Gravações Whole-cell simultâneas de fotorreceptores e os neurônios de segunda ordem em um anfíbio Retinal Slice Preparação

Resumo

Nós descrevemos a preparação de fatias finas de retina aquático salamandras tigre ( Ambystoma tigrinum) E explicar como usamos essas fatias para estudar o processamento sináptico na retina através da obtenção de gravações braçadeira de tensão de célula inteira dupla de fotorreceptores e células horizontais e bipolares de segunda ordem.

Resumo

Uma das tarefas centrais da retina neurociência é compreender os circuitos de neurônios da retina e como essas conexões são responsáveis ​​por moldar os sinais transmitidos para o cérebro. Os fótons são detectados na retina por haste e cone fotorreceptores, que convertem a energia em um sinal elétrico, transmiti-lo a outros neurônios da retina, onde é processado e comunicado a alvos centrais do cérebro através do nervo óptico. Primeiros insights importantes sobre os circuitos da retina e processamento visual veio dos estudos histológicos de ^1,2 Cajal e, posteriormente, a partir de registros eletrofisiológicos da atividade spiking de células ganglionares da retina - as células da retina ^3,4 de saída.

Uma compreensão detalhada do processamento visual na retina requer uma compreensão da sinalização em cada passo na via de fotorreceptores de células ganglionares da retina. No entanto, muitos tipos de células da retina são burIED profunda no tecido e, portanto, relativamente inacessível para a gravação eletrofisiológico. Esta limitação pode ser superada por trabalhar com fatias verticais, nas quais as células que residem dentro de cada uma das camadas da retina são claramente visíveis e acessíveis para gravação electrofisiológico.

Aqui, descrevemos um método para fazer seções verticais de retinas de larval salamandras tigre (Ambystoma tigrinum). Embora esta preparação foi originalmente desenvolvida para as gravações com microeléctrodos afiadas ^5,6, é descrito um método para a gravação de fixação de tensão dupla de células inteiras a partir de fotorreceptores e células horizontais e bipolares de segunda ordem em que manipulam o potencial de membrana do fotorreceptor enquanto grava simultaneamente pós- as respostas sinápticas em células horizontais ou bipolar. Os fotorreceptores da salamandra tigre são consideravelmente maiores do que os das espécies de mamíferos, tornando esta uma preparação ideal para realizar tsua abordagem experimental tecnicamente desafiador. Estas experiências são descritas com um olho para investigar as propriedades de sinalização da fita sináptica - uma estrutura sináptica especializada encontrado em um apenas um punhado de neurônios, incluindo a haste e cone fotorreceptores, que é bem adequado para a manutenção de uma elevada taxa de tônico liberação de neurotransmissores ^{7 , 8} - e como ela contribui para as propriedades de sinalização únicos deste primeiro sinapse da retina.

