Isolamento e cultivo de células da crista neural do tubo neural embrionário murino

Resumo

Isolamento de crista neural embrionário a partir do tubo neural facilita o uso de In vitro Métodos para estudar a migração, a auto-renovação, e multipotency da crista neural.

Resumo

O embrionário da crista neural (NC) é uma população de células progenitoras multipotentes que origina na face dorsal do tubo neural, sofre uma transição epitelial para mesenquimal (TEM) e migra ao longo do embrião, dando origem a diversos tipos celulares ^1-3. NC também tem a capacidade única de influenciar a diferenciação e maturação de órgãos-alvo ^4-6. Quando explantado in vitro, células progenitoras de NC submetidos a auto-renovação, migrar e diferenciam-se em uma variedade de tipos de tecidos incluindo neurónios, células gliais, células musculares lisas, cartilagem e do osso.

Multipotency de NC foi descrita pela primeira vez a partir de explantes do tubo neural aviária ^7-9. Em isolamento in vitro de células de NC facilita o estudo de NC dinâmica, incluindo a proliferação, migração e multipotency. Trabalho adicional nos sistemas de aves e de rato demonstraram que as células explantadas NC NC reter o seu potencial quando transplantadas de volta para o embrião ¹⁰-13. Como essas propriedades inerentes celulares são preservadas em progenitores explantadas NF, o ensaio de explante tubo neural fornece uma opção atrativa para o estudo da NC in vitro.

Para alcançar uma melhor compreensão da NC mamíferos, muitos métodos têm sido utilizados para isolar populações NC. NC-derivados progenitores podem ser cultivadas a partir de pós-migratórias locais em ambos o embrião e adulto para estudar a dinâmica dos progenitores pós-migratórias NC ^11,14-20, no entanto isolamento de células progenitoras de NC como eles emigram a partir do tubo neural fornece preservação óptima de NC célula potencial e propriedades migratórias ^13,21,22. Alguns protocolos empregar separação de células activadas por fluorescência (FACS) para isolar uma população enriquecida para NC progenitores particulares ^11,13,14,17. No entanto, quando se inicia com embriões na fase inicial, os números de células adequadas para as análises são difíceis de obter com FACS, complicando o isolamento de início NC populations a partir de embriões individuais. Aqui, descrevemos uma abordagem que não depende de FACS e resultados em uma população de aproximadamente 96% NC puro com base em uma Wnt1-Cre repórter linhagem ativado ^23.

O método aqui apresentado é uma adaptação de protocolos otimizados para a cultura do rato NC ^11,13. As vantagens deste protocolo, em relação aos métodos anteriores são de que 1) as células não são cultivadas em uma camada alimentadora, 2) FACS não é necessário para obter uma população relativamente puro NC, 3) células premigratory NF são isolados e 4) os resultados são facilmente quantificado. Além disso, este protocolo pode ser utilizado para o isolamento de NC a partir de qualquer modelo de rato mutante, facilitando o estudo das características NF com diferentes manipulações genéticas. A limitação desta abordagem é que o NF é removido a partir do contexto do embrião, o que é conhecido para influenciar a sobrevivência, a migração ea diferenciação do NC ^2,24-28.

Protocolo

1. Placas de Preparação

1. Use técnica estéril em todos os momentos.
2. Preparar fibronectina (FN) por diluição de 100 ul de estoque humano FN plasma para um volume final de 3,3 mL em PBS de Dulbecco (DPBS). Concentração final é de 30 ug / mL e esta pode ser armazenada a 4 ° C durante 1 semana.
3. Cobrir parte inferior de cada poço de uma cultura de tecidos estéril quatro placa bem com uma solução de FN e deixar assentar durante 15 minutos. Certifique-se de toda a superfície é coberta. Tornar a mídia durante este tempo (passos 2 e 3).
4. Remover FN solução e permitir que as placas para secar. Suavemente lavar os poços com 500 uL de DMEM, remove DMEM, e adicionar 500 uL de auto-renovação (SR) médio (ver abaixo). Incubar a 37 ° C numa incubadora humidificada contendo 5 por cento _de CO2. Complete esta hora aproximadamente um antes de dissecção de modo que as placas será seca antes da utilização.

