Мониторинг восстановительной и окислительной Half-Реакции Флавин-зависимой монооксигеназной использованием Остановлено-Flow спектрофотометрии

Резюме

Мы описываем использование остановил поток инструментом для исследования и восстановительного и окислительного половины реакций Aspergillus фумигатус Сидерофора (SIDA), флавин-зависимой монооксигеназной. Затем мы показываем, спектров, соответствующих видов реакции SIDA и вычислить константы скорости их образования.

Аннотация

Aspergillus fumigatus siderophore A (SidA) is an FAD-containing monooxygenase that catalyzes the hydroxylation of ornithine in the biosynthesis of hydroxamate siderophores that are essential for virulence (e.g. ferricrocin or N',N",N'''-triacetylfusarinine C)¹. The reaction catalyzed by SidA can be divided into reductive and oxidative half-reactions (Scheme 1). In the reductive half-reaction, the oxidized FAD bound to Af SidA, is reduced by NADPH^2,3. In the oxidative half-reaction, the reduced cofactor reacts with molecular oxygen to form a C4a-hydroperoxyflavin intermediate, which transfers an oxygen atom to ornithine. Here, we describe a procedure to measure the rates and detect the different spectral forms of SidA using a stopped-flow instrument installed in an anaerobic glove box. In the stopped-flow instrument, small volumes of reactants are rapidly mixed, and after the flow is stopped by the stop syringe (Figure 1), the spectral changes of the solution placed in the observation cell are recorded over time. In the first part of the experiment, we show how we can use the stopped-flow instrument in single mode, where the anaerobic reduction of the flavin in Af SidA by NADPH is directly measured. We then use double mixing settings where Af SidA is first anaerobically reduced by NADPH for a designated period of time in an aging loop, and then reacted with molecular oxygen in the observation cell (Figure 1). In order to perform this experiment, anaerobic buffers are necessary because when only the reductive half-reaction is monitored, any oxygen in the solutions will react with the reduced flavin cofactor and form a C4a-hydroperoxyflavin intermediate that will ultimately decay back into the oxidized flavin. This would not allow the user to accurately measure rates of reduction since there would be complete turnover of the enzyme. When the oxidative half-reaction is being studied the enzyme must be reduced in the absence of oxygen so that just the steps between reduction and oxidation are observed. One of the buffers used in this experiment is oxygen saturated so that we can study the oxidative half-reaction at higher concentrations of oxygen. These are often the procedures carried out when studying either the reductive or oxidative half-reactions with flavin-containing monooxygenases. The time scale of the pre-steady-state experiments performed with the stopped-flow is milliseconds to seconds, which allow the determination of intrinsic rate constants and the detection and identification of intermediates in the reaction⁴. The procedures described here can be applied to other flavin-dependent monooxygenases.^5,6

протокол

1. Подготовка Анаэробные буфер

1. Подготовить 1 л 100 мМ калий фосфатный буфер, рН 7,5. Залить 250 мл буфера в 500-мл колбу Бюхнера с мешалкой.
2. Закройте колбу резиновой пробкой и поместить его на магнитной мешалки. Подключите короткую трубку из колбы к линии Шленка.
3. Дега буфера в вакууме в течение 5 часов при комнатной температуре при перемешивании. В течение этого периода, выполнить 5 последовательных раундов вакуумирования и продувки аргоном каждый час.
4. Промойте колбу с аргоном в течение 10 секунд и отсоединить его от вакуумного коллектора. Поместите колбу в перчаточном ящике.
5. Оставьте колбу открытых в перчаточном ящике ночью при сильном волнении.

2. Удаление кислорода из остановлен поток системы

1. Подготовить 1 л 0,1 М ацетата натрия, рН 5,0. Залить 125 мл этого буфера в 250-мл колбу Бюхнера и выполнить шаги 1.2-1.4.
2. Взвесить 5мг глюкозооксидазы из Aspergillus Нигер (181300 ед / г) и 0,9 г глюкозы помощью 1,5 мл Eppendorf трубки и 50 мл Сокол коническую трубку, соответственно. Поместите обе контейнеров в перчаточном ящике.
3. Растворите оксидаза глюкозы и глюкозы в 50 мл 0,1 М анаэробных ацетат натрия, рН 5,0 (конечная концентрация 18,13 Ед / мл и 100 мМ, соответственно). Заполните резервуар шприцы с этим решением (рис. 1).
4. Убедитесь, что привод клапанов в "нагрузку" положение и заполнить диск шприцы (рис. 1). Поверните клапан F "диск" позиции. Пустые шприцы остановки, нажав на пустой в Pro-Data управления программным обеспечением. Нажмите на буфер с диска F шприцем через циркуляционный контур вручную повышения баран соответствующий диск. Повторите этот шаг в десять раз в общей сложности. Выполните ту же процедуру с остальными тремя шприцами диска. Подождите один час.
5. Замените решение водохранилища шприцы с тем же Contai буферНин оксидазы глюкозы и глюкозы. Повторите шаг 2.4.
6. Повторите шаги 2.5 и позволяют решение стоять в проточной системе в одночасье.
7. После инкубации в течение ночи, повторите шаг 2.5.

