Диагностика экто-и эндопаразиты в лабораторных крыс и мышей

Резюме

В этой статье описываются различные процедуры для скрининга крыс и мышей для обнаружения эндо-или эктопаразитизму. Несколько диагностических тестов будет продемонстрировано, как, пригодные для использования на живых животных и те, которые используются после эвтаназии животных. Фотографии, чтобы помочь в идентификации крыс и мышей паразиты будут включены.

Аннотация

Внутренние и внешние паразиты прежнему вызывает большую обеспокоенность в лабораторных грызунах, и многие исследовательские учреждения гавани некоторых зараженных животных. Прежде чем приступать к рассмотрению животных на наличие паразитов, две вещи должны быть рассмотрены. Первый: какая польза будет сделана из собранной информации, и два: какой тест является наиболее подходящим. Зная, что у животных паразитирует может быть то, что объект принимает, но часто необходимо для лечения животных, а затем, чтобы определить эффективность лечения. Паразиты могут быть обнаружены у животных с помощью различных методов, в том числе образцов, взятых у живых или усыпляют животных. Исторически сложилось, что тесты с наибольшей диагностической чувствительности требуется эвтаназия животного, хотя ПЦР позволило высокочувствительный тестирование на несколько видов паразитов. В этой статье показано процедур выявления эндо-и эктопаразитами у мышей и крыс. Те же процедуры применимы и к другим грызунам, хотя видов паразитов обнаружили будут отличаться.

протокол

1. Endoparasite экспертизы (табл. 1)

1. Перианальные тест ленты (также см. раздел 5, эти, как правило, проводится в то же время)

1. Удалить длина понятно, не матовое, целлофан ленту с дозатором. Лента должна быть достаточно длинной, чтобы ручка на одном конце, не прикасаясь к середине (около 5 см). Это может быть легче обойтись несколькими длинами в одно время, прикрепляя их к краю чистую рабочую поверхность и использовать по мере необходимости.
2. Поднимите мыши из клетки и поместить на крышку клетки, держа ее за хвост. Выполнить эту операцию в кабинет ламинарного потока или биобезопасности кабинета, если состояние здоровья животных требует этого.
3. Сдерживайте мышь за хвост, поднимая задние лапы из клетки. Возьмитесь за конец ленты между большим и указательным пальцами, а затем применить середине ленты твердо промежности мыши, в том числе перианальной области в несколько раз. Волосы должны рассматриваться быть приверженцем лента для анализа, чтобы считаться успешным.
4. Наведите обратно в клетку.
5. Место капли нефтепродуктов на помечены чистой предметное стекло, нанесите ленту слайдов, а затем еще одну каплю минерального масла. Накрыть скольжения покровного стекла.
6. Прочитано стекло микроскопа использовании 10x и 40x целей в световой микроскоп. Перианальной тест лента лучших в обнаружении Syphacia яйца, хотя и другие яйца паразита иногда обнаруживаются.

2. Фекальные флотации

1. Соберите флотации решение, плоским дном флакона (ампулы таблетки или фекально плавсредство, таких как Ovatector), Петри, покровное стекло, стекло микроскопа, и аппликатор / помешивая палочками. Размещении решения, такие как Fecasol, должны иметь удельный вес 1.20-1.30 и могут быть изготовлены из различных солей натрия, сахар, сульфат цинка, или приобретенные на коммерческой основе. (Табл. 2)
2. Сбор 2-5 фекальные шарики из клетки или только что из животных (ы) в флотационной камере. Если кал очень сухой, либо из-за возраста или вида производства фекалиями, увлажнение фекалии с 500 мкл 0,9% физиологического раствора может быть полезным.
3. Место флакона в чашке Петри для защиты рабочей поверхности от переполнения растворенных фекалий. Добавить небольшой объем среды размещения и пюре и тщательно перемешать. Нет больших кусков материала должна оставаться. Продолжайте добавлять флотации среду до мениска формы над краем сосуда.
4. Установите крышку поскользнуться на мениске и инкубировать при комнатной температуре в течение 15 минут. Яйца паразита и некоторых простейших ооцист будет подняться на вершину и придерживаться покровным стеклом.
5. После инкубации, лифт и инвертировать покровным стеклом. Место покровным стеклом на предметное стекло микроскопа стекло.
6. Изучить слайд с помощью 10x и 40x цели под световым микроскопом.
7. Хотя высокие технологии и простоту для выполнения, в общем, этот метод не рекомендуется для мышей и крыс. Как правило, она больше подходит для животных, которые производят больший объем фекалий.

