Ensaio in vitro de Apuramento mesotelial que os modelos dos primeiros passos da metástase do câncer de ovário

Resumo

O ensaio de depuração mesotelial descrito aqui leva vantagem das células marcadas com fluorescência e de microscopia de lapso de tempo de vídeo para visualizar e medir quantitativamente as interações de esferóides de câncer de ovário multicelulares e monocamadas de células mesoteliais. Este ensaio modela os passos iniciais da metástase do câncer de ovário.

Resumo

O câncer de ovário é a quinta causa principal de mortes relacionadas ao câncer nos Estados Unidos ^1. Apesar de uma resposta positiva inicial para terapias, 70 a 90 por cento das mulheres com câncer de ovário desenvolver com novas metástases, ea recorrência é muitas vezes fatal ^2. É, portanto, necessário compreender como metástases secundárias surgir, a fim de desenvolver melhores tratamentos para o cancro intermediária e fase tardia do ovário. Metástase do cancro do ovário ocorre quando as células malignas destacar a partir do local do tumor primário e disseminar por toda a cavidade peritoneal. As células disseminadas pode formar aglomerados multicelulares, ou esferóides, que irá permanecer quer acopladas, ou implantes para órgãos dentro da cavidade peritoneal ³ (Figura 1, Filme 1).

Todos os órgãos dentro da cavidade peritoneal são revestidas com um único, a camada contínua de células mesoteliais ^4-6 (Figura 2). No entanto, as células mesoteliais estão ausentes da parte de baixoperitoneais massas tumorais, como revelado por estudos de micrografia electrónica excisadas humanos secções de tecido de tumor ^3,5-7 (Figura 2). Isto sugere que as células mesoteliais são excluídos por baixo da massa do tumor por um processo desconhecido.

Anterior, em experiências in vitro demonstraram que as células cancerosas do ovário primárias anexar mais eficientemente para a matriz extracelular do que para células mesoteliais ^8, e os estudos mais recentes mostraram que os primários peritoneais células mesoteliais realmente proporcionar uma barreira para a adesão celular de ovário cancro e invasão (em comparação com adesão e invasão em substratos que não foram cobertos com células mesoteliais) ^9,10. Isto sugere que as células mesoteliais actuar como uma barreira contra a metástase do cancro do ovário. Os mecanismos celulares e moleculares pelos quais as células de câncer de ovário violam esta barreira, e excluir o mesotélio, até recentemente, permaneceu desconhecido.

Aqui descrevemos ªmetodologia e para um ensaio in vitro que os modelos de interacção entre esferóides de células cancerosas do ovário e células mesoteliais in vivo (Figura 3, Filme 2). O protocolo foi adaptado de métodos descritos anteriormente para analisar as interações ovarianos de células tumorais com monocamadas mesoteliais ^8-16, e foi descrita pela primeira vez em um relatório mostrando que as células tumorais de ovário utilizar uma ativação dependente de integrinas de miosina e força de tração para promover a exclusão do células mesoteliais de ¹⁷ sob um tumor esferóide. Este modelo leva vantagem de lapso de tempo a microscopia de fluorescência para monitorar as populações de células de dois em tempo real, fornecendo informação espacial e temporal na interação. As células de cancro do ovário expressar vermelho proteína fluorescente (SDP), enquanto as células mesoteliais expressar a proteína verde fluorescente (GFP). RFP expressando esferóides de células cancerígenas de ovário anexar à monocamada expressando GFP-mesotelial. A propagação esferóides, invadir, eforçar as células mesoteliais de lado a criação de um buraco na monocamada. Este buraco é visualizado como o espaço negativo (preto) na imagem GFP. A área do orifício pode ser então medido quantitativamente analisar as diferenças na actividade folga entre o controlo e as populações experimentais de cancro do ovário e / ou células mesoteliais. Este ensaio requer apenas um pequeno número de células de ovário cancerosas (100 células por esferóides X 20-30 esferóides por condição), de modo que é possível realizar este ensaio usando preciosos primárias amostras de células tumorais. Além disso, este ensaio pode ser facilmente adaptado para rastreio de alto rendimento.

