La diagnosi di Ecto-e endoparassiti in ratti e topi di laboratorio

Riepilogo

Questo articolo descrive le diverse procedure di screening per i ratti e topi per rilevare endo o ectoparassiti. Diversi test diagnostici sarà dimostrato, sia quelli adatti per l'uso su animali vivi e di quelli utilizzati dopo l'eutanasia dell'animale. Fotografie per facilitare l'identificazione dei parassiti ratto e nel topo saranno inclusi.

Abstract

Parassiti interni ed esterni rimangono una preoccupazione significativa in strutture roditori di laboratorio, e strutture di ricerca molti porto alcuni animali parassitati. Prima di iniziare l'esame degli animali per i parassiti, due cose dovrebbe essere considerato. Uno: quale uso verrà fatto delle informazioni raccolte, e due: che prova è la più appropriata. Sapendo che gli animali sono parassitati può essere qualcosa che la struttura accetta, ma vi è spesso una necessità di trattare gli animali e poi per determinare l'efficacia del trattamento. I parassiti possono essere rilevati negli animali attraverso varie tecniche, tra cui campioni prelevati da animali vivi o di eutanasia. Storicamente, i test con la massima sensibilità diagnostica necessaria l'eutanasia degli animali, anche se la PCR ha permesso ad alta sensibilità di prova per diversi tipi di parassiti. Questo articolo illustra le procedure per la rilevazione di endo-e ectoparassiti nei topi e ratti. Le stesse procedure si applicano a altri roditori, anche se le specie di parassiti trovati sarà diverso.

Protocollo

1. Endoparassiti esame (Tabella 1)

1. Nastro di prova perianale (vedi anche sezione 5, queste sono di solito eseguite nello stesso momento)

1. Rimuovere una lunghezza di chiaro, non satinato, nastro adesivo da un distributore. Nastro deve essere sufficientemente lungo da gestire da un lato senza toccare al centro (circa 5 cm). Può essere più facile fare a meno di diverse lunghezze in una sola volta, allegando a bordo di una superficie di lavoro pulita e utilizzando, se necessario.
2. Sollevare un topo dalla gabbia e posto sul coperchio della gabbia, tenendolo per la coda. Eseguire questa azione in una cappa a flusso laminare o armadio biosicurezza se lo stato di salute dell'animale lo richiede.
3. Trattenere il mouse per la coda, alzando zampe posteriori dalla gabbia. Afferrare l'estremità del nastro tra pollice e indice, quindi applicare al centro del nastro con decisione per perineo del mouse, tra cui la zona perianale parecchie volte. Capelli devono essere visto per essere aderente al nastro per il saggio da considerare di successo.
4. Posto sul retro del mouse nella gabbia.
5. Mettere una goccia di olio minerale su un vetrino di vetro etichettati pulita, applicare il nastro alla diapositiva, poi un'altra goccia di olio minerale. Coprire con un coperchio in vetro antiscivolo.
6. Leggi il vetrino da microscopio utilizzando gli obiettivi 10x e 40x su un microscopio ottico. Il test del nastro perianale è meglio a rilevare le uova Syphacia, anche se le uova di parassiti altre volte sono trovati.

2. Flottazione fecale

1. Assemblare soluzione di galleggiamento, a fondo piatto flaconcino (fiala pillola o dispositivo di galleggiamento fecale come Ovatector), Petri, vetrino, vetrino da microscopio, e applicatore / penne mescolando. Soluzione di galleggiamento, come Fecasol, dovrebbe avere un peso specifico di 1,20-1,30 e può essere fatta da vari sali di sodio, zucchero, solfato di zinco, o acquistati sul mercato. (Tabella 2)
2. Raccogliere 2-5 pellet fecali dalla gabbia o fresco di animale (s) nella camera di galleggiamento. Se le feci sono molto secche, sia a causa dell'età o di una specie producono la materia fecale, inumidendo le feci con 500 ml di soluzione salina allo 0.9% può essere utile.
3. Posizionare il flaconcino nella capsula di Petri per proteggere la superficie di lavoro da troppo pieno di feci sciolto. Aggiungere un piccolo volume di media galleggiamento e purè e mescolare accuratamente. Nessun grossi pezzi di materiale deve rimanere. Continuare ad aggiungere medio di galleggiamento fino a quando si forma un menisco sopra il bordo del flaconcino.
4. Mettere il vetrino sul menisco e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. Uova di parassiti e alcuni oocisti protozoo salirà verso l'alto e aderire al vetrino.
5. Dopo l'incubazione, ascensore e invertire la polizza di copertura. Posizionare il vetrino su un vetrino da microscopio.
6. Esaminare il vetrino con gli obiettivi 10x e 40x al microscopio ottico.
7. Anche se a bassa tecnologia e facile da eseguire, in generale, questa tecnica non è raccomandato per topi o ratti. Come regola generale, è più adatta per gli animali che producono un volume maggiore di feci.