Protocolo

1. Fatias de retina Preparação

1. Montar a câmara (desenho ilustrado na Figura 1). Colocar duas gotas de gordura vácuo, espaçadas de ~ 8-10 mm de distância, através da câmara de registo para formar um canal para superfusate e em que para incorporar as fatias de retina. Adicione uma segunda gota de graxa alguns milímetros mais longe além de cada uma dessas duas esferas de gordura para funcionar como um dique e limite de transbordamento. Coloque um pequeno pedaço triangular de kimwipe na extremidade da câmara de fluido para garantir o contacto com o eléctrodo de referência.
2. Pressione um pedaço de membrana de nitrocelulose (~ 5 x 10 mm, 0,8 mM poros) plana contra a lâmina de vidro em duas pequenas gotas de gordura vácuo. Evite gorduras directamente abaixo do centro da membrana de nitrocelulose, tal como esta pode impedir a aderência da retina.
3. Para preparar o cortador de tecidos, quebrar uma borda dupla lâmina de barbear em 4 pedaços e coloque um no braço corte. Corte uma fatia fina de nitrocellulose membrana para garantir que a aresta de corte da lâmina fique plana contra a câmara de registo e, portanto, limpa corta através da membrana de nitrocelulose.
4. Manter uma pequena proveta de solução salina anfíbio (Tabela 1) em gelo na estação de esvaziamento.
5. Salamandra eutanásia por decapitação. Hemisect a cabeça sagital e na medula através da medula espinhal. Coloque metade da cabeça em um pedaço de algodão umedecido com solução salina anfíbio em cima de um bloco de linóleo. A outra metade da cabeça pode ser embrulhado com uma toalha de papel húmido e armazenados a 4 ° C para utilização mais tarde no dia.
6. Enuclear o olho. Usando pequenas Vannas tesoura, corte a pele que liga o olho à órbita ao redor. Depois de libertar a frente do olho a partir do tecido orbital ao redor, puxar o olho para a frente e deslize a tesoura sob o olhar de cortar os músculos do olho e do nervo óptico, liberando o olho da órbita.
7. Coloque o olho enucleado em uma cama de algodão nobloco de linóleo. Descarte o meia cabeça. Corte o excesso de gordura orbital do fundo do olho.
8. Adicione uma pequena incisão no centro da córnea com uma lâmina de bisturi afiado. Retire a córnea deslizando Vannas multa tesoura na incisão e prorroga o corte radial em direção ora serrata. Cortar circunferencialmente em torno ora serrata rodando o bloco de linóleo ou o algodão entre os cortes.
9. Depois de cortar todo o caminho ao redor do olho, retire a córnea ea lente, puxando-os para fora do lado da ocular. Mova o ocular, resultando em uma superfície dura do bloco de linóleo umedecido com solução salina anfíbio. Corte-o em três partes com uma lâmina afiada, usando um movimento de corte fino para garantir que você tenha cortado todo o caminho através da esclera.
10. Coloque uma ou duas peças de ocular na membrana de nitrocelulose com a superfície da retina voltada para baixo. Mergulhe os pedaços restantes com soro fisiológico adicional e colocá-los na geladeira para a 4 ° C.
11. Gently pressione o pedaço de ocular contra a membrana de nitrocelulose, com uma pinça fina. Imergir a membrana de nitrocelulose e um pedaço ocular com várias gotas de solução salina fria e anfíbio blot com as bordas com kimwipe ajudando a retina para aderir. Mais uma vez, submergir a ocular e da membrana de nitrocelulose, com várias gotas de solução salina fria e anfíbio descascar a esclera / coróide / retina epitélio pigmentar da retina para isolar (que podem aparecer rosa devido à presença de não branqueada rodopsina). Se necessário, o corte do nervo óptico para libertar a retina.
12. Se a retina não aderiu firmemente, escorrer a solução salina com um Kimwipe para puxar a retina mais firmemente para baixo sobre a membrana de nitrocelulose. Substitua a solução salina. Repetindo, se necessário.
13. Encher a câmara com uma solução salina fria anfíbio e transferi-lo para a fase do fatiador de tecidos. Cortar a retina e a membrana de nitrocelulose em tiras finas, trabalhando a partir de uma extremidade para a outra, rodando o micrómetro vernierem incrementos de 125 uM. Pressione a lâmina de barbear gentil mas firmemente através da retina e membrana de nitrocelulose.
14. Transfira as fatias da retina movendo tiras de membrana de nitrocelulose para o canal principal da câmara de gravação. Retire uma tira de membrana livre e, em seguida, mantê-lo no lugar enquanto se move a câmara por baixo, tendo a certeza de manter as fatias submerso. Incorporar as arestas da membrana de nitrocelulose em tiras de graxa vácuo, rodá-los em 90 graus para visualizar as camadas da retina.
15. Pressionar a membrana de nitrocelulose fixa sobre a superfície do vidro. Mesmo se não houver retina em cada peça, coloque as tiras de membrana de nitrocelulose em intervalos regulares (~ 1 mm de distância) ao longo de todo o comprimento do canal de perfusão para ajudar a quebrar a tensão superficial e aumentar o fluxo de fluido.