3. Подготовка кислорода насыщенного буфер

1. Подготовить 100 мМ калий фосфатный буфер (рН 7.5) и залить 50 мл на 50 мл флакон с мешалкой. Закройте флакон с пробкой Уитон и печать Уитон алюминия.
2. Поместите пробирку на льду. Погрузитесь длинной иглы подключены к бак, содержащий 100% кислорода в растворе. Вставьте другой короткой иглой через пробку флакона как вентиляционное отверстие.
3. Bubble решение со 100% кислородом в течение 1 часа при перемешивании.
4. Сначала снимите короткой иглой из флакона и подождите 10 секунд перед удалением длинной иглой. Поместите закрытом флаконе в перчаточном ящике.

4. Приготовление раствора НАДФ

1. Взвесить 1 мг NADPH в 1,5 мл трубку Eppendorf и место, где ят в перчаточном ящике.
2. Растворите NADPH в 300 мкл 100 мМ анаэробных калий фосфатный буфер, рН 7,5. Удалить 30 мкл этого решения от перчаточного ящика для определения концентрации NADPH с помощью спектрофотометра (ε = _{340 нм} 6270 М ^-1 см ^-1).

5. Удаление кислорода из раствора фермента

1. Возьмите 400 мкл раствора фермента акции из морозильной камеры и оттепель в перчаточном ящике. Фермент маточного раствора (360 мкм) был ранее подготовлен в 100 мМ калий фосфатный буфер (рН 7,5), содержащем 100 мМ NaCl, и замораживали в жидком азоте.
2. Передача ферментного раствора в 25 мл флакон с мешалкой, крышка флакона пробкой Уитон и печать Уитон алюминия и удалить из перчаточного ящика.
3. Поместите пробирку на льду и подключите его к линии Шленка, вводя иглу через пробку флакона.
4. Дега ферментного раствора, выполнив 5 последовательных раундоввакуумирования и продувки аргоном каждые 20 минут в течение 1 часа.
5. Флеш флакон с аргоном в течение 10 секунд и отсоединить его от вакуумного коллектора. Поместите пробирку на льду внутри перчаточного ящика.

6. Восстановительное Half-реакция: сокращения мониторинга Флавин

1. Подготовка остановил поток инструмента и Pro-Data управления для одного режим смешивания после протоколу производителя.
2. Включите циркулирует водяной бане (15 ° C). Удаление кислорода из воды при пропускании через нее азота в течение 20 минут. Это предотвращает загрязнение кислорода через циркуляционный контур.
3. Поддерживайте температуру диска шприцы и наблюдения клетки при 15 ° C при подключении жилья водяной бане остановил поток циркулирующей в ванне.
4. В окне панели управления Pro-данных программное обеспечение управления выберите фотодиод Array, внешних триггеров (для активации остановил поток работы), а LogaritИККЕВ масштабе.
5. Запустите Pro-данных программы просмотра и определить каталог, в котором данные будут храниться файлы.
6. Замените решение водохранилище шприцы C и F с анаэробный 100 мМ калий фосфатный буфер (рН 7,5). Поверните C и F клапаны «драйва» позицию. Пустые шприцы остановки, нажав пустой в Pro-Data управления программным обеспечением. Нажмите на буфер с двух дисков шприцы через циркуляционный контур вручную повышения соответствующий привод баран пять раз в общей сложности (щелкните Пустые перед каждым движением барана).
7. Для того, чтобы глюкозооксидазы была полностью удалена из потока контур, выполните шаг 6,6 четыре раза в общей сложности.
8. Нажмите на базовой в Pro-Data управления программным обеспечением.
9. Смешать по 100 мкл раствора фермента акции с 1100 мкл 100 мМ анаэробных калий фосфатный буфер (конечная концентрация после смешивания в потоке остановили 15 мкм).
10. Замените решение водохранилище сырИнге F с ферментом решение. Поверните клапан F "диск" позиции. Пустые шприцы остановки, нажав пустой в Pro-Data управления программным обеспечением. Нажмите раствора фермента с диска F шприцем через циркуляционный контур вручную повышения баран соответствующий диск. Выполняйте это три раза в общей сложности. В Pro-данных программное обеспечение управления, установите время захвата до 60 с.
11. Убедитесь, что оба диска шприца заполняются соответствующие решения и стремление баранов находятся в контакте с поршнями диск шприц. Включите оба клапана на "драйв" позиции и нажмите ссылку в Pro-управления данными программного обеспечения для выполнения привода. Повторите этот шаг в два раза больше, чтобы получить данные в трех экземплярах. Это дает спектры окисленной формы фермента.
12. С помощью _{452 нм} значение, полученное из дисков, определение концентрации фермента до смешивания (ε = _{452 нм,} 13700 М ^-1 см ^-1) и подготовить 4 мл NADPH Solutioп. в 1,5 раза более концентрированный.
13. Замените решение водохранилище шприц C с NADPH решение и пустые и пополнить остановки шприц в три раза, как описано в 6.10.
14. Повторите шаг 6.11. Это дает спектров при уменьшении фермента.