3. Фекальные концентрации и центрифугирования

1. Соберите флотации решение, центрифуги трубы, покровное стекло, стекло микроскопа, и аппликатор / помешивая палочками и труб колпачками. Флотация раствор должен иметь удельный вес 1.18-1.30 и могут быть изготовлены из различных солей натрия, сахар, сульфат цинка, или приобретенные на коммерческой основе. (Табл. 2)
2. Сбор 2-10 фекальные шарики из клетки или только что из животных (ы) в пробирку. Если кал очень сухой, либо из-за возраста или вида производства фекалиями, увлажнение фекалии с 500 мкл 0,9% физиологическим раствором или с флотации решение, которое Вы используете может быть полезным.
3. Смешайте образца в подходящее решение флотации в трубке центрифуги стекла. Механическое перемешивание с vortexer могут быть использованы для смешивания образцов. Если vortexer использовании оснастки шапки должен быть сделан на вершинах трубки для предотвращения утечек и перекрестного загрязнения. Регулярно, образцы подготовлены конкретные 1,18 сульфат цинка тяжести, однако другие решения могут быть использованы в дополнение (в отдельной трубке подготовки) или замены.
4. Добавить дополнительное решение флотации в каждую пробирку, чтобы сформировать небольшой положительный мениск на каждой трубе. Применение пластического скольжения покрытие в каждую пробирку, а также обеспечить полный контакт с трубкой губы сделаны. Место труба (ы) в центрифуге.
5. Центрифуга примерно в 616-760 RCF течение 10 минут. Если крышка скользит являются потери или поломки во время центрифугирования процесс, новые скольжения крышки могут быть размещены на образце трубы и трубки можно аккуратно наконечником, чтобы мениск касается новых скольжения покрытия. Никакого дополнительного центрифугирования необходимо.
6. Снимите крышку скольжения из центрифуги трубы и место на маркировку, чистая микроскопический слайд стекла. Если несколько решений центрифугирования были использованы для оценки один фекальных образцов, два скользит крышка могут быть размещены на одном слайде.
7. Пятно слайд с йодом. Это позволяет для электроннойАсиер идентификации кист.
8. Изучить слайд с помощью 10x и 40x целей в световой микроскоп.

