A polido e reforçado Janela afinado crânio para longo prazo de imagens do cérebro de camundongo

Resumo

Nós apresentar um método para formar uma janela de imagem no crânio do rato que se estende por milímetro e é estável durante meses sem inflamação do cérebro. Este método é bem adequado para estudos longitudinais de fluxo de sangue, a dinâmica celular, e as células / estrutura vascular utilizando dois fotões microscopia.

Resumo

In vivo de imagem da função cortical requer acesso óptico para o cérebro sem interrupção do ambiente intracraniana. Nós apresentamos um método para formar um crânio polido e reforçado diluído (portas) janela no crânio do rato que se estende por vários milímetros de diâmetro e é estável durante meses. O crânio é diluído para 10 a 15 uM de espessura com uma mão de broca para alcançar claridade óptica, e é então revestida com cola de cianoacrilato e uma tampa de vidro para: 1) proporcionar rigidez, 2) inibir crescimento do osso e 3) reduzir a dispersão de luz a partir de irregularidades na superfície do osso. Uma vez que o crânio não seja ultrapassado, qualquer inflamação que pode afetar o processo que está sendo estudado é bastante reduzido. Profundidades de imagem de até 250 uM abaixo da superfície cortical pode ser conseguido usando dois-fotão microscopia laser scanning. Esta janela é bem adequado para estudar o fluxo sanguíneo cerebral e da função celular, tanto em preparações anestesiados e acordado. Além disso, oferece a optunidade para manipular a atividade das células usando optogenetics ou para interromper o fluxo de sangue nos vasos alvo de irradiação de fotossensibilizadores circulando.

Protocolo

1. Preparação para Cirurgia ⁱ

1. Limpe os instrumentos cirúrgicos por sonicação em uma mistura de leite Maxizyme e cirúrgica em um líquido de limpeza ultra-sônica. Autoclavar os instrumentos cirúrgicos, antes de cada experiência.
2. Assegurar que todos os reagentes necessários e descartáveis ​​estão disponíveis. Uma lista de reagentes e produtos descartáveis ​​é fornecido na Tabela 2. Reagentes e produtos descartáveis ​​que entram em contacto com o tecido exposto deve ser estéril, quando possível.
3. Induzir a anestesia. Anestésicos típicos adequados para estudos de sobrevivência estão descritos na Tabela 1. Certifique-se de plano cirúrgico de anestesia, verificando, por falta de reflexo pitada pés. A idade óptima de rato é de 3 a 6 semanas de idade. Os crânios de ratos mais jovens são mais suaves e mais difícil de fina. Ratos mais velhos têm crânios mais espessos que vai sangrar mais durante o processo de desbaste.
4. Proteger o animal numa moldura estereotáxico ^1. Uma lista de equipamento cirúrgico é fornecido na Tabela 2.
5. Manter o corpo temperatura a 37 ° C usando um gabarito sonda rectal e regulada almofada de calor.
6. Aplicar pomada oftálmica para os olhos para reter a umidade.
7. Raspar o couro cabeludo com um aparelho de barbear elétrico pequeno.
8. Limpar o couro cabeludo com Betadine, seguido por raspagem com 70% (v / v) de álcool isopropílico.
9. Se desejar, verificar que a freqüência cardíaca e respiração são dentro de uma faixa normal usando um oxímetro de pulso. Para um rato, estes números devem centro cerca de 10 e 2 Hz, respectivamente.
10. Aquecer uma aliquota de esterilizada por filtração fluido cerebral espinal artificial (ACSF) a 37 ° C (125 mM de NaCl, 10 mM de glucose, 10 mM de HEPES, 3,1 _mM de CaCl2, 1,3 _mM de MgCl2, pH 7,4) (todos os produtos químicos a partir de Sigma) ^2.

