Monitorar os redutivas e oxidativo semi-reações de um Monooxigenase Flavin-Dependent usando stopped-flow Espectrofotometria

Resumo

Nós descrevemos o uso de um instrumento de stopped-flow a investigar as redutivas e oxidativa semi-reacções de Aspergillus fumigatus Sideróforos A (Sida), uma flavina monooxigenases dependentes. Em seguida, mostram os espectros correspondente às espécies na reacção de SIDA e calcula-se as constantes de velocidade para a sua formação.

Resumo

Aspergillus fumigatus sideróforo A (Sida) é um mono-oxigenase-FAD contendo que catalisa a hidroxilação de ornitina na biossíntese de sideróforos hidroxamato que são essenciais para a virulência (por exemplo, ferricrocin ou N ', N », N'''-triacetylfusarinine C) ^1. A reacção catalisada por Sida pode ser dividida em redutivas e oxidativa semi-reacções (Esquema 1). No redutiva semi-reacção, o FAD oxidado ligado a um Sida f, é reduzida por NADPH ^2,3. No oxidativo semi-reacção , o cofactor reduzida reage com oxigénio molecular para formar um intermediário C4a-hydroperoxyflavin, que transfere um átomo de oxigénio a ornitina. Aqui, nós descrevemos um processo para medir as taxas e detectar as diferentes formas espectrais de Sida utilizando um instrumento de stopped-flow instalado no uma caixa de luva anaeróbio. No instrumento stopped-flow, pequenos volumes de reagentes são rapidamente misturados, e depois de o fluxo é parado por the seringa de paragem (Figura 1), as alterações espectrais da solução introduzida na célula de observação são registadas ao longo do tempo. Na primeira parte do experimento, vamos mostrar como podemos usar o instrumento parou de fluxo em modo único, onde a redução anaeróbia da flavina em A Sida f por NADPH é medida diretamente. Em seguida, usamos duplas configurações de mistura onde A Sida f é primeiro anaerobicamente reduzidas por NADPH durante um período de tempo designado, em um circuito de envelhecimento e, em seguida feito reagir com oxigénio molecular na célula de observação (Figura 1). A fim de realizar esta experiência, os buffers anaeróbias são necessários porque quando somente o redutiva semi-reacção é monitorizada, qualquer oxigénio nas soluções irão reagir com o cofactor flavina reduzida e formar um intermediário C4a-hydroperoxyflavin que acabará por decair de volta para o flavina oxidada . Isso não permitiria que o usuário para medir com precisão as taxas de redução, pois não haveria volume de negócios total da enzYme. Quando o oxidante meia de reacção está a ser estudada a enzima deve ser reduzida na ausência de oxigénio de modo a que apenas os passos entre a redução e oxidação são observados. Um dos buffers utilizados no experimento é saturado de oxigênio para que possamos estudar a oxidativo semi-reação em altas concentrações de oxigênio. Estes são frequentemente os procedimentos realizados quando se estuda tanto as redutoras ou oxidativo semi-reações com flavina monooxigenases contendo. A escala de tempo dos experimentos pré-de estado estacionário realizados com o stopped-flow é milissegundos para segundos, que permitem a determinação de constantes de velocidade intrínsecos e de detecção e identificação de intermediários na reacção ^4. Os procedimentos aqui descritos podem ser aplicados a outras flavina-dependentes monooxigenases ^5,6.

Protocolo

1. Preparação do Tampão Anaerobic

1. Prepare 1 L de tampão fosfato 100 mM de potássio, pH 7,5. Verter 250 mL de tampão para um balão de 500-mL Büchner com uma barra de agitação.
2. Fechar bem o frasco com uma rolha de borracha e colocá-lo em uma placa de agitação. Ligue o tubo curto do balão a uma linha de Schlenk.
3. Degas tampão a sob vácuo durante 5 horas à temperatura ambiente com agitação. Durante este período de tempo, realizar 5 rodadas consecutivas de desgaseificação a vácuo e lavagem com argônio a cada hora.
4. Lavar o balão com argônio por 10 segundos e desligue-o da tubagem de vácuo. Colocar o balão no interior da caixa de luva.
5. Deixar o balão aberto na caixa de luva durante a noite com agitação vigorosa.