3. Concentrazione fecale e centrifugazione

1. Assemblare soluzione di galleggiamento, provetta, vetrino, vetrino da microscopio, e applicatore / penne agitazione e tappi tubo. Soluzione di galleggiamento deve avere un peso specifico di 1,18-1,30 e può essere fatta da vari sali di sodio, zucchero, solfato di zinco, o acquistati sul mercato. (Tabella 2)
2. Raccogliere 2-10 pellet fecali dalla gabbia o fresco di animale (s) in un tubo di raccolta. Se le feci sono molto secche, sia a causa dell'età o di una specie producono la materia fecale, inumidendo le feci con 500 ml di soluzione fisiologica 0,9% o con la soluzione di galleggiamento in uso può essere utile.
3. Mescolare campione in una soluzione di galleggiamento appropriato all'interno di una provetta di vetro. Agitazione meccanica con un vortex possono essere utilizzati per miscelare campioni. Se un vortex è usato, salvapercussori deve essere collocato sulla cima del tubo per evitare la fuoriuscita e la contaminazione incrociata. Di routine, i campioni sono preparati in 1,18 solfato di zinco specifica gravità, tuttavia altre soluzioni possono essere utilizzati in aggiunta (in un tubo di preparazione separato) o in sostituzione.
4. Aggiungere la soluzione aggiuntiva di galleggiamento ad ogni provetta per formare un menisco lievemente positivo su ciascun tubo. Applicare una copertura in plastica antiscivolo per ogni tubo, e assicurarsi che il contatto pieno con labbro tubo è realizzato. Collocare il flessibile (s) nella centrifuga.
5. Centrifugare a circa 616-760 RCF per 10 minuti. Se scivola copertura vengono persi o rotti durante il processo di centrifugazione, una scivolata nuova copertina può essere collocato sul tubo campione e il tubo può essere delicatamente punta in modo che il menisco tocca il nuovo slittamento di copertura. Nessun centrifugazione supplementare è necessario.
6. Togliere il coperchio scivolare dalla provetta e posto su un etichetta, vetrino pulito microscopio. Se le soluzioni più centrifugazione sono stati utilizzati per valutare un campione fecale, due copri possono essere collocati sullo stesso vetrino.
7. Macchia la diapositiva con lo iodio. Questo consente per l'eAsier identificazione delle cisti.
8. Esaminare il vetrino con gli obiettivi 10x e 40x su un microscopio ottico.