7. Окислительный Half-реакции: окисление мониторинга Флавин

1. Подготовка остановил поток инструмента и Pro-Data управления для двойной режим смешивания после протоколу производителя.
2. Повторите шаги 6.2-6.5.
3. Замените решение в четыре резервуара шприцы с анаэробный 100 мМ калий фосфатный буфер (рН 7,5). Поверните клапан F "диск" позиции. Пустые остановки шприц, нажав пустой в Pro-Data управления программным обеспечением. Нажмите на буфер с диска F шприцем через циркуляционный контур вручную повышения баран соответствующий диск. Выполните этот шаг пять раз в общей сложности с каждого диска шприц.
4. Выполните шаг 7,3 четыре раза малышдр., чтобы полностью удалить содержимое из потока цепи.
5. Нажмите базового уровня в Pro-Data управления программным обеспечением.
6. Смешать 200 мкл раствора фермента акции с 1000 мкл 100 мМ анаэробных калий фосфатный буфер (конечная концентрация после смешивания в потоке остановили 15 мкм).
7. Замените решение водохранилище шприц с ферментом решение. Поверните клапан "диск" позиции. Пустые шприцы остановки, нажав пустой в Pro-Data управления программным обеспечением. Нажмите раствора фермента с диска шприца через циркуляционный контур вручную повышения баран соответствующий диск. Выполните это действие три раза в общей сложности. В Pro-управления данными программного обеспечения, установки времени задержки до 0,5 с и время сбора данных до 60 с.
8. Убедитесь, что все шприцы диска заполнены соответствующие решения и стремление баранов находятся в контакте с поршнями диск шприц. Включите все клапаны на "драйв" позиции и нажмите приобрести в Pro-Датуправление программным обеспечением для выполнения диске. Повторите этот шаг еще два раза для получения данных в трех экземплярах. Это дает спектры окисленной формы фермента.
9. Замените решение водохранилище шприц B с решением NADPH в 1,5 раза более концентрированной, чем ферментного раствора в шприце А. Включите B клапан на "драйв" и пустой позиции и пополнить остановки шприц в три раза, как описано в 7.7.
10. Замените решение водохранилище шприц C с кислородом буфера. Поверните клапан C в "драйв" и пустой позиции и пополнить остановки шприц в три раза, как описано в 7.7. В Pro-управления данными программного обеспечения, установка задержки и время сбора в 15 и 900 с соответственно.
11. Повторите шаг 7.8. Это дает спектр в реокисление полностью восстановленном фермента.

8. Анализ данных

1. Запустите Pro-данных конвертер программного обеспечения. Нажмите на иконку Опции и выберите Сохранить в ProDataCSV.
2. ОткрытоКаталог, в котором данные файлы были сохранены. Перетащите файлы в APL Pro-Data Converter окна. Эти данные будут автоматически сохранены как файлы формата CSV в том же каталоге.
3. Откройте формате CSV файлов с помощью Microsoft Excel (Microsoft, Редмонд, штат Вашингтон, США). Нормализация базовой остановил поток следы путем вычитания соответствующих поглощению при 700 нм.
4. Анализ следов использования исправлены KaleidaGraph (Synergy Software, Reading, PA) путем установки сюжет поглощения в соответствующей максимальной в зависимости от времени к соответствующим экспоненциальной функцией. Как показано на Рисунке 2Б, поглощение при 452 нм была построена в зависимости от времени для того, чтобы определить скорость восстановления флавин после смешивания ферментов и NADPH в остановили поток инструмента. В этом случае лучше всего подходят данных был получен с помощью двойного показательного уравнения и ставки 0,65 и 0,23 с ^-1 были рассчитаны для первого и второго этапа сокращения, разрешенияpectively. Для определения скорости образования C4a-hydroperoxyflavin промежуточных и после повторного окисления реагируют снижением ферментов с кислородом, мы проанализировали остановил поток следы на 380 и 452 нм соответственно (рис. 3В). Использование одного показательного уравнения, мы рассчитали ставки на 1,4 и 0,006 с ^-1 для первой и второй этап окислительного полуреакцией соответственно.