2. A montagem de uma estrutura de cabeça

1. Remover o couro cabeludo sobre toda a superfície craniana dorsal com um par de pinças e tesouras cirúrgicas. Aparar a pele lateralmente para as bordas dos músculos temporais em ambos os lados do crânio e póserior para os músculos do pescoço (Fig. 1A).
2. Usar uma lâmina de bisturi para remover o periósteo fina a partir da superfície do crânio.
3. Limpe o crânio com um algodão úmido o aplicador derrubado e secar a superfície do crânio com uma corrente de ar a partir de um pó pode. Em seguida, aplicar uma fina camada de cola de cianoacrilato para toda a superfície craniana. Deixe a cola secar completamente. Esta camada de cola é necessária para a aderência adequada do cimento dentário em passos subsequentes. A cola de cianoacrilato não precisa de ser esterilizado.
4. Anexar um conector de metal para a superfície do crânio, para longe da área da janela desejado. Para as preparações anestesiados, uma porca de pequeno pode ser fixado ao crânio com um pouco de cola de cianoacrilato, o qual pode mais tarde ser aparafusado no configuração de imagem utilizando um parafuso (Fig. 1B, 1L e 1N). Selar a parte de trás da porca com fita para garantir que a cola não entra os fios durante a fixação ao crânio. A porca ea fita devem ser esterilizados em autoclave antes da cirurgia.
5. Para as preparações de imagem acordados, anexar um conector mais rígida personalizada com dois pontos de fixação (Fig. 1M e 1N). Faça dois furos no crânio sobre o hemisfério contralateral cortical com uma broca de ½ mm broca e, em seguida, introduzir dois # 000 parafusos auto-atarrachantes. Estes parafusos vai ajudar a ancorar a cabeça para montar o crânio. Aplicam-se apenas uma volta completa do parafuso, a fim de evitar a aplicação de pressão para o córtex subjacente. Em seguida, coloque a barra transversal personalizado de metal com uma pequena bagatela de cola de cianoacrilato sobre o cerebelo. Deixe a cola de cianoacrilato para secar completamente. Este conector de metal reduz grandemente os graus de liberdade e simplifica relocalização do campo de imagem mesmo em estudos longitudinais. Uma barra transversal de largura dá amplo espaço para a colocação do eletrodo e estimulação de vibrissas. Planos detalhados para gerar a montagem de cabeça personalizado e dispositivo de fixação estão disponíveis online (sics / links.html "> http://physics.ucsd.edu/neurophysics/links.html). Os parafusos e barra transversal devem ser esterilizados em autoclave antes da cirurgia.
6. Cobrir toda a superfície craniana, excluindo a localização da janela, com uma camada de cimento dentário (Fig. 1C e 1D). Assegure-se que todas as arestas expostas da pele são cobertas por cimento. Os componentes do cimento dental não precisa de ser esterilizado.

3. A Geração de um polido e reforçado afinado crânio-Window (portas)

1. Certifique-se que as rebarbas de perfuração são nítidas e evitar a reutilização los. Usando uma baixa velocidade na broca dental, fino de 2 mm por 2 mm sobre a região do córtex somatossensorial com ½ mm rebarba. Alterne entre molhar o crânio com ACSF e depois secagem da superfície do crânio com uma ligeira corrente de ar de um espanador de gás; molhado para resfriamento e seca para o desbaste. Isto requer o desbaste através da camada esponjosa do crânio, que podem sangrar, mas pode ser controlled através de lavagem com ACSF (Fig. 1E). O crânio começa a flectir sob a pressão ligeira da broca, quando ele é de ~ 50 um, e os vasos Pial deve ser visível através do osso molhado (Fig. 1F). Neste espessura, pequenas manchas brancas no interior do osso se tornarão visíveis durante alguns segundos, imediatamente após a superfície do crânio seco é humedecida.
2. Neste ponto, o osso fina ainda mais. Use uma velocidade de perfuração, ou seja, 1000 rpm, que raspa a superfície craniana, com apenas um leve toque. Use pequenos movimentos controlados, mantendo a broca como uma caneta e só se aplica força no sentido lateral. O osso deve ser ~~~V 10 a 15 mM, na sua espessura final (Fig. 1G). Quando o osso é suficientemente fina, as manchas brancas pequenas no osso não será mais visível quando a superfície do crânio seco é humedecido.
3. Polir a região janela com pó de óxido de estanho. Anexar uma broca pré-fabricada que foi mergulhado em silicone selante aquário e comtraçadas, deixando um chicote cônico (inset, fig. 1H). O chicote de silicone deve ser preparado pelo menos um dia antes da cirurgia, e esterilizadas com 70% de isopropanol antes de usar. Colocar uma pitada de pó sobre a janela, juntamente com uma gota de ACSF (Fig. 1H). Agitar a suspensão sobre a janela de até dez minutos por tocar suavemente a ponta do chicote que se deslocam para a superfície do crânio. Lave afastado o pó de óxido de estanho completamente a partir da janela usando ACSF e secar o osso cuidadosamente com uma corrente suave de ar. Irregularidades de superfície e fragmentos de ossos aderentes deixados por perfuração nas etapas anteriores deve ser removida após o polimento (Fig. 1H e 1I). O pó de óxido de estanho não precisa de ser esterilizado.
4. Corte pedaços quadrados de nenhuma. 0 vidro de cobertura ligeiramente menor do que o tamanho da janela. Use um escriba, que gentilmente marcar separadas linhas horizontais e verticais na lamínula utilizando uma borda reta. Em seguida, coloque a lâmina de cobertura numa placa de Petri e knock o prato contra uma borda da mesa para separar as peças de vidro. A placa de petri inteira pode então ser autoclavados para assegurar a esterilidade.
5. Coloque uma tampa de vidro de tamanho adequado próxima janela a seco. Aplique uma pequena bagatela de cola de cianoacrilato sobre a janela com a ponta de um aplicador de ponta de madeira algodão quebrado, e rapidamente empurre a peça pré-cortados de tampa de vidro em cima da cola. Evite criar bolhas debaixo da tampa de vidro. Com cuidado, empurre a tampa de vidro contra a superfície do crânio, e segure por alguns segundos (Fig. 1J e 1O). Permitir que a cola seque completamente ao longo de 15 minutos. Cola de cianoacrilato em excesso pode ser removido da superfície superior da tampa de vidro com uma lâmina de bisturi depois é seca. Selar as extremidades da tampa de vidro com cimento dental e formar uma ligeiramente levantada bem a reter a água para a lente de imersão (Fig. 1K e 1O).