4. Непосредственное исследование кишечника для гельминтов и простейших

1. Место эвтаназии мыши или крысы тушу в спинных лежачее положение на чистую борту рассечение или аналогичных рабочей поверхности.
2. Использование щипцов, поднимите брюшной стенки в области половых органов. Использование ножницы, аккуратно надрезать вентральной брюшной стенки от области половых органов до основания грудной клетки удаления кожи и мышц и подвергая кишечника. Удалить кишечника, начиная с двенадцатиперстной кишки (сегмент кишки, начиная с выхода из желудка) и продолжая нисходящей ободочной кишки (сегмент кишки, который заканчивается в анус и обычно содержит формируется кал).
3. Место кишечника в 100 мл блюдо Петри. Сбор часть слепой кишки и двенадцатиперстной кишки от эвтаназии животных и место на вскрытии борту. Надрезать каждый кишечного сегмента в длину подвергать слизистую оболочку.
4. Использование ножницы, вырезать оставшиеся кишечника на небольшие секции. Добавьте достаточно водопроводную воду, чтобы блюдо, чтобы погрузиться едва собрали ткани.
5. Инкубируйте образцы смеси при 35-40 ° С в печи лаборатории или инкубаторе в течение минимум 10 минут. Это позволит освободить и подвергать просвета гельминтов. В то время как образец инкубации, осуществлять следующие действия.
6. Место две капли 0,9% физиологического раствора бок о бок на одной помечены слайда, чтобы для подготовки образцов из двух кишечных сегментов (двенадцатиперстной кишки и слепой кишки).
7. Тепло стерилизации и охлаждения прививки цикла или его эквивалент.
8. Очистите слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки и место соскобы на левой части слайда (сторона ближе к краю матовое).
9. Очистите слизистой оболочки слепой кишки и место соскобы из на правой части слайда.
10. Топ соскобы с покровным стеклом. Изучить подготовлены слайд с помощью 40x цели под микроскопом фазового контраста), увеличение увеличения по мере необходимости для установления личности. Если паразиты обнаружены, определить на основе морфологии.
11. Блюдо содержимое будет готов к рассмотрению этой точке. Проверьте содержимое блюдо под рассекает микроскопом. Использование зонда или аппликатора, как нужно двигаться содержания на блюдо для завершения тщательного обследования. Если острицы присутствуют они будут выглядеть как небольшие, белые, похожие на волосы червей. Если ленточных червей присутствуют, они будут выглядеть как на сегменты, плоских червей (больше, чем нитевидные остриц).
12. Если глисты обнаружены или подозреваемых, сбор образцов с помощью небольшого пару щипцов.
13. Горы образца на маркировку, чистая предметное стекло в каплю масла парафином или минеральной и место покровное стекло в верхней части образца. Изучить слайд с помощью 10x и 40x целей в световой микроскоп.

2. Эктопаразитов обследование (табл. 3)

5. Мех сорвать экзамен на эктопаразитов (лента тест)

1. Удалить длина понятно, не матовое, целлофан ленту с дозатором. Лента должна быть достаточно длинной, чтобы ручка на одном конце, не прикасаясь к середине (около 5 см). Это может быть легче обойтись несколькими длинами в одно время, прикрепляя их к краю чистую рабочую поверхность и использовать по мере необходимости.
2. Поднимите мышь или крысу из клетки и поместить на крышку клетки, держа ее за хвост. Выполнить эту операцию в кабинет ламинарного потока или биобезопасности кабинета, если состояние здоровья животных требует этого.
3. Сдерживайте мышь или крысу. Возьмите мех с hemostats и аккуратно срывать меха от лопаточной области мыши, вентральной области шеи, подмышечной области, паховой области, и спинной крупу. Место мех на ленту. Волосы должны рассматриваться быть приверженцем лента для анализа, чтобы считаться успешным. Место мышь или крысу обратно в клетку.
4. Место капли нефтепродуктов на помечены чистой предметное стекло; применять ленту, а затем еще одну каплю минерального масла. Накрыть скольжения покровного стекла.
5. Прочитано стекло микроскопа использовании 10x и 40x цели под световым микроскопом.
6. Этот экзамен является лучшим для обнаружения клещей меха, такие как Radfordia, Myobia и Myocoptes.

6. Кожа скрести

1. Соберите следующие материалы: животные должны быть протестированы, минеральное масло, предметное стекло, покровное стекло, скальпель, и ножницы. Если этот тест должен быть выполнен на живых животных, они должны быть под наркозом перед началом.
2. Пример спинки у основания хвоста и височной области головы. Кроме того, повреждения кожи и / или другие сайты могут быть Царапины.
3. Будучи глубоко очистить кожу лезвие скальпеля в направлении, противоположном росту волос, разрушать эпидермиса. Обрезка шерсти до соскабливания может улучшить скрининг чувствительность за счет уменьшения визуальных помех (лишних волос) наслайда.
4. Место каплю масла на слайде. Применить образец жировой капли, протирая лезвие (с образец прилагается) на поверхности слайда. Добавить дополнительной нефти на слайд, если это необходимо, и сверху покровным стеклом.
5. Прочитано стекло микроскопа использовании 10x и 40x цели под световым микроскопом.
6. Царапать кожу, как правило, используется для обнаружения демодекс (и dermatophytic грибов).