4. Esame diretto degli intestini per elminti e protozoi

1. Posizionare il mouse eutanasia o carcassa di ratto in decubito dorsale su una tavola di dissezione pulito o superficie di lavoro simile.
2. Utilizzando pinze, sollevare la parete addominale presso l'area genitale. Utilizzando le forbici, con attenzione incidere la parete addominale ventrale dalla zona genitale alla base della gabbia toracica rimuovendo entrambe pelle e il muscolo ed esponendo l'intestino. Rimuovere l'intestino, con inizio alle duodeno (il segmento di inizio intestino all'uscita dello stomaco) e continuando il colon discendente (il segmento dell'intestino che termina l'ano e di solito contiene feci formate).
3. Intestini posto in un piatto da 100 ml di Petri. Raccogliere una porzione di intestino cieco e del duodeno dall'animale eutanasia e posto su una tavola di dissezione. Incise ogni segmento intestinale longitudinalmente per esporre la mucosa.
4. Utilizzando le forbici, tagliare l'intestino rimanente in piccole sezioni. Aggiungere abbastanza acqua di rubinetto per il piatto di immergere il tessuto appena raccolti.
5. Incubare la miscela campione a 35-40 ° C in un forno a laboratorio o incubatore per un minimo di 10 minuti. Questo libererà ed esporre elminti luminale. Mentre il campione è in incubazione, effettuare le seguenti operazioni.
6. Inserire due gocce di soluzione salina 0,9% fianco a fianco su una singola diapositiva etichettati, per consentire la preparazione dei campioni da due segmenti intestinali (duodeno e cieco).
7. Calore sterilizzare e raffreddare un ansa o equivalente.
8. Raschiare la mucosa del duodeno e posizionare la raschiatura sul lato sinistro della diapositiva (lato più vicino al bordo smerigliato).
9. Raschiare la mucosa del cieco e posizionare la raschiatura dal sul lato destro della diapositiva.
10. Inizio la raschiatura con un vetrino coprioggetti. Esaminare scorrere preparati con l'obiettivo 40x con un microscopio a contrasto di fase); ingrandimento aumentare, se necessario per l'identificazione. Se i parassiti vengono rilevati, identificare basata sulla morfologia.
11. I contenuti piatto sarà pronto per l'esame di questo punto. Esaminare il contenuto piatto sotto un microscopio da dissezione. Utilizzare una sonda o un bastone applicatore se necessario per spostare il contenuto all'interno del piatto per completare un esame approfondito. Se ossiuri sono presenti appariranno come piccoli, bianchi, capelli come vermi. Se tenie sono presenti, appariranno come segmentato, vermi piatti (più grande della filiforme ossiuri).
12. Se elminti sono accertata o sospetta, raccogliere il campione con una piccola coppia di pinze.
13. Montare il campione su un etichetta, pulito vetrino in una goccia di olio di paraffina o minerali e mettere un vetrino sulla parte superiore del campione. Esaminare il vetrino con gli obiettivi 10x e 40x su un microscopio ottico.

2. Ectoparassita esame (Tabella 3)

5. Fur cogliere esame per gli ectoparassiti (prova del nastro)

1. Rimuovere una lunghezza di chiaro, non satinato, nastro adesivo da un distributore. Nastro deve essere sufficientemente lungo da gestire da un lato senza toccare al centro (circa 5 cm). Può essere più facile fare a meno di diverse lunghezze in una sola volta, allegando a bordo di una superficie di lavoro pulita e utilizzando, se necessario.
2. Sollevare un topo o ratto dalla sua gabbia e posto sul coperchio della gabbia, tenendolo per la coda. Eseguire questa azione in una cappa a flusso laminare o armadio biosicurezza se lo stato di salute dell'animale lo richiede.
3. Trattenere il mouse o ratto. Afferrare la pelliccia con hemostats e delicatamente strappare pelo dalla zona scapolare del mouse, ventrale, regione cervicale, zona ascellare, zona inguinale, dorsale e groppa. Posizionare il pelo sul nastro. Capelli devono essere visto per essere aderente al nastro per il saggio da considerare di successo. Posizionare il mouse o indietro topo in gabbia.
4. Mettere una goccia di olio minerale su un vetrino etichettato bicchiere pulito, applicare il nastro, poi un'altra goccia di olio minerale. Coprire con un coperchio in vetro antiscivolo.
5. Leggi il vetrino da microscopio utilizzando gli obiettivi 10x e 40x al microscopio ottico.
6. Questo esame è meglio per la rilevazione di pelliccia, quali acari Radfordia, Myobia e Myocoptes.