4. Recuperação

1. Coloque o animal em uma cirurgia quente gaiola seguinte. Monitorar oanimais periodicamente até que ele se recupera totalmente da anestesia.
2. Se a preparação se destina a sobreviver por mais do que um dia, fornecer buprenorfina (0,03 mg por roedor g) para analgesia. Nós imagem tipicamente o animal, pelo menos, um dia após o implante inicial.

5. Preparação de imagens

1. Estabilizar o animal em uma placa de montagem óptica para imagiologia, usando o quadro como um suporte para a cabeça (Fig. 1D e 1M). Um aparelho de retenção pode ser feita a partir de componentes disponíveis comercialmente a partir de optomechanical Qioptiq ou ThorLabs. A nossa chapa separada pode ser transportado entre conjuntos de imagem cirúrgicas e de dois fotões com o animal e todos os dispositivos de monitorização fisiológicas montados como uma unidade ^3.
2. Se o fluxo de sangue de imagem for desejado, injectar 0,05 mL de 5% (w / v) fluorescente-dextrano corante dissolvida em solução salina estéril, quer através da veia da cauda ou da veia infraorbital para rotular do soro do sangue (Fig. 2A e 2C para 2H ) ^4-7. Isso deve ser feito sob anestesia geral. Administração veia Infraorbital pode ser mais fácil para iniciantes, como soluções de dextrano são mais viscosos. A veia da cauda pode ser difícil localizar no escuro ratinhos coloridos, ea veia tende a colapsar após uma injecção falhou. Para imagem vasculatura com verde de emissão, usar um isotiocianato de fluoresceína dextrano. Para emissão vermelha, usar um Texas Red dextrano. Com altas dextranos de peso molecular, o corante permanecerão em circulação durante várias horas. Alternativamente, os animais com endógenos etiquetas fluorescentes podem ser visualizados directamente no comprimento de onda de excitação apropriada de dois fotões. A solução de dextrano pode ser congelada em alíquotas para utilização futura.
3. Limpe suavemente a superfície da janela com um algodão úmido o aplicador derrubado.
4. Para imagem prolongada de preparações anestesiados, injectar por via intraperitoneal de Ringer com lactato estéril da solução a um volume de 3 uL por grama a cada 2 horas para manter fluidos corporais e requisitos de energia.
5. Quando os animais de imagem no estado de vigília, limitar apoio de cabeça para apenas algumas horas em um momento de reduzir os níveis de estresse. Retornar o animal na gaiola casa entre as sessões de imagem por comida e água.

