplémentaire n'est nécessaire.
6. Retirer le couvercle de glissement du tube à centrifuger et placer sur une étiquette, lame de verre de microscope propre. Si des solutions multiples de centrifugation ont été utilisées pour évaluer un échantillon fécal, deux lamelles peuvent être placés sur la même lame.
7. Colorer les diapositives avec de l'iode. Cela permet d'el'identification Asier de kystes.
8. Examinez la lame en utilisant les objectifs 10x et 40x sur un microscope optique.

4. L'examen direct des intestins pour les helminthes et les protozoaires

1. Placez la souris euthanasiés ou une carcasse de rat en décubitus dorsal sur une planche de dissection propre ou surface de travail similaires.
2. En utilisant des pinces, soulever la paroi abdominale à la région génitale. Avec des ciseaux, soigneusement inciser la paroi ventrale abdominale de la zone génitale à la base de la cage thoracique enlever la peau et les muscles et en exposant les intestins. Enlever l'intestin, en commençant par le duodénum (le segment de l'intestin le début à la sortie de l'estomac) et de continuer à le côlon descendant (le segment de l'intestin qui se termine à l'anus et contient généralement les matières fécales formées).
3. Les intestins dans un plat de 100 ml de Pétri. Recueillir une partie du caecum et du duodénum de l'animal euthanasié et les placer sur une planche de dissection. Inciser chaque segment intestinal longueur d'exposer la muqueuse.
4. Avec des ciseaux, couper les intestins restantes en petites sections. Ajouter suffisamment d'eau du robinet pour le plat à peine immerger le tissu prélevé.
5. Incuber le mélange de l'échantillon à 35-40 ° C dans un four de laboratoire ou un incubateur pour un minimum de 10 minutes. Ce va libérer et exposer les helminthes luminal. Bien que l'échantillon est en incubation, effectuer les étapes suivantes.
6. Placez deux gouttes de solution saline à 0,9% côté à côte sur une seule diapositive étiquetés, pour permettre la préparation des échantillons provenant de deux segments de l'intestin (duodénum et le caecum).
7. Chaleur et froid stérilisent une anse ou équivalent.
8. Grattez la muqueuse du duodénum et le lieu des raclures sur le côté gauche de la diapositive (côté le plus proche du bord dépoli).
9. Grattez la muqueuse du cæcum et le lieu des raclures de sur le côté droit de la diapositive.
10. Haut les raclures d'une lamelle. Examinez diapositives préparés en utilisant l'objectif 40x sous un microscope à contraste de phase); agrandissement augmentera nécessaires à l'identification. Si les parasites sont détectés, identifier basée sur la morphologie.
11. Le contenu plat sera prêt pour examen par ce point. Examinez le contenu plat sous un microscope à dissection. Utiliser une sonde ou un bâton applicateur comme nécessaire pour déplacer le contenu dans le plat pour compléter un examen approfondi. Si les oxyures sont présents, ils apparaissent comme de petites, blanches, des cheveux comme des vers. Si les ténias sont présents, ils apparaissent comme segmenté, vers plats (plus grand que l'oxyurose filiformes).
12. Si les helminthes sont détectés ou suspectés, de recueillir l'échantillon en utilisant une petite paire de pinces.
13. Placer le spécimen sur une étiquette, lame de verre propre dans une goutte d'huile de paraffine ou minérale et placer une lamelle sur le dessus de l'éprouvette. Examinez la lame en utilisant les objectifs 10x et 40x sur un microscope optique.

2. L'examen des ectoparasites (tableau 3)

5. Fourrure examen pour arracher les ectoparasites (test de bande)

1. Retirer une longueur de clair, pas dépoli, du ruban adhésif à partir d'un distributeur. Bande doit être suffisamment long pour manipuler par un bout, sans toucher au milieu (environ 5 cm). Il peut être plus facile de passer plusieurs longueurs en une seule fois, de les attacher à la lisière d'une surface de travail propre et en utilisant au besoin.
2. Soulever une souris ou un rat de sa cage et placer sur le couvercle de la cage, en le tenant par la queue. Effectuez cette action dans une hotte à flux laminaire ou enceinte de sécurité biologique si l'état de santé de l'animal l'exige.
3. Retiens la souris ou le rat. Saisir la fourrure avec pinces hémostatiques et doucement arracher la fourrure de la zone scapulaire de la souris, région cervicale ventrale, région axillaire, la région inguinale, et la croupe dorsale. Placer la fourrure sur la bande. Les cheveux doivent être vus pour être adhérent à la bande pour que le test soit considéré comme un succès. Placez la souris ou le rat de retour dans sa cage.
4. Déposer une goutte d'huile minérale sur une lame de verre propre étiquette, appliquer le ruban, puis une autre goutte d'huile minérale. Couvrir avec une lamelle de verre.
5. Lire la lame de microscope en utilisant les objectifs 10x et 40x sous un microscope optique.
6. Cet examen est le meilleur pour la détection de fourrure tels que les acariens Radfordia, Myobia et Myocoptes.