6. Raschiare la pelle

1. Montare i seguenti materiali: animale da testare, olio minerale, vetrino da microscopio, vetrino, bisturi e forbici. Se questo test deve essere eseguito su animali vivi, devono essere anestetizzati prima di iniziare.
2. Campione del dorso vicino alla base della coda e della regione temporale della testa. In alternativa, lesioni cutanee e / o di altri siti possono essere raschiato.
3. Profondamente raschiare la pelle con il bisturi in direzione opposta alla crescita dei peli, di erodere l'epidermide. Taglio del pelo prima di raschiare può migliorare la sensibilità di screening, riducendo l'ostruzione visiva (eccesso di peli), suldiapositive.
4. Mettere una goccia di olio sul vetrino. Applicare il campione al calo del petrolio pulendo la lama (con esempio allegato) sulla superficie del vetrino. Aggiungere olio supplementare alla diapositiva, se necessario, e top con una copertura antiscivolo.
5. Leggi il vetrino da microscopio utilizzando gli obiettivi 10x e 40x al microscopio ottico.
6. Il raschiare la pelle viene generalmente usato per rilevare Demodex (dermatofiti e funghi).

7. Esame diretto del pelage

1. Posizionare il mouse eutanasia o ratto sul palcoscenico di un microscopio da dissezione.
2. Esaminare i peli della pelliccia di circa 10 volte utilizzando un bastoncino applicatore o uno strumento analogo a parte i capelli ed osservare la base del fusto del capello.
3. Esaminare il cranio, tra gli occhi e padiglioni auricolari, tra i padiglioni auricolari, tra le scapole, sotto la mandibola e le zone inguinale e ascellare. In alternativa, l'intera carcassa può essere esaminata.
4. Raccogliere qualsiasi ectoparassiti o materiali sospetti visto con una piccola coppia di pinze. Ectoparassiti può spesso apparire come forfora o un accumulo di cera gialla alla base del fusto del capello o direttamente sulla pelle.
5. Montare il campione su un vetrino pulito in una goccia di olio di paraffina o minerali e mettere un vetrino sulla parte superiore del campione. Esaminare il vetrino con gli obiettivi 10x e 40x al microscopio ottico.

3. Rappresentante dei risultati:

Vedere i file allegati identificare i parassiti seguente: (Nota: queste procedure rilevare eventuali uova, elminti, cisti o presenti nelle feci o sulla pelle e pelliccia, ma solamente alcune di queste sono elencati di seguito)

Endoparassiti:

Syphacia Muris (uovo, vite senza fine)	Chilomastix bettencourti
Syphacia obvelata (uovo, vite senza fine)	Hexamastix Muris
Aspiculuris tetraptera (uovo, vite senza fine)	Retortamonas sp.
Rodentolepis nana (uovo, vite senza fine)	Giardia spp.
Tritrichomonas Muris	Spironucleus Muris
Entamoeba Muris

Ectoparassiti:

Myocoptes musculinis	Radfordia affinis
Myocoptes musculinis	Radforida ensifera
Myobia musculi

	Nastro di prova	Flottazione fecale	FCC	Esame diretto 1	PCR
Protozoi	-	+	+ +	+ + +	+ + + / NA 2
Metazoi
Ossiuri	+ / - 3	+ / - 4	+ 4	+ + +	+ + +
Tenia 5	-	+	+ +	+ + +	NA
Ascaridi altri 5	-	+	+ + +	+ + +	NA

^1. Questo metodo richiede l'eutanasia dell'animale.
^2. Non ci sono i metodi di rilevamento PCR attualmente disponibili per ogni protozoo.
^3. Questo metodo è più appropriato per rilevare Syphacia spp.
^4. Questo metodo sarà più probabile per rilevare Aspiculuris, e meno probabilità di rilevare Syphacia.
^5. Tenie e ascaridi diversi da ossiuri sono molto rare nei topi di laboratorio moderno e ratti.

Tabella 1. Classe di endoparassiti e metodo di rilevazione adeguati. Alcuni metodi richiedono l'eutanasia dell'animale. NA indica metodo non è attualmente disponibile per questi parassiti + indica idoneità del metodo di rilevazione del parassita in questione, e -. Indica che il metodo non è consigliabile per questo parassita.

Soluzione	Peso specifico	Ingredienti per 1 litro di H 2 O
Cloruro di sodio	1,20	311 g di cloruro di sodio
Nitrato di sodio	1,20	338 g di nitrato di sodio
Nitrato di sodio	1,30	616 g di nitrato di sodio
Zucchero	1,20	1170 g saccarosio 1
Di zucchero Sheather	1,27-1,30	1563 g di saccarosio 1
Solfato di zinco	1,18	493 g di zinco solfato

^1. Queste soluzioni richiedono refrigerazione o l'aggiunta di 9 ml di fenolo come conservante.