Protocolo

1. Ovarian Cancer Formação Spheroid celular

1. RFP-expressando células cancerosas do ovário são cultivadas em meio de base de 10% (um meio de cultura de célula personalizado contendo uma mistura 50:50 de 199 e MCDB105, 10% de soro bovino fetal inactivado e 1% pen-strep). Para expressar RFP em células cancerosas do ovário não marcados, transfectar as células com um plasmídeo contendo RFP e seleccionar para células que expressam RFP. Alternativamente, os vectores virais podem ser usados ​​para expressar as proteínas fluorescentes transitoriamente, ou as células podem ser pré-incubar com um vermelho fluorescente de células rastreador corante (Invitrogen).
2. Antes da formação de esferóides de cancro do ovário, é necessário preparar-adesão baixa 96 pratos de cultura de fundo redondo bem. Para produzir as placas de aderência baixa de cultura, 30μl poli-HEMA (6mg polyhydroxyethylmethacrylate em 1 ml de 95% EtOH) solução é adicionada a cada poço de uma bem Corning 96 prato de cultura de células. As placas de 96 poços são incubadas em um 37 ° C não-umidificado incubadora para evaporar o etanol, leaving uma película de poli-HEMA em cada poço. Esta película de poli-HEMA impede que as células se liguem ao fundo do poço, forçando as células a crescer em suspensão ^18. [Alternativamente, Ultra-Low placas de fixação de cultura (Corning) pode ser usado em vez de poli-HEMA pratos revestidos.]
3. Após os de baixa aderência placas de cultura são preparados, trypsinize uma placa de células de ovário, cancro, sedimentar as células em uma centrífuga de mesa (Heraeus) a 900 RCF durante 3 minutos, aspirar o sobrenadante e re-suspender em meio de base de 10%.
4. Contar as células utilizando um hemocitómetro.
5. Ajustar a concentração de tais células que existem 100 células por 50 l de meio de base de 10%.
6. Adicionar 50 l da suspensão de células em suspensão uniformemente diluído a cada poço da placa de cultura de 96 poços de poli-HEMA revestido.
7. Incubar a placa de 96 poços em um 37 ° C incubador de cultura de células durante 16 horas (esta quantidade de tempo deve ser aumentada ou diminuída dependendo da quantidade de tempo que leva parauma linha de células particular para formar esferóides multicelulares ou desejado condições experimentais) para permitir que as células de cancro do ovário a agrupar em conjunto, formando um único esferóide multicelular em cada poço. Algumas células tumorais podem sofrer apoptose durante este período, por isso, é importante escolher um tempo anterior à indução de apoptose.

2. Formação de monocamada celular mesotelial

1. Em um capuz de cultura de células, de pré-revestimento dos poços de uma 6 bem prato MatTek com fundo de vidro com fibronectina por adição de 2 mL de uma fibronectina 5μg / ml de solução PBS a cada poço do prato e incubando à temperatura ambiente durante 30 minutos. A qualidade óptica do vidro de fundo em pratos MatTek permitir a alta resolução de imagem microscópica.
2. GFP-expressando células mesoteliais são cultivadas em meio de base de 10%. Trypsinize uma placa de células mesoteliais, girar em uma centrífuga de mesa (Heraeus) a 900RPM por 3 minutos, aspirar o sobrenadante, e re-suspensão em meio base de 10%. Océlulas mesoteliais aqui utilizados foram já expressando GFP quando eles foram obtidos, mas não marcados células mesoteliais podem ser produzidos por transfecção com um plasmídeo contendo ADNc de GFP, ou pré-incubação das células em um verde fluorescente de células rastreador corante (Invitrogen).
3. Após a incubação a fibronectina de 30 minutos (no passo 2.1), lavar os poços do prato MatTek com 2mL de PBS.
4. Aspirar o PBS e placa de 6 x10 ⁵ de células mesoteliais por poço em cada poço do prato MatTek 6 bem. Incubar o prato MatTek em um 37 ° C incubador de cultura de células durante a noite para permitir que as células mesoteliais para anexar o prato e formam uma monocamada.