7. Прямое изучение шерсть

1. Место эвтаназии мышь или крысу на этапе вскрытия микроскопом.
2. Изучить волосы шкуру примерно в 10 раз использовали карты аппликатором или аналогичный прибор на часть волос и наблюдать базе волос.
3. Изучить черепной части, между глазами и перьев, между перьев, между лопатками, под челюстью, и паховые и подмышечные области. Кроме того, весь каркас может быть рассмотрен.
4. Сбор любой эктопаразитами или подозрительного материала, обнаруженного при помощи небольшого пару щипцов. Эктопаразитов часто может выглядеть как перхоть или желтый восковой наращивание у основания волос или прямо на кожу.
5. Горы образца на чистом предметном стекле в капле парафинового масла или минеральные и место покровное стекло в верхней части образца. Изучить слайд с помощью 10x и 40x цели под световым микроскопом.

3. Представитель Результаты:

Смотри прикрепленные файлы выявление паразитов следующие: (Примечание: эти процедуры будут выявлять любые яйца, гельминтов, или кисты присутствуют в кале или на кожу и мех, и только немногие из них перечислены ниже)

Эндопаразиты:

Syphacia Muris (яйцо, червь)	Chilomastix bettencourti
Syphacia obvelata (яйцо, червь)	Hexamastix Muris
Aspiculuris tetraptera (яйцо, червь)	Retortamonas зр.
Rodentolepis Нана (яйцо, червь)	Giardia sрр.
Tritrichomonas Muris	Spironucleus Muris
Entamoeba Muris

Эктопаразитов:

Myocoptes musculinis	Radfordia аШшз
Myocoptes musculinis	Radforida ensifera
Myobia musculi

	Лента тест	Фекальные флотации	FCC	Прямая экзамен 1	ПЦР
Протозоа	-	+	+ +	+ + +	+ + + / NA 2
Metazoa
Острица	+ / - 3	+ / - 4	+ 4	+ + +	+ + +
Солитер 5	-	+	+ +	+ + +	Не Доступно
Другие 5 круглых червей	-	+	+ + +	+ + +	Не Доступно

^1. Этот метод требует эвтаназии животных.
^2. Есть не ПЦР методы обнаружения, в настоящее время доступны для каждого простейших.
^3. Этот метод является наиболее подходящим для обнаружения Syphacia sрр.
^4. Этот метод будет больше шансов обнаружить Aspiculuris, и меньше шансов обнаружить Syphacia.
^5. Солитеры и круглых червей, кроме остриц очень редки в современных лабораторных мышей и крыс.

Таблица 1. Класс endoparasite и соответствующий метод обнаружения. Некоторые методы требуют эвтаназии животных. Н. А. указывает метод в настоящее время недоступен для этих паразитов + означает пригодность метода для обнаружения паразита в вопрос, и -. Показывают, что метод не рекомендуется для этого паразита.

Решение	Удельный вес	Ингредиенты на 1 л Н 2 О
Хлористый натрий	1,20	311 г хлористого натрия
Нитрат натрия	1,20	338 г нитрата натрия
Нитрат натрия	1,30	616 г нитрата натрия
Сахар	1,20	1170 г сахарозы 1
Шетер на сахар	1.27-1.30	1563 г сахарозы 1
Цинковый купорос	1,18	493 г сульфата цинка

^1. Эти решения требуют охлаждения или добавлением 9 мл фенола в качестве консерванта.