6. Os resultados representativos

Uma janela de sucesso vai permitir profundidades de imagem até 250 uM abaixo da superfície pial durante vários meses. Este método tem sido utilizada para estudar in vivo o fluxo de sangue capilar ^{4, 8,} a activação da microglia ^{8, 9,} e uma estrutura dendrítica dentro do parênquima cortical ^8. Num exemplo, usamos dois fotões de imagem para mostrar a vasculatura cortical de um rato anestesiado fluorescente proteína Thy1-amarelo (YFP), após o soro do sangue é rotulado por injecção intravenosa de Texas Red dextrano (Fig. 2A). Vasos durais muitas vezes são visíveis ligeiramente acima da superfície cortical na dura-máter (Fig. 2C, seta). Grandes arteríolas e vênulas Pial lie na superfície cortical (Fig. 2D). Ramo vasos penetrantes desta rede superfície e mergulhar no córtex, onde se ramificam em uma cama densa capilar que alimenta o tecido cortical (Fig. 2E a 2H). Arbors dendríticas de YFP profundo expressando neurônios corticais, um sinal endógeno para esta linha de mouse, podem ser visualizados simultaneamente em um segundo canal ¹⁰ (Fig. 2B a 2H). O sinal de segunda harmónica do osso foi recolhido num terceiro canal, e pode ser usado para medir a espessura do crânio diluído após a recolha de pilhas de imagens (Fig. 2A a 2C).

Corticais dinâmica vasculares são profundamente afetados pelos anestésicos ^11. Em um segundo exemplo, vamos mostrar um vídeo de vasoactivity espontânea coletados por microscopia de dois fótons de um rato habituado acordado. Oscilações vasomotores proeminentes no diâmetro do lúmen são vistos com uma arteríola pial, mas não com um vénula vizinho. Estefaixa basal de vasoactivity é diminuída com ⁴ anestesia com uretana. Para quantificar as mudanças espontâneas e evocadas no fluxo sanguíneo, usamos técnicas de exploração de linha adaptados para capturar tanto o diâmetro vascular e velocidade de células vermelhas do sangue dos vasos individuais. Detalhadas sobre recursos de imagem quantitativa do fluxo sanguíneo usando microscopia de dois fótons estão disponíveis ^{3, 12.}

Figura 1. Procedimento para uma janela Portas. (A K a) Imagens de passos seqüenciais no processo para gerar uma janela Portas. Veja o texto para instruções detalhadas. β = bregma e λ = lambda. (L) sistema de parafusos e porcas para fixar a cabeça durante o exame de preparações anestesiados. (M) Custom usinado montagem da cruzeta bar para os preparativos acordados. Neste exemplo, um conector também foi implantado para gravações electrocorticogram repetidas. (N)Diagrama esquemático mostrando a vista dorsal da cabeça e posição de montagem de vários componentes. A porca utilizada em L painel se entende como alternativa para a barra transversal usando no painel M. Dois # 000 parafusos auto-atarrachantes são adicionados com a barra transversal de montagem para maior estabilidade com os preparativos de imagem acordados. (O) Diagrama esquemático mostrando corte transversal de uma janela Portas.

Figura 2. Imagem de dois fótons de estrutura vascular e neuronal no córtex do rato. Todas as imagens foram coletadas através de uma janela portas em um rato Thy1-YFP até 2 dias após o implante de janela ^10. Projecção máxima mais de 150 uM de tecido na orientação coronal mostrando o crânio diluído em relação à vasculatura (A) e dendritos (B). O osso (azul) foi detectada através da recolha de fluorescência a segunda harmónica a 450 nm de emissão com 900 nm de excitação ^{8. A vasculatura (vermelho) foi marcado por via endovenosa 70 kDa Texas Red dextrano 6. Os campos dendríticos de neurônios (verde) são endógenos para a linha do mouse Thy1-YFP transgênico. (CH) projeções máximas acima de 50 mM de tecido na orientação horizontal em diferentes profundidades abaixo da pia. De dados é a partir da pilha mesma imagem mostrada na Painéis A e B. vasos máter pode ser visível um pouco acima da superfície cortical (seta em C).}

Abreviaturas

ACSF = fluido espinhal cerebral artificial
PORTOS = janela crânio polido e reforçado diluído
YFP = proteína amarelo fluorescente

ⁱ Assegurar que os procedimentos descritos são aprovados por seu Animal Care institucional local e usar Comitê.