3. Ensaio Apuramento mesotelial celular

1. Use uma pipeta para coletar os esferóides de câncer de ovário a partir da placa de 96 poli-HEMA bem revestido.
2. Aspirar o meio a partir de um poço do prato MatTek 6 poços contendo uma monocamada de células mesoteliais. Lavar uma vez com 2 ml de PBS. Adicionar todos os esferóides a partir do 96 bem ptarde para um poço de o prato MatTek (~ o ​​número 3x de esferóides que vão a ser trabalhada a conta para a aterragem esferóides por parte do prato que não pode ser trabalhada).
3. Coloque o prato MatTek com a fase de um microscópio de fluorescência invertido Widefield capaz de realizar lapso de tempo de imagem para a duração de pelo menos 8 horas. Use um palco motorizado para posições de imagens múltiplas no prato, com múltiplos eventos de intercalação esferóides, em um único experimento. Usamos uma Nikon Ti-E Invertido Motorizado Widefield Microscópio de fluorescência time-lapse com Sistema de Foco integrado perfeita e baixo [abertura 20x 0,75-numérica (NA)] ampliação / diferencial NA interferência de contraste (DIC) óptica, um transiluminador de halogênio Nikon com 0,52 NA distância de trabalho longa condensador (DPM), Nikon rápido (<100 milissegundos de comutação tempo) de excitação e emissão filtros (GFP Ex 480/40, Em 525/50, RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50), Sutter rápido transmissíveis Desligar e caminho de epifluorescência luz inteligenteters, uma Nikon fase linear codificado motorizado, um Hamamatsu ORCA-AG resfriado charge-coupled device câmera (CCD), uma custom-built câmara de incubação microscópio com a temperatura e CO controle _2, Nikon NIS Elements AR software versão 3, e um TMC mesa de isolamento de vibração.
4. As células de câncer de ovário esferóides vai assentar no fundo do prato e coloque a monocamada de células mesoteliais. Colete GFP, RFP e imagens de fase de 20 + esferóides / monocamada interações, a cada 10 minutos, por 8 horas.
5. Os RFP-expressam ovarianos esferóides de células cancerosas em invadir a monocamada de células GFP-expressando mesotelial criação de um buraco na monocamada. Após 8 horas, medir os tamanhos dos furos traçando os buracos negros nas imagens GFP utilizando elementos de software (ou outro software adequado, tal como J imagem). Normalizar o tamanho do furo para o tamanho inicial esferóide dividindo o tamanho do orifício de 8 horas com o tamanho do esferóide na imagem RFP correspondente no tempo zero. Neste examplo, o tamanho do buraco só foi medida uma vez, mas pode ser medido várias vezes ao longo da experiência de oito horas para entender melhor a dinâmica da intercalação.

4. Os resultados representativos

Neste exemplo, comparou a capacidade de apuramento de mesotelial OVCA433 ovarianos esferóides de células cancerosas que têm expressão atenuada do talina-1 para controlar OVCA433 esferóides. OVCA433 esferóides de cada grupo foram adicionados a um prato MatTek contendo monocamadas de células mesoteliais ZT. Seis esferóides de cada grupo foram fotografadas a cada 10 minutos durante oito horas (Figura 4, Filme 3, Filme 4). Os furos produzidos na monocamada pelos esferóides de espalhamento foram medidos e seis posições de cada grupo foram em média. A Figura 4 mostra que a área média de apuramento criado por talina 1 esferóides knockdown era significativamente menor do que a área média criado por esferóides controle, sugerindo que é necessária para talina depuração por O mesotelialVCA433 câncer de ovário esferóides.

Figura 1. Metástase do câncer de ovário. Tumores ovarianos desenvolver a partir do epitélio de superfície do ovário ou trompas de falópio. As células tumorais / clusters romper com o tumor primário e recolher na cavidade peritoneal. As células tumorais podem então agregam para formar esferóides multicelulares. Esferóides, em seguida, anexar as monocamadas de células mesoteliais que revestem a cavidade peritoneal. As células mesoteliais são excluídos por baixo do esferóide anexa do cancro do ovário, permitindo que os esferóides para obter acesso à membrana basal subjacente.

Filme 1. Metástase do câncer de ovário. Clique aqui para ver filme .

Figura 2. linha células mesoteliais a superfície do tecido peritoneal humana e são excluídos por baixo implantes de células de cancro do ovário.