2. Remoção do oxigênio do sistema parou de fluxo

1. Prepare 1 L de acetato de sódio 0,1 M, pH 5,0. Verter 125 mL deste tampão para um balão de 250-mL Büchner e executar os passos 1,2-1,4.
2. Pesar 5mg oxidase de glicose a partir de Aspergillus niger (181,300 U / g) e 0,9 g de glicose utilizando um tubo Eppendorf de 1,5 mL e 50 mL Falcon tubo cónico, respectivamente. Coloque os dois recipientes no porta-luvas.
3. Dissolve-se a glicose oxidase e glucose em 50 mL de acetato de anaeróbio de sódio 0,1 M, pH 5,0 (concentrações finais de 18,13 U / mL e 100 mm, respectivamente). Encha as seringas reservatório com esta solução (Figura 1).
4. Certifique-se que as válvulas do motor estão no a "carga" de posição e preencher as seringas unidade (Figura 1). Gire a válvula de F para o "drive" de posição. Esvazie a seringa parar clicando no Vazio no software de controle Pro-Data. Empurre o tampão de F seringa unidade através do circuito de fluxo manualmente, aumentando a memória RAM da unidade correspondente. Repetir este passo dez vezes no total. Execute o mesmo procedimento com os outros três seringas de unidade. Espere uma hora.
5. Substituir a solução das seringas reservatório com o mesmo tampão containing glicose oxidase e glucose. Repita o passo 2.4.
6. Repetir o passo 2,5 e permitir que a solução em repouso no sistema de fluxo durante a noite.
7. Após a incubação durante a noite, repita o passo 2.5.

3. Preparação do Tampão de oxigênio saturado

1. Preparar 100 mM de tampão fosfato de potássio (pH 7,5) e deitar 50 mL para um frasco de 50 ml com uma barra de agitação. Tapar o frasco com uma rolha de Wheaton e um selo de alumínio Wheaton.
2. Colocar o frasco em gelo. Mergulhar uma agulha longa ligado a um tanque contendo 100% de oxigénio na solução. Insira outra agulha curta através da tampa do frasco como um respiradouro.
3. Solução a bolha de oxigénio a 100% durante 1 hora com agitação.
4. Primeiro, remova a agulha curta do frasco e aguarde 10 segundos antes de remover a agulha longa. Colocar o frasco fechado na caixa de luva.

4. Preparação da solução de NADPH

1. Pesar 1 mg de NADPH num tubo Eppendorf de 1,5 mL e colocar it para o porta-luvas.
2. Dissolve-se o NADPH em 300 uL de anaeróbio 100 mM de tampão fosfato de potássio, pH 7,5. Remover 30 uL desta solução a partir da caixa de luva para determinar a concentração de NADPH com um espectrofotómetro (ε _{340 nm} = 6.270 M ^-1 cm ^-1).

5. Remoção de oxigénio da solução de enzima

1. Tome 400 uL de solução de estoque de enzima a partir do congelador e descongelamento na caixa de luva. A solução-mãe da enzima (360 uM) foi previamente preparado em tampão fosfato 100 mM de potássio (pH 7,5) contendo 100 mM de NaCl, e congelados em azoto líquido.
2. Transferir a solução de enzima para um frasco de 25 mL com uma barra de agitação, limitar o frasco com uma rolha de Wheaton e um selo de alumínio Wheaton e remover a partir da caixa de luva.
3. Coloque o frasco no gelo e conectá-lo a uma linha Schlenk inserindo uma agulha através da tampa do frasco.
4. Desgaseificar a solução de enzima através da realização de 5 rodadas consecutivos dede desgaseificação a vácuo e lavagem com árgon a cada 20 minutos durante 1 hora.
5. Lave o frasco com argônio por 10 segundos e desligue-o da tubagem de vácuo. Coloque o frasco em gelo no interior do porta-luvas.