Discussão

Dois fótons de imagens através de uma janela Portas exige transmissão através do osso diluído e dura-máter, que atenua a luz do laser e adiciona aberrações ópticas em profundidades maiores ^8. No entanto, apesar de este inconveniente, a profundidade de imagem até 250 um abaixo da superfície pial pode ser conseguido com 900 nm de excitação. Maiores profundidades de imagem podem, em princípio, seria possível com comprimentos de onda mais longos de excitação ^13. Uma grande vantagem des...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agente	Via de parto	Dose para mouse	Duração	Notas	Fonte	Ref Ref
Pentobarbital (Nembutal)	IP	90 ug / g	15-60 min	Estreita margem de segurança. Trabalhe até a dose adequada de anestesia lentamente. Suplemento de 10% da dose de indução, conforme necessário.	036093; Butler Schein	7
Ketamina (Ketaset) misturado com Xilazina (Anased)	IP	60 ug / g (K) 10 mg / g (X) (mistura na mesma seringa)	20-30 min	Xilazina é co-injetado como um relaxante muscular e analgésico. Suplemento apenas Cetamina menos 50% da dose de indução, conforme necessário.	(K) 010,177, (X) 033,198; Butler Schein	7
Isoflurano (Isothesia)	Inalação	4% significa a concentração alveolar (MAC) para a indução; 1-2% MAC para manutenção	4-6 h.	Fornecidas em mistura de oxigénio de 70% e 30% de óxido nitroso. Anestesia prolongada leva a retardar a recuperação.	029403; Butler Schein	26

ITEM	EMPRESA	catalogo MODELO /
Betadine	Butler Schein	6906950
Buprenorfina (Buprenex)	Butler Schein	031919
Isotiocianato de fluoresceína dextrano, 2 peso molecular MDa	Sigma	FD2000S
Álcool isopropílico	Pescador	AC42383-0010
Solução de Ringer com lactato	Butler Schein	009846;
Solução de lidocaína, 2% (v / v)	Butler Schein	002468
Salina	Butler Schein	009861
Leite cirúrgico	Butler Schein	014325
Texas Red dextrano, 70 kDa de peso molecular	Invitrogen	D1864
Maxizyme	Butler Schein	035646
Descartáveis
Carbide rebarbas, tamanho do bico 1/2 mm	Belas Ferramentas Ciência	19007-05
Cottoned aplicadores ponta	Fisher Scientific	23-400-100
Tampa de vidro, não. 0 espessura	Thomas Scientific	6661B40
Cola de cianoacrilato	ND Indústrias	31428 H04308
Espanador de gás	Newegg	N82E16848043429
Pó de cimento aderência	Dentsply	675571
Punho de cimento solvente	Dentsply	675572
Seringa de insulina, 0,3 ml de volume com 29,5 agulha de calibre	Butler Schein	018384
Porcas e parafusos para fixar a cabeça	Digikey	Nut, H723-ND; parafuso, R2-56X1/4-ND
Pomada oftálmica	Butler Schein	039886
Lâminas de bisturi	Fisher Scientific	12-460-448
Parafusos, self-tapping # 000	JI Empresa Morris	FF000CE125
Selante de Silicone para aquário	Perfecto Manufacturing	31001
Pó de óxido de estanho	Minerais Mama	EQT-TINOX
EQUIPAMENTO
Escriba de vidro	Fisher Scientific	08-675
Microscópio de dissecção	Carl Zeiss	OPMI-1 FC
Broca elétrico movido a	Foredom ou Osada	K.1020 (Foredom) ou EXL-M40 (Osada)
Navalha elétrica	Wahl	Série 8900
Fórceps, Dumont não. 55	Belas Ferramentas Ciência	11255-20
Comentários almofada térmica regulada	FHC	40-90-8 (termistor rectal, 40-90-5D-02; hcomer pad, 40-90-2-07)
Vaporizador de isoflurano	Ohmeda	IsoTec4
Oxímetro de pulso	Starr Ciências da Vida	MouseOx
Chave de fenda, em miniatura	Garret Wade	26B09.01
Estereotáxica	Kopf Instruments	Modelo 900 (com máscara de rato anestesia e não-ruptura barras de ouvido)
Tesoura cirúrgica, ponta romba	Belas Ferramentas Ciência	14078-10
Limpador ultra-sônico	Fisher Scientific	15-335-30