2. Gravações Whole-cell emparelhados

1. Depois de todas as fatias foram transferidas, mover a câmara de registo com o estágio de uma posição vertical, fixosmicroscópio palco e prender o cabo-eletrodo de referência. Concentre-se sobre as fatias usando uma distância longa de trabalho, imersão em água, 40-60X objetiva. O microscópio deve ser colocado sobre uma mesa de ar para amortecer as vibrações e encerrado numa gaiola de Faraday para reduzir a interferência eléctrica.
2. Superfuse as fatias continuamente a uma taxa de 1 ml / min com solução salina anfíbio borbulhar com 100% _de O _2. Ligue a sucção, certificando-se de que a entrada e saída são equilibrados. Escoamento pode ser regulado pela rotação da extremidade biselada da agulha de aspiração ou movendo o kimwipe na extremidade da câmara mais perto ou mais longe da agulha de saída. A preparação pode ser mantido à temperatura ambiente ou arrefeceu-se com um dispositivo Peltier ou simplesmente definindo um bloco de gelo sobre a platina do microscópio.
3. Examinar fatias sob luz fraca ou de infra-vermelho e identificar um par de células - um fotorreceptor (haste ou cone) e células horizontais ou bipolar nas proximidades - alvo para a gravação de célula inteira. Hastes podem ser identified pelos seus corpos celulares de grandes e proeminentes rod-like segmentos exteriores (Figura 2A). Cones são menores do que as hastes e tem pequenos segmentos exteriores cónicos. Células bipolares e células horizontais somas estão na fila mais exterior de corpos celulares na camada nuclear interna (INL, Figuras 2B e 2C).
4. Antes de preparar fatias, use um extrator pipeta para a fabricação de micropipetas de vidro de borosilicato (1,2 mm de diâmetro externo, 0,95 mm de diâmetro interno com um filamento de vidro). A ponta de cada uma micropipeta deve ser ~ 1-2 microns de diâmetro.
5. Usando uma agulha de enchimento não-metálicos (por exemplo, uma fabricados a partir de uma seringa de 1 cc ou a Microfil), preencha pipetas com a solução intracelular (Tabela 1) e anexar ao suporte do eletrodo.
6. Eleve a objetiva do microscópio ligeiramente. Posicione a pipeta fotorreceptor abaixo do objetivo e, em seguida, baixá-lo de modo que a ponta é posicionada logo acima das fatias. Repita com tsegundo ele pipeta.
7. Ajuste qualquer deslocamento no nível atual da linha de base no amplificador. Verificar a resistência da pipeta com um pulso despolarizante mV 5-10. Nós normalmente utilizam pipetas que variam 10-15 mohms, o resultado a longo conicidade do veio e baixa osmolaridade das soluções anfíbio pipeta. Com as soluções de osmolaridade mamíferos superiores, estes mesmos pipetas apresentam valores de resistência de ~ 8-12 mohms. Embora tenhamos usado maiores diâmetros de ponta com os valores de resistência de 3-4 mohms em soluções de anfíbios, as vantagens proporcionadas por uma resistência de acesso inferior são compensados ​​por uma maior dificuldade de vedação para as membranas celulares e uma degradação mais rápida das correntes de cálcio e outro segundo mensageiro respostas de minúsculas.
8. Ao aplicar pressão ligeira, a posição positiva da pipeta pós-sináptico para que ele contata o corpo da célula horizontal ou bipolar. Em seguida, posicionar a pipeta pré-sináptica de modo que entra em contacto com o corpo da célula de uma haste ou cone de fotorreceptores. Gravações APPEar a ser mais estáveis ​​quando ponteiras contacto com o segmento interno em vez da soma, especialmente em cones.
9. Enquanto monitoriza a resistência, libertar a pressão positiva na pipeta pós-sináptica. Por vezes, a libertação de pressão positiva é suficiente para formar uma vedação gigaohm. Se não, aplicar sucção suave, com uma seringa de 1 ml ou por via oral. Após a resistência de ponta cresceu para> 100 mohms, aplicar um potencial de realização de -60 mV. Após a obtenção de um selo gigaohm, nulo quaisquer transientes de capacitância pipeta e repita o procedimento de vedação para o fotorreceptor pipeta, aplicando um potencial de realização de -70 mV.
10. Rupture o patch usando sua boca ou uma seringa para aplicar o vácuo para cada célula de cada vez. Rods, cones, e células bipolares vontade tipicamente ruptura com sucção suave. Obtenção de configuração de célula inteira com uma célula horizontal pode exigir uma maior sucção (ou seja, com uma seringa de 3 cc), em combinação com fortes impulsos de tensão rápidas entregues com o "zap" fGolpe do amplificador de patch clamp. A ruptura da membrana e estabelecimento de configuração de célula inteira será evidente pelo aparecimento de fenómenos transitórios de capacitância de célula inteira.
11. Confirmar a identidade da célula pós-sináptica fisiologicamente pela aplicação de um flash de luz e entregando uma série de passos de voltagem de -120 a +40 mV em incrementos de 20 mV (Figuras 3 e 4).
12. Para avaliar se o par de células são ligados sinapticamente, entregar uma breve (25-100 ms), 60 mV passo despolarização ao fotorreceptor (a -10 mV, próximo do pico do cálcio tipo-L por voltagem de corrente) e procurar para as correntes de pós-sinápticos no segundo neurónio ordem (Figura 5). Um passo despolarizante forte deve provocar uma corrente de influxo rápido, transiente pós-sináptica na célula pós-sináptica bipolar horizontal ou OFF causada por uma explosão de libertação de vesículas do cone (Figura 5).