6. Redutora semi-reação: Redução Flavin Monitoramento

1. Preparar o instrumento stopped-flow e do software de controlo Pro-Dados para o modo de mistura único seguindo o protocolo do fabricante.
2. Ligue um banho de água circulante (15 ° C). Remover o oxigénio a partir da água por borbulhamento de azoto através dele durante 20 minutos. Isto impede a contaminação de oxigénio através do circuito de fluxo.
3. Manter a temperatura das seringas de unidade ea célula de observação a 15 ° C através da ligação do invólucro banho de água do stopped-flow para o banho de circulação.
4. Na janela Painel de controle do controle de matriz software Pro-Data Photodiode select, trigger externo (para ativar a parada do fluxo de operação), e Logaritescala hmic.
5. Inicie o software de visualização Pro-Data e definir o diretório onde os arquivos de dados serão armazenados.
6. Substituir a solução de reservatório seringas C e F com anaeróbio tampão fosfato 100 mM de potássio (pH 7,5). Gire o C e F válvulas para o "drive" de posição. Esvazie a seringa parada clicando Vazio no software de controle Pro-Data. Empurre o tampão de ambas as seringas a unidade através do circuito de fluxo manualmente, aumentando a unidade correspondente ram cinco vezes no total (clique em Esvaziar antes de cada movimento do carneiro).
7. A fim de assegurar que a glucose oxidase foi completamente removido a partir do circuito de fluxo, realizar o passo 6.6 quatro vezes no total.
8. Clique na linha de base no software de controle Pro-Data.
9. Misturar 100 uL de solução de estoque de enzima com 1100 uL de anaeróbio 100 mM de tampão fosfato de potássio (concentração final após a mistura no fluxo parado de 15 uM).
10. Substituir a solução de reservatório syrF Inge com a solução de enzima. Gire a válvula de F para o "drive" de posição. Esvazie a seringa parada clicando Vazio no software de controle Pro-Data. Empurre a solução de enzima a partir de F seringa unidade através do circuito de fluxo manualmente, aumentando a memória RAM da unidade correspondente. Realizar esta três vezes no total. No software de controle Pro-Data, definir o tempo de aquisição de 60 s.
11. Certifique-se que ambas as seringas unidade são preenchidos com as soluções correspondentes e carneiros da unidade estão em contato com os pistões de seringa de unidade. Vire ambas as válvulas para o "drive" e clique em Adquirir posição no software de controle Pro-dados para realizar a unidade. Repetir este passo mais duas vezes para obter os dados em triplicado. Este espectros rendimentos da forma oxidada da enzima.
12. Usando o Um valor _{nm 452} obtido a partir das unidades, determinar a concentração de enzima antes da mistura (ε _{452 nm} = 13.700 M ^-1 cm ^-1) e preparar 4 mL de uma soluçã NADPHn de 1,5 vezes mais concentrado.
13. Substituir a solução de reservatório seringa C com a solução de NADPH e vazias e de recarga da seringa paragem três vezes tal como descrito em 6,10.
14. Repita o passo 6.11. Este espectros rendimentos durante a redução da enzima.