Figura 3. Ensaio Apuramento mesoteliais. Esferóides de cancro do ovário são formadas por incubação 100 RFP-expressando células do ovário do cancro por poço em um poli-HEMA revestido prato de cultura de 96 poços de fundo redondo, a 37 ° C durante 16 horas. Poli-HEMA impede que as células se liguem ao prato de cultura, permitindo que as células permaneçam em suspensão e aderirem umas às outras para formar um único agrupamento por poço. Monocamadas de células mesoteliais são preparados por plaqueamento 6x10 ⁵ células mesoteliais por poço em um fibronectina revestido 6 prato MatTek bem e incubando a placa a 37 ° C durante 16 horas. Os esferóides são então transferidos para o prato MatTek com a monocamada mesotelial e as duas populações de células são gravadas a cada 10 minutos durante 8 horas, utilizando um Nikon Ti-E Inverted Motorizado Widefield Microscópio de fluorescência time-lapse e software Elements.

Filme 2. Ensaio Apuramento mesoteliais. Clique aqui para ver filme .

Figura 4. Atenuação de talina expressão 1 em OVCA433 esferóides diminui a capacidade de apuramento mesotelial. OVCA433 esferóides (vermelho) com e sem expressão atenuada do talina 1 foram autorizados a juntar-se e invadir em uma monocamada ZT mesotelial (verde). As duas populações de células foram fotografadas a cada 10 minutos durante 8 horas, utilizando um Nikon Ti-E invertido motorizado Widefield Fluorescência lapso de tempo microscópio e software elementos. O gráfico mostra que talina 1 atenuaçãodiminui significativamente a depuração célula mesotelial (parcela Quantile com barras verdes no meio).

Filme 3. Controle OVCA433 esferóides (vermelho) invasores em uma monocamada mesotelial (verde). Clique aqui para ver filme .

Movie 4. Atenuação de talina expressão 1 em OVCA433 esferóides (vermelho) diminui mesotelial (verde) a capacidade de apuramento. Clique aqui para ver filme .

Discussão

O "Ensaio Apuramento mesotelial" aqui apresentado usa de lapso de tempo de microscopia para monitorar as interações de esferóides de câncer de ovário multicelulares e monocamadas de células mesoteliais, em detalhe espacial e temporal. Anteriormente, vários grupos ^8-14 tinha usado ensaios de ponto de extremidade para mostrar que as células de câncer de ovário juntar-se e invadir em monocamadas de células mesoteliais. Este ensaio é único na medida em que utiliza células marcadas por fluo...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagente	Companhia	Número de Catálogo	Comentários
OVCA433 células cancerígenas de ovário			Presente do Dr. Dennis Slamon
Zt células mesoteliais			Presente do Dr. Tan Ince
Meio 199	Gibco	19950
MCDB105	Célula Applications Inc.	117-500
FBS, inativado pelo calor	Gibco	10082
Pen-Strep	Gibco	15070
Placas de 96 poços	Corning Costar	3799
Polyhydroxyethylmethacrylate (poli-HEMA)	Sigma Aldrich	192.066-25G	Para poli-HEMA solução dissolver o pó poli-HEMA 6mg em 1 ml de EtOH a 95%
EtOH	Pharmco-aaper	111ACS200	Diluir a 95% em 2 0 dH
Capuz de cultura de células	Nuaire	NU-425-300
De cultura de tecidos incubadora	Thermo Scientific	3110
incubadora para poli-HEMA placas	Instrumentos Labline	Imperial III 305
Centrífuga de mesa	Heraeus	75003429/01
6 prato fundo de vidro bem	MatTek corp.	P06G-1.5-20-F
A fibronectina	Sigma	F1141-1mg
PBS	Cellgro	21-040-CV
Microscópio Timelapse:
Microscópio	Nikon		Ti-E Invertido Motorizado microscópio lapso de tempo de fluorescência com sistema integrado Foco Perfeito
Lente	Nikon		20X-0,75 apeture numérica
Transiluminador de halogéneo	Nikon		0,52 NA condensador de longa distância de trabalho
Os filtros de excitação e emissão	Chroma simples filtros passa em Nikon habitação		GFP Ex 480/40, Em 525/50 RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50
Transmissíveis e Epifluoresce caminho da luz	Sutter		Persianas inteligentes
Linear-codificado estágio motorizado	Nikon
Câmera do dispositivo resfriado Charged-Coupled	Hamamatsu	ORCA-AG
Câmara de incubação com microscópio de temperatura e de CO 2 controlo	custom-built
Mesa de isolamento de vibração	TMC
NIS Elements software	Nikon		Versão 3