Resultados

Vestígios representativos das respostas de luz a partir de neurónios em fatias verticais de salamandra retina são mostrados na Figura 3. O cone, célula horizontal e OFF célula bipolar tudo exibir uma corrente externa em resposta ao aparecimento de luz. O destaque atual para dentro após o flash de luz nas gravações de células horizontais e bipolar é causada pelo aumento da liberação de glutamato de fotorreceptores como despolarizar no deslocamento da luz. A ON célula bipolar responde com uma corrente interna no início da luz resultante de um receptor de glutamato metabotrópicos cascata de sinalização e ativação de canais TRPM1 ⁹ sign-inversora. Células horizontais e células bipolares podem ser distinguidas uma da outra pela sua relações IV (Figura 4). Células horizontais têm tipicamente uma resistência de entrada de cadeia linear ou de rectificação para dentro e IV baixa (<500 mohms, Figura 4A), enquanto as células bipolares têm uma elevada resistência de entrada(0,5-2 GÊ) e exteriormente, retificando I - V (Figura 4B) A Figura 5 mostra resultados representativos a partir de gravações de um par de células cone-horizontal (Figura 5A) e cone-OFF par célula bipolar (Figura 5B).. Em cada uma, o cone despolarizantes para -10 mV a partir de um potencial de manutenção de -70 mV evocada uma corrente no interior do cone e EPSC rápida na célula horizontal ou bipolar cálcio dependentes da voltagem. Esta forte estímulo é suficiente para esvaziar o conjunto prontamente libertável de ~ 20 de cada fita de vesículas sinápticas, resultando numa EPSC de ~ 47 pA / fita ^10. O EPSC célula horizontal na Figura 5A foi 232 pA, sugerindo que recebeu 5 contatos fita do cone pré-sináptico. A estimativa similar do 178 pA EPSC no celular desligado bipolar (Figura 5B) sugere que ele recebeu 4 contatos fita do cone pré-sináptico.

	Anfíbio salina	Pipeta pré-sináptico	Pipeta Postsynaptic
NaCl	116 mM	3,5 mM	3,5 mM
KCl	2,5 mM
CaCl2	1,8 mM	1 mM	1 mM
MgCl2	0,5 mM	1 mM	1 mM
HEPES	10 mM	10 mM	10 mM
Glicose	5mM
Cs-Glutamato *		40 mM
Cs-gluconato **		50 mM	90 mM
Cloreto Tetraethylammonium		10 mM	10 mM
ATP-Mg		9 mm	9 mm
GTP		0,5 mM	0,5 mM
EGTA		5mM	5mM
pH ***	7.8	7.2	7.2
Osmolaridade ****	245 mOsm	240 mOsm	240 mOsm

* Cs-glutamato é feita por neutralização de 40 mM de ácido L-glutâmico, com 40 mM na solução de CsOH pipeta. ** Um estoque de Cs-gluconato de 1 M é feita por neutralizar uma solução de CsOH com 45-50% de ácido D-glucônico. *** O pH deve ser ajustado com NaOH para a solução extracelular e CsOH para as soluções de pipeta. **** Mantendo a osmolaridade das soluções de pipeta logo abaixo da temperatura da solução extracelular impede inchaço celular e aumenta a longevidade da gravação.

Mesa1. Componentes e parâmetros para as soluções intra e extracelulares padrão utilizado neste protocolo.