7. Oxidativo semi-reação: Oxidação Flavin Monitoramento

1. Preparar o instrumento stopped-flow e do software de controlo Pro-Dados para o modo de mistura duas vezes seguindo o protocolo do fabricante.
2. Repita os passos 6.2-6.5.
3. Substituir a solução nas quatro seringas reservatório com anaeróbio tampão fosfato 100 mM de potássio (pH 7,5). Gire a válvula de F para o "drive" de posição. Esvazie a seringa parada clicando Vazio no software de controle Pro-Data. Empurre o tampão da seringa F unidade através do circuito de fluxo manualmente, aumentando a memória RAM da unidade correspondente. Executar este passo cinco vezes, no total, com cada unidade de seringa.
4. Execute o passo 7.3 quatro vezes em total de remover completamente o conteúdo a partir do circuito de fluxo.
5. Clique de linha de base no software de controlo Pro-Dados.
6. Misturar 200 uL de solução de estoque de enzima com 1000 uL de anaeróbio 100 mM de tampão fosfato de potássio (concentração final após a mistura no fluxo parado de 15 uM).
7. Substituir a solução de seringa reservatório A com a solução de enzima. Gire a válvula A para o "drive" de posição. Esvazie a seringa parada clicando Vazio no software de controle Pro-Data. Empurrar a solução de enzima a partir de seringa unidade A através do circuito de fluxo por manualmente elevar o carneiro unidade correspondente. Executar este passo três vezes no total. No software de controle Pro-Data, definir o tempo de atraso de 0,5 s e tempo de aquisição de 60 s.
8. Garantir que todas as seringas unidade são preenchidos com as soluções correspondentes e carneiros unidade estão em contato com os pistões de seringa de unidade. Ligue todas as válvulas para o "drive" e clique em Adquirir posição na Pro-Datum software de controlo para executar a unidade. Repetir este passo mais duas vezes para obter os dados em triplicado. Este espectros rendimentos da forma oxidada da enzima.
9. Substituir a solução de seringa reservatório B com uma solução de NADPH 1,5 vezes mais concentrada do que a solução de enzima em seringa A. Rode a válvula B para o "unidade" posição e vazio e reenchimento da seringa paragem três vezes, conforme descrito em 7.7.
10. Substituir a solução de reservatório seringa C com tampão oxigenado. Gire a válvula C para o "drive" posição vazia e encher a seringa parar três vezes como descrito em 7.7. No software de controle Pro-Data, definir o tempo de atraso e aquisição de 15 e 900 s, respectivamente.
11. Repita o passo 7.8. Este espectros rendimentos durante a reoxidação da enzima completamente reduzida.

8. Análise de Dados

1. Inicie o software do conversor Pro-Data. Clique no ícone Opções e selecione Salvar em ProDataCSV.
2. Abertoo diretório onde os arquivos de dados foram armazenados. Arraste os arquivos para a janela do conversor Pro-APL de dados. Os dados serão salvos automaticamente como arquivos no formato CSV no mesmo diretório.
3. Abra os arquivos no formato CSV usando o Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, EUA). Normalizar a linha de base dos traços de stopped-flow subtraindo a absorção correspondente a 700 nm.
4. Analisar os vestígios corrigida utilizando KaleidaGraph (Synergy Software, Reading, PA) por meio de ajuste da trama da absorvância no máximo correspondente versus tempo para a função apropriada exponencial. Como mostrado na Figura 2B, a absorvância a 452 nm foi representada graficamente como uma função do tempo, a fim de determinar a taxa de redução de flavina após a mistura da enzima e NADPH no instrumento de stopped-flow. Neste caso, o melhor ajuste dos dados foi obtida usando uma equação exponencial dupla e as taxas de 0,65 e 0,23 s ^-1 foram calculados para a primeira fase ea segunda parte da redução, respectivamente. Para determinar a taxa de formação do intermediário C4a-hydroperoxyflavin ea reoxidação depois reagir o enzima reduzida com oxigénio, foram analisados ​​os vestígios de stopped-flow a 380 e 452 nm, respectivamente (Figura 3B). Usando uma equação exponencial simples, calculou-se as taxas de 1,4 e 0,006 s ^-1 para o primeiro passo e do segundo oxidativo semi-reacção, respectivamente.

9. Os resultados representativos

Os resultados das experiências descritas nas secções anteriores mostram como o redutiva semi-reacção de A Sida f pode ser monitorizada medindo as mudanças na absorvância a 452 nm, que correspondem às alterações no estado redox da flavina. A taxa de este passo pode ser determinado pelo ajuste dos dados à equação apropriado (Figura 2; Passo 8,4). A taxa de redução obtida (0,65 s ^-1) é semelhante ao valor calculado com _kcatde estado estacionário experiências ^2, sugerindo que a redução é o passo determinante da taxa da reacção. Tirando vantagem do modo de dupla mistura do stopped-flow, a taxa de oxidação e os intermediários neste semi-reacção pode ser determinada (Figura 3; Passo 8,4). Na reacção catalisada por um Sida f, o C4a-hydroperoxyflavin é claramente detectado (λ _max de 380 nm), e da taxa de formação e de decaimento pode ser calculada. A taxa lenta do reoxidação obtido (0,006 s ^-1) indica que o C4a-hydroperoxyflavin é muito estável na ausência do ornitina.