2. Preparando Médio SR

1. Para a cultura de NC vagal e troncoa partir de embriões (aproximadamente dez uma ninhada, dependendo de fundo genético da linha de rato), preparar 25 mL de meio de SR. Combinar 12,5 mL de baixa glicose DMEM, 7,5 ml de meio Neurobasal, 25 uL de ácido retinóico (117 uM de concentração final), e 25 uL de 2-mercaptoetanol (50 mM de concentração final). Misture bem.
2. Adicionar 3,75 ml Extracto de embrião de pinto, 250 uL de N suplemento de sal _2, 500 suplemento B27 uL e 250 uL de penicilina-estreptomicina (1% de concentração final). Filtrar o meio através de um filtro 0,22 uM.
3. Adicionar 10 uL IGF1 estéril (20 ug / mL concentração final) e 20 uL de bFGF estéril (20 ug / mL concentração final). Misturar por inversão. Armazenar a 4 ° C.

3. Preparação meio de lavagem

1. Durante cerca de 10 embriões preparar 50 mL de meio de lavagem. Combinar 50 mg de BSA com 35 mL de baixa glicose DMEM, 15 ml de meio Neurobasal, e 500 uL de penicilina-estreptomicina (1% de concentração final). Filtro estéril com um 0,22filtro uM.

4. Preparando colagenase / dispase

1. Adicionar 50 ul de 100 mg / mL de colagenase / dispase a 5 DPBS mL. Misture bem.
2. Filtro de seringa com um filtro 0,2 um e adicionar 1,5 mL em cada um dos três poços de uma placa de 12 bem. Pipetar cerca de 1 mL em meio de lavagem dos poços restantes. Guarde placa inteira em gelo até estar pronto para digerir tecido dissecado.
3. Cortar pontas de uma ponteira p20 e p1000 filtro com uma lâmina estéril. Cortar logo abaixo da aresta chanfrada da ponta. O ponto de corte p1000 irá ser usada para transferir o embrião inteiro, enquanto a p20 irá ser usada para transferir pedaços de tecido isolado.

5. Isolando vagal e Tubo Neural tronco de embriões 9,5 Dpc

1. Para gravidezes programadas, as barragens com um plug vaginal são considerados 0,5 dpc ao meio-dia pela manhã a ficha é observado. Sacrifício e remover o útero de 9,5 dpc.
2. Remover o decidua a partir de útero e suavemente remove o embrião da decídua. Uma vez que experimentou com este protocolo, isolar 3-4 9,5 embriões Dpc em um momento em DPBS estéreis. Use técnica estéril e instrumentos de dissecção esterilizados. Instrumentos podem ser esterilizados por autoclave a esterilização por calor, ou por incubação em etanol.
3. Para anterior vagal NC: usando agulhas de insulina, cortar o tubo neural no placode meados ótica. Corte novamente na borda posterior do somito 4 ^º. Aparar tecido ventral para o tubo neural para remover os arcos da faringe e do coração.
4. Para NC tronco: usando agulhas de insulina, remover a porção do tubo neural entre 16-22 sómitos (ou o somito última se os embriões são developmentally mais cedo do que a fase somito 22).
5. Mantenha o saco vitelino e qualquer tecido remanescente embrionário para genotipagem.