Figura 1. Desenho da câmara de gravação. (AC) Top, lateral e cortante vistas da câmara de gravação mostrando dimensões. A câmara é usinado a partir de um pedaço de espessura 2 mm de acrílico. (D) câmara montada. Superfusate entra na câmara através de um comprimento de 10 cm de Teflon tubo (tubo de entrada; tipo 24LW). Superfusate é removido por aplicação de sucção leve a um tubo de metal de calibre 20 chanfrada, no outro lado da câmara. Adjacente a este tubo de saída é um eléctrodo de referência de Ag / AgCl de sedimento. A vantagem deste eléctrodo de referência está ligada à entrada de referência do headstage. Um pequeno triângulo de Kimwipeé colocada sobre o eléctrodo de referência para mantê-lo em contacto com a solução e regular o fluxo de solução para dentro do tubo de saída. A base da câmara é formada por colocação de uma lâmina de microscópio de vidro nas bordas de recesso da câmara. O slide é mantido no lugar com uma gota de graxa de vácuo. As tiras de membrana de nitrocelulose com as fatias de retina são incorporados nos grânulos de graxa de vácuo, que formam um canal para a solução de fluxo. Antes de fazer fatias, uma x 10 mm pedaço de membrana de nitrocelulose 5 é fixada à câmara com duas pequenas gotas de gordura vácuo. Um pedaço da ocular é colocada lado vítrea para baixo nesta membrana de nitrocelulose e levantou fora uma vez que os adere retina. Clique aqui para ver a figura maior .

Figura 2. Pares de células cheias de corante em vepreparação fatia rtical. A) Imagens de uma vara e célula horizontal sinapticamente acoplado que foram preenchidos com contraste corantes fluorescentes introduzidas através da pipeta de patch durante a gravação de célula inteira simultânea. Lúcifer amarelo (2 mg / ml), foi incluída na solução pipeta haste (amarelo) e sulfarhodamine B (1 mg / ml), foi incluída na solução pipeta célula horizontal (roxo). Imagens fluorescentes foram capturados usando um disco giratório microscópio confocal (Perkin Elmer Ultraview LCI) equipado com uma câmera CCD refrigerado (Orca ER) e subiu ao microscópio palco fixo (Nikon E600 FN com 60X, 1,0 NA objetiva de imersão em água). Estas imagens foram sobrepostas em imagens de campo claro das fatias da retina correspondentes usando o Adobe Photoshop. B) Imagens de um cone e sinapticamente acoplados OFF célula bipolar. O terminal do axônio da célula bipolar ramifica no exterior sublamina (S1) da camada plexiforme interna, perto da fronteira com a camada nuclear interna. C) Imagens de um cone e células horizontal sinapticamente acoplado. Note-se que os terminais de cone são consideravelmente maiores do que o terminal axonal da haste. Embora as células horizontais pode ser identificada pela forma oblonga dos seus corpos celulares, corpos celulares de células e-NO bipolares do tipo fora na INL não pode ser facilmente distinguida antes da gravação. No entanto, pode ter como alvo uma deslocado cone expulsos células bipolares, que têm corpos celulares no ONL e podem ser distinguidas a partir de cones com a ausência dos segmentos interno e externo. A barra de escala é de 20 mM.

Figura 3. Correntes registrados no braçadeira de tensão a partir de quatro diferentes neurônios da retina em resposta a um 500 ms flash brilhante de luz branca de luz evocada. Cone O (A), a célula horizontal (B), e fora da célula bipolar (C) todos responderam à luz com uma corrente para fora. (D) A na célula bipolar respondeu ao mesmo estímulo de luz com uma corrente para dentro. O ruído da linha de base exibido pela célula bipolar off (C) reflete uma liberação contínua de vesículas sinápticas na escuridão que diminui quando fotorreceptores hiperpolarizar na luz. As respostas a estas quatro células foram obtidas em gravações separadas usando fatias preparadas de acordo com a luz branca. A intensidade do estímulo de luz branca utilizada nestes exemplos produzido respostas em células horizontais e bipolares equivalentes a 580 nm, fluxo de fótons de 1 x 10 ⁵ fotões / sec / ² mM.