6. Grattez la peau

1. Assembler les matériaux suivants: les animaux à tester, l'huile minérale, lame de microscope, lamelle, un scalpel, et des ciseaux. Si ce test est à effectuer sur les animaux vivants, ils doivent être anesthésiés avant de commencer.
2. Exemple de la face dorsale près de la base de la queue et la région temporale de la tête. Alternativement, des lésions cutanées et / ou d'autres sites peuvent être grattées.
3. Profondément gratter la peau avec la lame de bistouri dans la direction opposée de la croissance des cheveux, à éroder l'épiderme. Tailler les poils avant de gratter peut améliorer la sensibilité de dépistage en réduisant l'obstruction visuelle (excès de poils) sur lediapositive.
4. Déposer une goutte d'huile sur la diapositive. Appliquez l'échantillon à la goutte d'huile en essuyant la lame (avec l'échantillon ci-joint) sur la surface de la lame. Ajouter l'huile supplémentaire à la diapositive, si nécessaire, et garnir avec une lamelle.
5. Lire la lame de microscope en utilisant les objectifs 10x et 40x sous un microscope optique.
6. Le gratter la peau est généralement utilisé pour détecter Demodex (et champignons dermatophytes).

7. L'examen direct du pelage

1. Placez la souris ou du rat euthanasié sur la scène d'un microscope à dissection.
2. Examiner les poils de la fourrure à environ 10X en utilisant un bâton applicateur ou d'un instrument semblable à une partie des cheveux et d'observer la base de la tige du cheveu.
3. Examinez la région crânienne, entre les yeux et les pennes, entre les pennes, entre les omoplates, sous la mâchoire, et les régions inguinale et axillaire. Sinon, toute la carcasse peut être examiné.
4. Collecter toutes les ectoparasites ou de matériel suspect vu en utilisant une petite paire de pinces. Ectoparasites peut souvent ressembler à des pellicules ou une accumulation de cire jaune à la base d'un cheveu ou directement sur la peau.
5. Placer le spécimen sur une lame de verre propre dans une goutte d'huile de paraffine ou minérale et placer une lamelle sur le dessus de l'éprouvette. Examinez la lame en utilisant les objectifs 10x et 40x sous un microscope optique.

3. Les résultats représentatifs:

Voir les fichiers joints d'identifier les parasites suivants: (Remarque: ces procédures permettra de détecter les œufs, helminthes, kystes ou présents dans les selles ou sur la peau et la fourrure; seuls quelques-uns d'entre eux sont énumérés ci-dessous)

Endoparasites:

Syphacia muris (œuf, ver)	Chilomastix bettencourti
Syphacia obvelata (œuf, ver)	Hexamastix muris
Aspiculuris tetraptera (œuf, ver)	Retortamonas sp.
Rodentolepis nana (œuf, ver)	Giardia spp.
Tritrichomonas muris	Spironucleus muris
Entamoeba muris

Ectoparasites:

Myocoptes musculinis	Radfordia affinis
Myocoptes musculinis	Radforida ensifera
Myobia musculi

	Test de bande	Flottaison fécale	FCC	Examen direct 1	PCR
Les protozoaires	-	+	+ +	+ + +	+ + + / Na 2
Métazoaires
Oxyure	+ / - 3	+ / - 4	+ 4	+ + +	+ + +
Ténia 5	-	+	+ +	+ + +	NA
Ascaris Autre 5	-	+	+ + +	+ + +	NA

^1. Cette méthode requiert l'euthanasie de l'animal.
^2. Il n'ya pas de méthodes de détection par PCR actuellement disponibles pour tous les protozoaires.
^3. Cette méthode est plus appropriée pour détecter Syphacia spp.
^4. Cette méthode sera plus facile de détecter Aspiculuris, et moins susceptibles de détecter Syphacia.
^5. Ténias et ascaris autres que les oxyures sont très rares chez les souris et les rats de laboratoire modernes.

Tableau 1. Classe de endoparasite et la méthode de détection approprié. Certaines méthodes nécessitent l'euthanasie de l'animal. NA indique méthode n'est pas actuellement disponible pour ces parasites + indique l'aptitude de la méthode pour la détection du parasite en question, et -. Indique que la méthode n'est pas recommandée pour ce parasite.