Mecanismo Esquema 1. De A Sida f. O anel isoallozaxine do cofactor FAD é mostrado. A flavina oxidada (A) se liga a NADPH (B) e reage para formar flavina reduzida e NADP ⁺ (C). Após reação com o oxigênio molecular e ligação deornitina, o C4a-hydroperoxyflavin é formado (D). Esta é a espécie de hidroxilação. Depois de hidroxilação de ornitina, o hydroxyflavin (E) deve ser desidratado para formar a enzima oxidado. NADP ⁺ mantém ligado durante todo o ciclo catalítico e é o último produto a ser libertada (F).

Figura 1. O instrumento de stopped-flow. A) Imagem de os componentes do Fotofísica Aplicada SX20 parou-fluxo espectrofotómetro. B) Imagem da unidade de manipulação da amostra. C) Esquema do circuito de fluxo no modo de mistura de casal.

Figura 2. Redução anaeróbia de Sida com NADPH no instrumento de stopped-flow. A muda) espectrais registrados após a mistura de volumes iguais de 30 mm Sida e 45 mM NADPH. O primeiro espectro (oxidado Sida) e espectro última (totalmente reduzida SidA) é destacada em azul e vermelho, respectivamente. B) de rastreio de absorvância a 452 nm registadas como uma função do tempo.

Figura 3. Oxidação de Sida no instrumento de stopped-flow. A) mudanças espectrais registada após a mistura de volumes iguais de a Sida totalmente reduzido e tampão oxigenado. As concentrações finais foram de 15 mM Sida, 22,5 mM NADPH, oxigênio e 0,95 mM. O espectro registado no 0,034, 4,268, e 727,494 s corresponde à enzima completamente reduzido, o intermediário C4a-hydroperoxyflavin (λ _max de 380 nm), ea enzima oxidado (λ _max de 450 nm), respectivamente. B) de rastreio de absorvância a 382 nm e 452 registadas como uma função do tempo.

Discussão

Enzimas que catalisam reacções redox geralmente contêm cofactores tais como hemes e flavinas que sofrem alterações significativas de absorvância durante o ciclo catalítico. A forma oxidada do flavina apresenta absorvância máxima a ~ 360 e 450 nm, ea sua redução é tipicamente monitorizada por acompanhando a diminuição da absorvância a 450 nm ^7. Em geral, alguns intermediários transientes estão presentes, mas forma e decadência rápido demais para ser medido em espectrofotômetros regulares. Usando o Fotofísica Aplicada SX20 stopped-flow espectrofotômetro (ou instrumentos semelhantes), é possível medir as mudanças de absorbância na escala de tempo de milissegundos (tempo morto, 2 ms). Aqui estudamos as redutoras e oxidativa semi-reações da flavina monooxigenases dependentes de A Sida f, servindo como um modelo. A taxa de transferência de hidreto foi determinada pela medição da mudança de absorvância a 452 nm após a mistura da enzima com NADPH em condições anaeróbias. Subsequentemente, tendo advantagE de modo duplo de mistura do instrumento de stopped-flow, a enzima foi primeiro feito reagir com NADPH, até que a redução total foi alcançado, então o enzima reduzida-NADP ⁺ complexo foi misturado com oxigénio. Seguindo este procedimento, é possível detectar transientes intermediários flavina oxigenados e para medir as taxas de formação e decomposição. A identificação destes intermediários fornece dados experimentais sobre a natureza das espécies reagentes em catálise. No caso de A Sida f, a formação do C4a-hydroperoxyflavin (tipicamente monitorizada a 370-380 nm), que é a espécie de hidroxilação. Além disso, a medição da taxa constante de cada etapa permite a obtenção de uma informação sobre o passo determinante da taxa da reacção e ajudar a elucidar os mecanismos cinéticos e químicas da enzima.