Tabella 2. Soluzioni di flottazione fecale (da Smith et al.)

	Fur cogliere (prova del nastro)	Raschiare la pelle 1	Esame diretto 1	PCR
Pidocchi	-	-	+ +	NA
Acari	+	+	+ + +	+ + + / NA 3
Pulci 4	-	-	+	NA
Zecche 4	-	-	+ +	NA

^1. Questo metodo richiede l'anestesia se deve essere eseguito su un animale vivo.
^2. Questo metodo richiede l'eutanasia dell'animale.
^3. Non ci sono i metodi di rilevamento PCR attualmente disponibili per ogni specie di acaro.
^4. Pulci e zecche sono estremamente rare in strutture moderne animali da laboratorio.

Tabella 3. Classe di ectoparassita e metodo di rilevazione adeguati. Alcuni metodi richiedono l'eutanasia degli animali, e altri metodi richiedono l'anestesia per eseguire in animali vivi. NA indica metodo non è attualmente disponibile per questi parassiti. NA indica metodo non è attualmente disponibile per questi parassiti + indica idoneità del metodo di rilevazione del parassita in questione, e -. Indica che il metodo non è consigliabile per questo parassita.

Discussione

Quando si lavora in un laboratorio, la sicurezza deve sempre essere una preoccupazione. Ricordatevi di indossare dispositivi di protezione quando si lavora con gli animali e per ripulire la vostra postazione di lavoro con il disinfettante prima e dopo. Questi metodi sono progettati principalmente per trovare tutti i parassiti dei roditori da laboratorio nei luoghi esaminati, cioè, in grado di rilevare esotici o parassiti estremamente rari e le più comuni ossiuri ed acari pelliccia. Anche se sono applicabili anche ad altre specie, roditori selvatici possono avere parassiti aggiuntivi in ​​luoghi come il fegato, sottocute e cervello, non valutati con i metodi di cui sopra.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagente nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Tagliere	Thermo Electron Corp	Cat # 36114
Forbicine	Roboz	RS-5910, G204	Lame 23mm, 3,5 "di lunghezza, dritto
Forbici di media	Roboz	RS-6808, G207	5 "
Pinza-curvo	Roboz	RS-8254 (M1/21004)	4,5 ", seghettata, leggera curva
Pinza-Microdissecting	Roboz	RS-5238	Hudson-(EWALD)
Pinza-tessuto Pinze	Roboz	RS-8160	Rat dente
Metallo sonda	VWR	Cat # 25778-000
Hemostats	Vantaggio	V97-48
Applicatore bastoni	Puritano	Applicatori 6in, Ref # 807
Microscopio da dissezione	Olimpo	SZ51, Schott, ACE1
Scatola di Petri	VWR	100mm, Cat # 3401PDNL
Coprioggetto	VWR	Micro vetro di copertura, Cat # 48366-067
Diapositive	VWR	VistaVision microscopio diapositive Cat # 16004-368
Inoculando ciclo	VWR	Cat # 50815-040
Microscopio ottico	Olimpo	Modello # BX41TF
Laboratorio forno	Quincy Lab Inc.	Modello 10 Laboratorio Forno
Centrifuga	Beckman Coulter	Allegra X-12R
Vortex	VWR	Mini-vortex
Provetta	Kimble-Chase	15 ml di tubo di centrifuga monouso, Cat # 73790-15
Coprioggetto	VWR	Plastica microscopio copri-oggetto, 22mm, Cat # 48376-049
Cappucci bianchi	VWR	Cat # 60869-089
Iodio	Rowley biochimici istituto	Cat # SO-364
Solfato di zinco	Sigma Aldrich	Cat # 1000917519, Z4750-500G
Saccarosio	Mallinckrodt chimici	Cat # 8360-06
Fenolo	EMD	Cat # PX0510-1
Cellophane nastro	Staples	Nastro invisibile, Cat. # 504712
Olio minerale	Mallickrodt	Cat # 6358