Solution	Gravité spécifique	Ingrédients par 1L H 2 O
Le chlorure de sodium	1,20	311 g de chlorure de sodium
Le nitrate de sodium	1,20	338 g de nitrate de sodium
Le nitrate de sodium	1,30	616 g de nitrate de sodium
Sucre	1,20	1170 g de saccharose 1
Sheather de sucre	01/27 au 01/30	1563 g de saccharose 1
Le sulfate de zinc	1,18	493 g de sulfate de zinc

^1. Ces solutions nécessitent une réfrigération ou de l'addition de 9 ml de phénol comme conservateur.

Tableau 2. Solutions de flottation fécale (de Smith et al.)

	Fourrure arracher (test de bande)	1 gratter la peau	Examen direct 1	PCR
Poux	-	-	+ +	NA
Acariens	+	+	+ + +	+ + + / NA 3
Puces 4	-	-	+	NA
Tiques 4	-	-	+ +	NA

^1. Cette méthode nécessite une anesthésie si elle doit être effectuée sur un animal vivant.
^2. Cette méthode requiert l'euthanasie de l'animal.
^3. Il n'ya pas de méthodes de détection par PCR actuellement disponibles pour toutes les espèces d'acariens.
^4. Puces et les tiques sont extrêmement rares dans des installations modernes aux animaux de laboratoire.

Tableau 3. Classe des ectoparasites et la méthode de détection approprié. Certaines méthodes nécessitent l'euthanasie de l'animal, et d'autres méthodes d'anesthésie, il faudra les exécuter dans les animaux vivants. NA indique méthode n'est pas actuellement disponible pour ces parasites. NA indique méthode n'est pas actuellement disponible pour ces parasites + indique l'aptitude de la méthode pour la détection du parasite en question, et -. Indique que la méthode n'est pas recommandée pour ce parasite.

Discussion

Lorsque vous travaillez dans un laboratoire, la sécurité doit toujours être un sujet de préoccupation. N'oubliez pas de porter un équipement de protection lorsque vous travaillez avec des animaux et à nettoyer votre poste de travail avec un désinfectant avant et après. Ces méthodes sont principalement conçus pour trouver tous les parasites des rongeurs de laboratoire dans les endroits examinés, à savoir, ils peuvent détecter exotiques ou excessivement parasites rares ainsi que les oxyures plus communs et les acariens de la fourrure. Bien qu'ils soient également applicables à d'autres espèces, les rongeurs sauvages peuvent avoir des parasites supplémentaires dans des endroits tels que le foie, le cerveau et le tissu sous-cutané, non évalués par les méthodes ci-dessus.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Société	Le numéro de catalogue	Commentaires
Planche à découper	Thermo Electron Corp	Cat # 36114
Petits ciseaux	Roboz	RS-5910, G204	Lames de 23mm, 3,5 "de longueur, droites
Ciseaux Medium	Roboz	RS-6808, G207	5 "
Pince-courbée	Roboz	RS-8254 (M1/21004)	4.5 ", dentelé, légère courbe
Pince-Microdissecting	Roboz	RS-5238	Hudson (Ewald)
Pince-Tissue forceps	Roboz	RS-8160	Dent de rat
Métal sonde	VWR	Cat # 25778-000
Hémostatiques	Vantage	V97-48
Bâtonnets applicateurs	Puritain	Applicateurs 6po, Réf # 807
Microscope à dissection	Olympus	SZ51, Schott, ACE1
Boîte de Petri	VWR	100mm, Cat # 3401PDNL
Lamelles	VWR	Couvercle en verre Micro, Cat # 48366-067
Diapositives	VWR	Microscope VistaVision diapositives Cat # 16004-368
Inoculation en boucle	VWR	Cat # 50815-040
Microscope à lumière	Olympus	Modèle # BX41TF
Four de laboratoire	Quincy Lab Inc	Four Lab Model 10
Centrifugeuse	Beckman Coulter	Allegra X-12R
Vortexer	VWR	Mini-Vortexer
Le tube d'essai	Kimble Chase-	Tube de 15 ml centrifugeuse jetables, Cat # 73790-15
Lamelles	VWR	Plastique lamelles de microscope, 22mm, Cat # 48376-049
Blanc bouchons	VWR	Cat # 60869-089
L'iode	Rowley biochimiques Institut	Cat # SO-364
Le sulfate de zinc	Sigma-Aldrich	Cat # 1000917519, Z4750-500G
Saccharose	Produits chimiques Mallinckrodt	Cat # 8360-06
Phénol	EMD	Cat # PX0510-1
Ruban adhésif en cellophane	Staples	Ruban adhésif invisible, Cat # 504712
L'huile minérale	Mallickrodt	Cat # 6358