Таблица 2. Фекальные решения флотации (от Смита и др.).

	Мех срывать (лента тест)	Кожа скрести 1	Прямая экзамен 1	ПЦР
Вши	-	-	+ +	Не Доступно
Клещи	+	+	+ + +	+ + + / NA 3
Блохи 4	-	-	+	Не Доступно
Клещи 4	-	-	+ +	Не Доступно

^1. Этот метод требует анестезии, если она хочет быть выполнено на живых животных.
^2. Этот метод требует эвтаназии животных.
^3. Есть не ПЦР методы обнаружения имеющихся в настоящее время для каждого вида клеща.
^4. Блохи и клещи встречаются крайне редко в современных объектов животного лаборатории.

Таблица 3. Класс эктопаразитов и соответствующий метод обнаружения. Некоторые методы требуют эвтаназии животных, а также другие методы требуют анестезии, чтобы выполнять их в живых животных. Н. А. указывает метод в настоящее время недоступен для этих паразитов. Н. А. указывает метод в настоящее время недоступен для этих паразитов + означает пригодность метода для обнаружения паразита в вопрос, и -. Показывают, что метод не рекомендуется для этого паразита.

Обсуждение

При работе в лаборатории, безопасность всегда должна быть проблемой. Не забудьте использовать соответствующее защитное оборудование при работе с животными и для очистки рабочей станции с дезинфицирующим средством до и после. Эти методы предназначены в первую очередь, чтобы найти какой-либо паразитов лабораторных грызунов в местах рассматриваются, то есть, они могут обнаружить экзотические или крайне редко паразитов, а также более общие остриц и меха клещей. Хотя они в равной степени применимы и к другим видам, дикие грызуны могут иметь дополнительные паразитов в местах, таких как печень, подкожный слой и мозг, а не оценивается выше методы.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Реагент имя	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
Обрезная доска	Thermo Electron Corp	Cat # 36114
Малый ножницы	ROBOZ	RS-5910, G204	23 мм лезвия, 3,5 "длины, прямой
Средний ножницы	ROBOZ	RS-6808, G207	5 "
Пинцет-изогнутые	ROBOZ	RS-8254 (M1/21004)	4,5 ", зубчатые, небольшой кривой
Пинцет-Microdissecting	ROBOZ	RS-5238	Хадсон-(Эвальд)
Пинцет хирургический пинцет-	ROBOZ	RS-8160	Крыса зуба
Металл зонд	VWR	Cat # 25778-000
Hemostats	Преимущество	V97-48
Аппликатор палочки	Пуританский	6in Аппликаторы, Ref # 807
Препаровальная лупа	Олимп	SZ51, Schott, ACE1
Чашка Петри	VWR	100 мм, Cat # 3401PDNL
Покровные стекла	VWR	Micro покровного стекла, Cat # 48366-067
Слайды	VWR	VistaVision предметные стекла Cat # 16004-368
Прививании петля	VWR	Cat # 50815-040
Оптический микроскоп	Олимп	Модель # BX41TF
Лаборатория печи	Куинси Вольный	Модель 10 Лаборатории духовка
Центрифуга	Beckman Coulter	Allegra X-12R
Vortexer	VWR	Мини-Vortexer
Пробирок	Кимбл-Чейз	15 мл одноразовые трубки центрифуги, Cat # 73790-15
Покровные стекла	VWR	Пластиковые крышки микроскопа скользит, 22мм, Cat # 48376-049
Белые шапки	VWR	Cat # 60869-089
Йод	Роули биохимического института	Cat # SO-364
Цинковый купорос	Sigma Aldrich	Cat # 1000917519, Z4750-500G
Сахароза	Химические вещества Mallinckrodt	Cat # 8360-06
Фенол	EMD	Cat # PX0510-1
Скотча	Скобы	Невидимый ленты, Cat # 504712
Минеральное масло	Mallickrodt	Cat # 6358