9. Представитель Результаты

Результаты экспериментов, описанных в предыдущем разделе показано, как восстановительное половина реакции е Сида можно контролировать путем измерения изменений оптической плотности при 452 нм, что соответствует изменениям в окислительно-восстановительное состояние флавина. Скорость этого шага может быть определена путем подгонки данных в соответствующие уравнения (рис. 2, шаг 8.4). Снижение скорости получены (0,65 с ^-1) аналогична значению к _кошке рассчитывается сстационарных экспериментов ^2, предполагая, что снижение лимитирующей стадии реакции. Воспользовавшись двойной режим смешивания на остановленном потоке, скорость окисления и промежуточные в этой половине реакция может быть определена (рис. 3, шаг 8.4). В реакции, катализируемой е SIDA, C4a-hydroperoxyflavin явно обнаруживается (λ _макс 380 нм), и скорость образования и распада может быть вычислена. Медленные темпы реокисление получил (0,006 с ^-1) означает, что C4a-hydroperoxyflavin очень стабильна в отсутствие орнитина.

Схема 1. Механизм е SIDA. Isoallozaxine кольцо FAD кофактора показано. Окисленных флавин () связывается с NADPH (B) и реагирует на формирование уменьшить флавин и НАДФ ⁺ (C). После реакции с молекулярным кислородом и связываниеорнитин, C4a-hydroperoxyflavin формируется (D). Это hydroxylating видов. После гидроксилирования орнитин, hydroxyflavin (E) должны быть обезвоженной формирования окисленного фермента. НАДФ ⁺ остается связанным всей каталитического цикла и последний продукт, который будет выпущен (F).

Рисунок 1. Остановить поток инструмента. А) Изображение компонентов прикладной Фотофизика SX20 остановил поток спектрофотометр. Б) Изображение агрегата образца. C) Схема потока цепи в двойной режим смешивания.

Рисунок 2. Анаэробные снижение SIDA с NADPH в остановили поток инструмента. А) спектральных изменений записанный после смешивания равных объемов 30 мкМ SIDA и 45 мкмоль NADPH. Первый спектр (окисленный SIDA) и последний спектра (полностью восстановленном SidА) выделяется синим и красным соответственно. Б) поглощение следов на 452 нм записан как функция времени.

Рисунок 3. Окисление SIDA в остановили поток инструмента. А) спектральных изменений записанный после смешивания равных объемов полностью восстановленном SIDA и кислородом буфера. Конечной концентрации 15 мкМ было SIDA, 22,5 мкмоль NADPH и 0,95 ммоль кислорода. Спектр зарегистрированных в 0,034, 4,268 и 727,494 с соответствует полностью восстановленном фермент, C4a-hydroperoxyflavin промежуточных (λ _макс 380 нм) и окисленного фермента (λ _макс 450 нм), соответственно. Б) поглощение следов при 382 и 452 нм записывается как функция времени.

Обсуждение

Ферменты, которые катализируют окислительно-восстановительных реакций обычно содержат кофакторов, таких как гема и флавинов, которые подвергаются значительным изменениям абсорбции в ходе каталитического цикла. Окисленной формы флавин представляет поглощение максимума при ~ 360 и 450 нм, а его сокращение, как правило, контролируются после поглощения снижения при 450 нм ^7. В общем, некоторые промежуточные переходные присутствуют, но форма и распад слишком быстро, чтобы быть измерена в обычных спектрофотометров. Использование прикладного Фотофизика SX20 остановил поток спектрофотометр (или аналогичные инструменты), то можно измерить абсорбцию изменения в масштабе времени миллисекунды (мертвое время, 2 мс). Здесь мы изучали восстановительного и окислительного половина реакции флавин-зависимой монооксигеназной е SIDA, выступающей в качестве модели. Скорость передачи гидрид было определено путем измерения изменения поглощения при 452 нм после смешивания ферментов с NADPH в анаэробных условиях. Впоследствии, принимая advantagе двойного смешивания режим остановил поток инструмент, фермент впервые взаимодействует с NADPH, до полного снижение было достигнуто, то снижение фермент НАДФ ⁺ комплекс в смеси с кислородом. После этой процедуры, можно обнаружить переходные кислородом промежуточных флавин и измерять скорости образования и распада. Идентификация этих промежуточных обеспечивает экспериментальные данные о природе реагирующих частиц в катализе. В случае е SIDA, формирование C4a-hydroperoxyflavin (как правило, контролируется на 370-380 нм), который является hydroxylating видов. Кроме того, измерения константы скорости каждым шагом позволяет получить информацию о лимитирующей стадии реакции и помочь выяснить кинетических и химических механизмов фермента.