Figura 4. Relações corrente-tensão (IV) de horizontal células bipolares e desligado. (A) O painel de topo, as correntes de membrana evocados por uma série de passos de voltagem de 150 mseg, de -120 a +40 mV aplicada em incrementos de 20 mV (painel inferior) para uma célula horizontal. Células horizontais tipicamente têm uma baixa resistência de entrada e as relações lineares ou interiormente rectificação IV. (B) a relação IV de uma célula bipolar fora em resposta a uma série de degraus de tensão. Células bipolares têm uma maior resistência de entrada e um IV exteriormente rectificação, devido à ativação de correntes de voltagem-dependentes de potássio.

Figura 5. Exemplos de gravação de dados emparelhados. (A) Gravação do cone corrente de cálcio voltagem-dependentes (Cone I _Ca ) em resposta a um passo de 100 ms a -10 mV a partir de um potencial de manutenção de -70 mV (Cone _m V). Vazamento e capacitância transientes foram subtraídos usando um vazamento protocolo subtração P / 8. Uma corrente rápida excitatório pós-sináptico (EPSC; HC PSC) foi gravada simultaneamente a partir de uma célula horizontal, mostrando que estas duas células são sinapticamente acoplado (B) Uma EPSC foi registada numa célula bipolar fora em resposta ao mesmo estímulo noutro. cone.

Discussão

A preparação fatia retina provou ser muito útil para a análise dos circuitos e mecanismos utilizados pela retina para processar a informação visual. A capacidade de obter gravações de células inteiras simultaneamente de pré e pós-sináptica neurônios tem sido particularmente útil neste esforço. Gravações de células inteiras emparelhados são muito mais fácil de alcançar com fatias do que com os preparativos da retina plana de montagem, porque as diferentes camadas da retina estão expostos. Além disso, por causa de seus grandes neurônios da retina, salamandras têm uma longa história como uma preparação da retina e, portanto, fornecer um sistema modelo particularmente bem caracterizada.

Com a prática, fatias saudáveis ​​de salamandra retina pode ser preparado regularmente. A poucos passos importantes podem fazer a diferença entre sucesso e fracasso. 1) Certifique-se de que a lâmina de barbear é montado sobre o cortador de tecidos de modo a que fique plana contra a superfície do vidro e fatias limpa embora tanto o tecido e underlyimembrana de nitrocelulose ng. Se você fez um corte limpo através da membrana de nitrocelulose, você deve ouvir um leve clique quando a lâmina atinge a superfície da lâmina de vidro. 2) Certifique-se que a retina tenha aderido à membrana de nitrocelulose. Caso contrário, a retina pode flutuar para longe da membrana durante qualquer passo dos procedimentos. 3) Não exponha as fatias cortadas ao ar, pois isso irá prejudicar muitas das células superficiais. 4) Certifique-se as fatias e membrana de nitrocelulose deitado contra a lâmina de vidro para que as camadas da retina são visíveis sob o microscópio de dissecação. 5) Equilibre as taxas de entrada e saída superfusate para evitar transbordamento da câmara de gravação. Isto impede que as alterações súbitas nos níveis de solução, o que pode causar movimentos abruptos de tecidos. 6) Selecção de um par de células saudáveis ​​próximos uns dos outros. Células com citoplasma lisa são mais saudáveis ​​do que as células com citoplasma granuloso. As células mais profundas na fatia são mais propensos a reter con sináptica intactacontatos. 7) Certifique-se que a ponta da pipeta não tenha quebrado ou roçou outro tecido ou detritos no meio do caminho para as células. 8) Verificar a resistência pipeta para garantir que ele não está entupido com detritos ou uma bolha, o que pode tornar difícil a obtenção de uma gravação de célula inteira de qualidade.

Em vez de fixar a retina para papel de filtro de nitrocelulose, alguns investigadores incorporar retinas num bloco de agar e usar um vibratome para cortar fatias de retina. Apesar de não ter tentado esta abordagem, Kim et al. ¹¹ discutir as vantagens de ambas as abordagens. Em sua experiência, a abordagem baseada em agar fornece um rendimento mais consistente de fatias planas com camadas da retina bem delineados, mas abordagem baseada em papel do filtro produz fotorreceptores saudáveis.