Em geral, as abordagens semelhantes podem ser utilizados para flavoenzimas outros, ou proteínas para as quais absorvância as alterações ocorreram, tais como proteínas que contain heme, o fosfato de piridoxal-ou não-heme ^8-10. Uma limitação deste método é que grandes quantidades de enzima purificada são necessários, mas isto pode ser ultrapassada pela utilização de um sistema de expressão com rendimentos elevados. Um determina a concentração de proteína óptima para espectros de gravação usando proteína suficiente para que um sinal forte o suficiente pode ser observado, mas não demasiado de modo que a enzima não é desperdiçado. Tipicamente, a menor concentração de enzima para flavina contendo enzimas usadas em stopped-flow experiências é 6-10 iM (após mistura) e é determinada utilizando o coeficiente de extinção molar correspondente da enzima. No caso de A Sida f, a percentagem do FAD enzima ligada é 50-65% ^2. Apo-proteína é considerada como inactiva nestas experiências, porque um cofactor FAD ligado é necessária para a catálise. Outra limitação possível para este método é que se os processos em uma enzima ocorrer mais rapidamente do que 2 ms (tempo morto do stopped-flow) que não será observado, mas there são relatados onde as taxas de estratégias pode ser reduzida para superar esse problema. Um exemplo para este inclui a utilização de uma elevada concentração de NaCl na reacção de um ferredoxina-NADP ⁺ redutase ^11. A lavagem de oxigénio a partir do circuito de fluxo do stopped-flow é muitas vezes um passo complicado nesta experiência e requer uma atenção especial. A glicose oxidase de glicose sistema descrito aqui é utilizado com sucesso na maioria dos laboratórios como é um método eficaz e de baixo custo. No entanto, existem algumas desvantagens, que incluem a produção _de H2O ₂ e para algumas aplicações outras alternativas como o sistema de dioxigenase protocatecuato-protocatecuato deve ser considerada ^12. A utilização de uma caixa de luva anaeróbio torna mais fácil para assegurar condições anaeróbias, mas não é essencial. De oxigénio deve ser removido a partir do circuito de fluxo do stopped-flow como queremos a enzima de ser reduzido na ausência de oxigénio ou de reagir com o oxigénio a uma concentraçãos que especificar. Embora o stopped-flow é na caixa de luva, há oxigénio no circuito de fluxo, se utilizado buffers aeróbias em experiências anteriores. Além disso a medições de absorvância, ensaios de fluorescência e dicroísmo circular pode ser realizada na Applied Fotofísica SX20 espectrofotómetro stopped-flow com os acessórios correspondentes.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Geral Equipamentos de Laboratório	Companhia	Número de Catálogo
Bomba de vácuo	Ludibriar	-
Büchner frascos	Pescador	70340-500
Mexa bares	Pescador	14-512-129
Mexa placas	Pescador	11-100-49S
Schlenk linhas	Kontes Glass	-
Argon tanque	Airgas	AR UPC300
Tanque de nitrogênio	Airgas	NI200
Tanque de nitrogênio, grau de pureza ultra alta	Airgas	NI UHP200
Tanque de oxigênio	Airgas	OX 40
5% de hidrogênio do tanque de nitrogênio equilíbrio	Airgas	X02NI95B200H998
SX20 Stop fluxo de espectrofotômetro	AppliedPhotophysics	-
Porta-luvas	Recatado	-
Banho-maria	Brinkmann Lauda	-
Abastecimento
50 mL BD Falcon tubos	Pescador	14-432-23
15 mL BD Falcon cônico tubos	Pescador	05-527-90
1,5 mL de microcentrífuga tubos Eppendorf	Pescador	05-402-18
50 e 25 frascos de vidro mL	Pescador	06-402
Rolhas de borracha	Pescador	06-447H
Selos de alumínio	Pescador	06-406-15
Reagents
Fosfato de potássio monobásico	Pescador	AC2714080025
Fosfato de potássio dibásico	Pescador	P288-500
Acetato de sódio	Sigma	S-2889
Oxidase de glicose a partir de A. Níger	Sigma	G7141-250KU
D-Glucose	Pescador	D16-500
β NADPH-	Pescador	ICN10116783
L (+)-Ornitina cloridrato	Pescador	ICN10116783