6. A remoção de não-neural ectoderma e mesoderma

1. Colocar o tubo neural contendo segmentos em colagenase / dispase à temperatura ambiente durante 10 minutoss. Lavar imediatamente em meio de lavagem.
2. Retornar ao tecido DPBS estéreis. Usando agulhas de insulina estéreis, remover suavemente a ectoderme não a partir do tecido neural e separar os sómitos longe do tubo neural. As últimas partes restantes da mesoderme a partir de tecido somito pode ser removido por trituração suavemente, utilizando um cut-down p20 ponta. Tenha cuidado para não danificar o tubo neural. Observe atentamente este processo durante a trituração.
3. Colocar o tubo neural isolado por meio de um segundo e terceiro lavagem de 30 segundos de meio de lavagem.
4. Lavar uma vez em meio de SR, e colocar o tubo neural isolado para o centro de um poço FN-revestido que foi previamente preparado (Passo 1,3). Humidificar a câmara de hipóxia com um prato de água estéril. Colocar a cápsula para dentro da câmara hipóxia e lavar a câmara de gás misturado com a 3% de O ₂ (utilizar um tanque contendo uma mistura de 1% de O _2, 6% de CO _2, 93% N _2).
5. Sempre manuseie a câmara com muito cuidado para garantir thaexplantes t estão livres e permanecem no centro dos poços.
6. Incubar a 37 ° C. Resumo dos passos 5-6 é mostrado na Figura 1.

7. A remoção do Tubo Neural

1. Após 24 horas de incubação, remover o tubo neural suavemente provocando a borda do tubo neural longe das células migratórias usando uma agulha de insulina estéril. Remover e descartar o tubo neural a partir do meio usando um corte p20 estéril como no passo 6,2 e substituir o meio com meio fresco SR (Figura 2). Isto é mais facilmente feito usando um microscópio invertido.

8. Os resultados representativos

Após 24 horas de incubação a 37 ° C em condições de hipóxia, as células de NC ter migrado para longe do tubo neural em uma população quase puro (Figura 3a). Às vezes, menos do que as culturas ideais não trará conseqüências robustos. Por exemplo, é possível que, após 24 horas tele tubo neural terá enrolado sobre si próprio e à NC não irá migrar para longe do tubo neural (Figura 3b). Ocasionalmente, o tubo neural não irá anexar as placas fibronectina revestidos.

Em nossa experiência, sub-óptima migração NC ou problemas com a fixação do tubo neural podem ser adversamente afetados por condições de normóxia ou concentração da fibronectina, respectivamente. A actividade enzimática da colagenase / dispase varia ligeiramente por lote e tempo de digestão deve ser ajustada adequadamente, no entanto, não digerir o tecido mais tempo do que quinze minutos. Overdigestion do tubo neural contendo tecido em colagenase / dispase também irá resultar em conseqüências deficientes. Se o tecido somito não é facilmente removido do tubo neural após incubação em colagenase / dispase, o tubo neural pode ser incubada durante mais de dez minutos. Às vezes, o tubo neural não irá anexar ao substrato. Se este for o caso, verifique a fibronecconcentração de estanho e as condições de hipoxia.

Embora as condições normóxicas pode ser utilizado para a cultura de tipo selvagem NC, condições hipóxicas imitar mais de perto o ambiente in vivo ^29,30. Em nossa experiência, condições de hipóxia tornou-se crítica quando a cultura mutante NC. Por exemplo, quando FOXD3 mutante NC foram cultivadas em condições normóxicas, tronco NC tinha uma excrescência célula grandemente reduzida em comparação com os controlos. Esta disparidade em tamanho excrescência foi removido quando os explantes foram cultivados em condições de hipóxia (Figura 4). Além disso, quando do tipo selvagem do tubo neural explantes foram cultivados em normóxia, o número de células positivas para caspase foi maior do que aquela de explantes semelhantes cultivadas em hipoxia (dados não mostrados). Ao manter toda a cultura NC em hipóxia, as comparações podem mais facilmente ser feito entre a dinâmica de controle e culturas mutantes.

Figura 1. Esquemática geral de isolamento NC. A) Dissecar regiões de interesse a partir do embrião. B) Digest tubo neural em colagenase / dispase por dez minutos (não ultrapassar quinze minutos). C) Lavar em meio de lavagem. D) Dissecar longe do ectoderma não-neural e mesoderma. EF) Lavar duas vezes em meio de lavagem. G Plate) em meio de auto-renovação. Incubar a 37 ° C em _3% de O2 condições hipóxicas.