Cones e bastonetes são responsáveis ​​pela transdução de luz em mudanças no potencial da membrana. Com gravações emparelhadas, o potencial de bastonetes ou cones membrana pode ser manipulated diretamente e assim a capacidade para gerar respostas de luz, embora útil para a identificação de tipos de células, pode não ser essencial. Por isso, muitas vezes preparar fatias de luz branca. No entanto, mesmo quando preparado sob iluminação brilhante, salamandra neurónios da retina pode gerar grandes respostas de luz, tal como ilustrado pelas respostas na FIG. 3. Isto é em parte devido a um número relativamente grande reservatório de cromóforo no grande volume de segmento externo, mas também podem reflectir a capacidade das células para regenerar Müller 11-cis-retinal para cones ^12. Para obter respostas totalmente claras de adaptação ao escuro, pode-se preparar as fatias sob iluminação infravermelha. Para dissecções sob luz infravermelha, damos GenIII intensificadores de imagem (Nitemate NAV3, Litton Industries, Tempe, AZ) para as oculares do microscópio de dissecação e iluminar o tecido com uma lanterna LED infravermelho. Para cortar e outros procedimentos que não são realizados sob o microscópio de dissecação, nós empregamos uma head-mounted image intensificador. Para a colocação das pipetas de correção, nós visualizamos fatias usando uma câmera CCD infravermelho sensível (por exemplo, Watec 502H, Watec Inc., Middletown, NY) montado na vertical, microscópio de fase fixa. Com estas precauções, pode-se obter respostas haste exibindo sensibilidade única fóton ^{6, 13.}

Uma limitação do trabalho em fatias retina é que os longos processos celulares de campo grandes neurônios da retina pode perder muitos de seus dendritos durante o processo de corte. Preparações fatia retinianas são, portanto, mais úteis para o estudo da fisiologia de células em que os contactos sinápticos envolvem processos para fechar o corpo da célula. Retinas de anfíbios e mamíferos compartilham muitos dos mesmos tipos de células e utilizar mecanismos fisiológicos semelhantes ^14-16. Enquanto salamandra retina é um bom modelo para muitos aspectos da retina dos mamíferos, uma diferença importante parece ser a presença de uma via de vareta dedicada em mamíferos que involves contatos de células especializadas haste bipolares em células amácrinas AII ^14. Uma limitação adicional da retina salamandra é o pequeno número de ferramentas genéticas desenvolvidas especificamente para esta espécie. No entanto, os anticorpos e reagentes que têm como alvo regiões shRNA bem conservados em outras espécies podem ser utilizadas com êxito na salamandra, como podem muitos inibidores de moléculas pequenas e reagentes peptídicos. Além disso, com algumas modificações na técnica, as fatias da retina podem ser preparados a partir de outras espécies em que algumas dessas ferramentas são mais prontamente disponíveis.

Para além da sua utilidade para o registo de células inteiras emparelhado, a preparação de retina salamandra fatia é também compatível com uma variedade de outras abordagens. Como discutido acima, as fatias da retina pode ser usado para estudar as respostas de luz em combinação com vários protocolos de fixador de tensão ^17. Neurónios da retina pode também ser carregada com corantes fluorescentes sensíveis ao ^{Ca2 +,} Cl ^-, ou Na+ Introduzido através da pipeta patch ou por banho-aplicação ^15,18-20. Um péptido fluorescente que se liga à fita ²¹ sináptica pode ser introduzido através da pipeta patch e utilizado para imagiologia da fita ^10, ou, quando conjugado com fluoresceína, para intensamente e selectivamente danificar a fita ^22. Temos também utilizado fatias de retina em combinação com pontos quânticos para monitorar os movimentos dos canais de cálcio individuais em haste e cone terminais sinápticos ^23. Assim, a fatia da retina vertical é uma preparação experimental versátil para o estudo dos mecanismos básicos sinápticas e as funções de processamento única realizadas na primeira sinapse, a via de sinalização visual.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue slicer	Stoelting	51425
Double edge razor blades	Ted Pella, Inc	121-6
Nitrocellulose membranes	Millipore	AAWP02500	Type AAWP 0.8 mm pore
Borosilicate glass pipettes	World Precision Instruments	TW120F-4	1.2mm OD 0.95 mm ID
Ag/AgCl pellet	Warner	E206
MicroFil	World Precision Instruments	MF34G-5	34 ga. Filling needle, 67 mm long