В целом, аналогичные подходы могут быть использованы для других flavoenzymes, или белки, для которых поглощение произошли изменения, такие как белки, продолжениеАйн гема, пиридоксаль-фосфат, или негемового железа ^8-10. Ограничение этого метода является то, что большое количество очищенных ферментов не требуется, но это можно преодолеть с помощью выражения системы с высокой урожайностью. Один определяет оптимальную концентрацию белка для регистрации спектров с помощью достаточно белка, так что достаточно сильный сигнал можно наблюдать, но не слишком много, так что фермент не зря. Как правило, самые низкие концентрации ферментов для флавин-содержащих ферментов, используемых в остановили поток экспериментов 6-10 мкм (после смешивания) и определяется с помощью соответствующего молярный коэффициент погашения фермента. В случае е SIDA, доля фермента связаны FAD является 50-65% ^2. Апо-белков считается неактивным в этих экспериментах, так как связанные кофактора FAD необходимо для катализа. Другим возможным ограничением этого метода является то, если процессы в фермента происходит быстрее, чем 2 мс (мертвое время остановить поток), они не будут соблюдаться, но япрежде чем сообщается стратегии, где ставки могут быть снижены для преодоления этой проблемы. Одним из примеров этого включает в себя использование высоких концентраций NaCl в реакции ферредоксин-НАДФ ^{+-редуктазы 11.} Очистка кислорода из потока цепи остановился поток часто является хитрый шаг в этом эксперименте и требует особого внимания. Глюкозооксидазы глюкозы система, описываемая здесь успешно используется в большинстве лабораторий, как это эффективный и недорогой метод. Тем не менее, есть некоторые недостатки, которые включают производство H ₂ O _2, а для некоторых приложений других вариантов, как protocatechuate dioxygenase-protocatechuate система должна рассматриваться ^12. Использование анаэробных перчаточный ящик позволяет легко обеспечить анаэробные условия, но не является существенным. Кислород должен быть удален из потока цепи остановил поток, как мы хотим, чтобы фермент должны быть сокращены в отсутствие кислорода или вступать в реакцию с кислородом в концентрациис, что мы указываем. Несмотря на то, остановил поток находится в перчаточном ящике, есть кислород в циркуляционный контур если бы мы использовали аэробных буфера в предыдущих экспериментах. В дополнение к поглощению измерения флуоресценции и кругового дихроизма анализов может быть выполнена в прикладной Фотофизика SX20 остановил поток спектрофотометр с соответствующими аксессуарами.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Генеральный лабораторное оборудование	Компания	Номер по каталогу
Вакуум-насос	Скрываться, не уплатив проигрыша	-
Бюхнер колбы	Рыбак	70340-500
Движение баров	Рыбак	14-512-129
Движение плит	Рыбак	11-100-49S
Шленка линии	Kontes стекла	-
Аргон танк	Airgas	AR UPC300
Азот танк	Airgas	Ni200
Азот бак, ультра высокой чистоты	Airgas	Н.И. UHP200
Кислородная емкость	Airgas	ОХ 40
5% водорода баланс азота танк	Airgas	X02NI95B200H998
Санкт-SX20опнут потока спектрофотометр	AppliedPhotophysics	-
Перчаточный ящик	Застенчивый	-
Водяная баня	Brinkmann Lauda	-
Запас
50 мл BD Сокол труб	Рыбак	14-432-23
15 мл BD Сокол конических труб	Рыбак	05-527-90
1,5 мл труб Эппендорф микроцентрифужных	Рыбак	05-402-18
50 и 25 мл флаконы стеклянные	Рыбак	06-402
Резиновые пробки	Рыбак	06-447H
Алюминиевые уплотнения	Рыбак	06-406-15
Ригенц
Фосфат калия, однозамещенный	Рыбак	AC2714080025
Фосфат калия, двухосновной	Рыбак	P288-500
Ацетат натрия	Сигма	S-2889
Глюкозооксидазы из A. Нигер	Сигма	G7141-250KU
D-глюкозы	Рыбак	D16-500
β-NADPH	Рыбак	ICN10116783
L (+)-орнитин гидрохлорид	Рыбак	ICN10116783