Figura 2. Remoção gradual do tubo neural de explante. O tubo neural deve ser removida depois de 24-48 horas para evitar a contaminação com não-NC células. A) Observe o limite entre o tubo neural ea excrescência NC (linha sólida). B) O corte ao longo da borda do tubo neural com uma agulha de insulina. C) Descartar o tubo neural e substituí-meio com meio fresco auto-renovação. A linha a tracejado indica o grau de crescimento. Sigla: NT, o tubo neural.

Figura 3. Exemplos de resultados representativos. A) excrescência explante típica após 24 horas de incubação em meio de auto-renovação em condições de hipóxia (linha a tracejado indica o grau de crescimento). B) Magnified vista da excrescência NC após 48 horas em cultura. C) a cultura Menos ideal com rendimento baixo crescimento. A e C foram cultivadas nas mesmas condições. Imagens demonstrar a gama natural em robustez cultura. Isto pode ser afectada pela eficiência do isolamento do tubo neural, a concentração de FN, condições de hipóxia, eo tempo em colagenase / dispase digestões.

Figura 4. Em análises in vitro de culturas de explante NF em normóxia contra a hipoxia. Controle (tipo selvagem), as células migraram a partir de explantes de NC tubo neural após 48 horas em condições de cultura normóxicas. Em contraste, FOXD3 mutanteNC tinha bastante reduzido conseqüências celulares em normóxia (bordas contornos marca vermelha das conseqüências NC). Quando explantes comparáveis ​​foram cultivadas sob condições de hipóxia, FOXD3 explantes mutantes NC cresceu comparavelmente aos controlos, permitindo que as análises subsequentes. Nota, este comportamento correlacionou bem com o comportamento de FOXD3 mutante NC in vivo.

Discussão

Atenção especial deve ser dada à fase de desenvolvimento do embrião para garantir o sucesso desta abordagem. Contando somitos de embriões de rato é fundamental tanto para a fase correspondente embriões dentro de uma maca e determinar as regiões corretas do tubo neural para o isolamento. Uma variação de um ou dois sómitos entre os embriões está dentro de uma gama razoável de tempo de desenvolvimento, dependendo da resolução da experiência realizada. Um embrião entre 9 e 9,5 dpc terá entre 17 e 25 somit...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
DMEM (glicose baixa)	Gibco / Invitrogen	11885
Médio Neurobasal	Gibco	21103
BSA	Sigma	A3912-10G
DPBS	Gibco	14190-144
IGF1	BD Biosciences	354037	Armazenar em 50 ug / ml alíquotas a -20 ° C.
bFGF	BD Biosciences	354060	Armazenar em 25 ug / mL alíquotas a -20 ° C.
A fibronectina	Gibco	33016-015	Armazenado em 1mg/mL aliquots a -20 ° C.
O ácido retinóico	Sigma	R2625	Armazenar em 35 ug / ml alíquotas após reconstituição em etanol a -20 ° C.
2-mercaptoetanol	Sigma	D-5637
N suplemento 2	Gibco	17502-048
B27 suplemento	Gibco	17504-044
Steriflip de filtros de 0,22 uM	Millipore	SCGP00525
Penicilina-estreptomicina	Invitrogen	15140122
0,20 mM filtros	Corning	431219
Seringas (para a filtração)	BD Biosciences	301604
Quatro placas de poços	Thermo Fisher Scientific	176740
Colagenase / dispase	Roche	269 ​​638	Atividade varia por lote. Armazenar em 100 mg / ml alíquotas a -20 ° C.
Agulhas de insulina (29 manômetro ½)	Becton Dickson	309306
Câmara hipóxia	Billups-Rothenberg
Analisador de Oxigênio	Billups-Rothenberg
Fórceps # 5	Belas Ferramentas Ciência		Para a remoção do útero e decídua.
Tripsina-EDTA (0,25%)	Gibco	25200