Eletrofisiológico Unidade Motor Número Estimação (MUNE) Medição Potencial Composto Muscle Ação (CMAP) nos músculos dos membros posteriores Rato

Resumo

Nós apresentamos protocolos que permitem refinados no monitoramento vivo da função motor no mouse. Técnicas para medir o potencial de ação muscular composto (CMAP) eo número de unidade motora de estimativa (MUNE) nos músculos dos membros posteriores do mouse inervados pelo nervo ciático são descritos.

Resumo

Compound muscle action potential (CMAP) and motor unit number estimation (MUNE) are electrophysiological techniques that can be used to monitor the functional status of a motor unit pool in vivo. These measures can provide insight into the normal development and degeneration of the neuromuscular system. These measures have clear translational potential because they are routinely applied in diagnostic and clinical human studies. We present electrophysiological techniques similar to those employed in humans to allow recordings of mouse sciatic nerve function. The CMAP response represents the electrophysiological output from a muscle or group of muscles following supramaximal stimulation of a peripheral nerve. MUNE is an electrophysiological technique that is based on modifications of the CMAP response. MUNE is a calculated value that represents the estimated number of motor neurons or axons (motor control input) supplying the muscle or group of muscles being tested. We present methods for recording CMAP responses from the proximal leg muscles using surface recording electrodes following the stimulation of the sciatic nerve in mice. An incremental MUNE technique is described using submaximal stimuli to determine the average single motor unit potential (SMUP) size. MUNE is calculated by dividing the CMAP amplitude (peak-to-peak) by the SMUP amplitude (peak-to-peak). These electrophysiological techniques allow repeated measures in both neonatal and adult mice in such a manner that facilitates rapid analysis and data collection while reducing the number of animals required for experimental testing. Furthermore, these measures are similar to those recorded in human studies allowing more direct comparisons.

Introdução

Número da unidade Motor estimativa (MUNE) foi originalmente descrito por McComas et al. mais de três décadas atrás ^1. A técnica original era uma modificação da técnica de gravação do potencial de ação muscular composto (CMAP), que empregou um aumento gradual de estimulação para obter incrementos submáximas. Estes incrementos foram somados e média para determinar um tamanho estimado de um potencial de unidade único motor (SMUP). Esta foi dividida em tamanho a resposta CMAP para estimar o número de unidades motoras que inervam o músculo a ser testado. Na sequência da descrição original, numerosas variações e com as duas reacções electrofisiológicas e força medições incrementais (mecânicos) têm sido utilizados em ambos os estudos humanos e modelos animais ^2. A técnica de MUNE foi modificado pela Shefner e colegas para investigar modelos de ratos com Esclerose Lateral Amiotrófica (ALS) ^{3, 4.}

Na descrição atual, detalhamos Simplifmodificações IED do MUNE técnicas que são rápidos para executar. Importante, CMAP e MUNE permitir medidas de confiança em ambos os ratos recém-nascidos e adultos ^5-8. Indivíduos experientes podem executar essas medidas em 10-20 min por animal, e medidas repetidas são viáveis ​​que permite a aquisição de dados longitudinais ^5. Nos estudos atuais, que empregam um sistema electrodiagnostic clínica. Em nossa experiência, os sistemas electrodiagnostic clínicos são otimizados para a captura rápida e eficiente de dados eletrofisiológicos in vivo, plataformas eletrofisiológicos no entanto padrão pode facilmente ser adaptado para esta aplicação.

Protocolo

Este protocolo foi aprovado pelo e segue as orientações de cuidados de animais e da ética da Ohio State University Medical Center Wexner.

1. Preparação Animal e Anestesia

1. Usar luvas durante o manuseio de ratos.
2. Anestesiar ratos com isoflurano inalado e coloque na posição prona. Induzir a anestesia utilizando 3-5% de isoflurano e 1 L por minuto _O 2 vazão. Após indução da anestesia, manter a anestesia em 2-3% e 1 L por minuto _de O2 caudal.
   1. Ajuste _O 2 fluxo e percentual isoflurano para anestesia adequada de acordo com estado de doença, idade e taxa de respiração do animal. Animais mais pequenos ou mais fracos podem exigir menos isoflurano para anestesia adequada (isto é, de 1,5 a 2,5% de isoflurano).
   2. Confirme anestesia adequada, aplicando pressão pata luz hindlimb com um objeto, como uma pinça para demonstrar a falta de resposta de retirada.;
3. Manter a temperatura a 37 ° C de temperatura de superfície com uma placa de aquecimento termostático como variação na temperatura pode afectar o tamanho e a duração CMAP.
4. Aplicar a pomada à base de petróleo veterinário para os olhos para prevenir o ressecamento. Monitorar o nível de anestesia observando taxa de respiração e avaliação para as respostas de retirada seguintes pressão aplicada à almofada do pé através de uma pinça.
5. Remover os pêlos da hindlimb a ser estudado usando cortadores. Após remoção dos pêlos do membro posterior (s) a ser estudado, levemente estender os membros posteriores no joelho, sequestre os quadris e apor a superfície de trabalho usando uma fita adesiva (como mostrado na Figura 1).
6. Após as gravações e descontinuação da anestesia CMAP e MUNE, não deixar animais sem vigilância até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Não devolva animal para a companhia de outros animais até que totalmente recuperado.

2. Recording Setup e Equipamentos

1. Coloque os eletrodos para as gravações CMAP e MUNE como retratado na Figura 1.
2. Use dois eletrodos finos anel para os eletrodos de registro.
   1. Coloque a (E1) do eléctrodo activo anel sobre a pele que recobre a porção proximal do músculo do gastrocnémio de membro posterior, na articulação do joelho, e o eléctrodo de referência (E2) do anel sobre a pele sobre a porção intermédia do metatarso do pé.
   2. A fim de reduzir a impedância, revestimento a pele subjacente aos eletrodos de anel com gel para cabelo suficientemente saturar residual e maximizar o contato eletrodo-pele. Evitar a aplicação excessiva de gel eletrodo, pois isso pode causar uma ponte eléctrica entre os eléctrodos e pode evitar uma gravação precisa.
3. Para a estimulação do nervo ciático no membro posterior proximal, use dois isolados 28 g agulhas monopolares como o cátodo eo ânodo. Inserir o cátodo na região da pata traseira proximal e inserir o anode mais proximalmente no tecido subcutâneo que recobre o sacro.
   1. Evite inserir os eletrodos que estimulam excessivamente perto do nervo ciático ou muito profundas que iria diretamente lesão do nervo ciático ou outra estrutura. A figura 1 ilustra a colocação do eletrodo.
4. Para o eletrodo terra, coloque um eletrodo de superfície descartável no membro posterior contralateral ou cauda.

3. Aquisição de Dados

1. CMAP ciático
   1. Obter respostas CMAP ciático, estimulando o nervo ciático com pulsos de onda quadrada de 0,1 ms de duração e intensidade variando de 1-10 mA.
   2. Adquirir respostas CMAP com o aumento da intensidade do estímulo até que a amplitude da resposta não aumenta mais. Em seguida, a fim de assegurar a estimulação supramáxima, aumentar a estimulação de ~ 120% da intensidade do estímulo utilizado para se obter uma resposta máxima e obter uma resposta adicional. Se não há é aumentar ainda mais in o tamanho CMAP, gravar esta resposta como a CMAP máxima.
   3. Ficha de linha de base a pico e pico-a-pico amplitudes CMAP em mV (Figura 2).
2. Média Individual Potencial Unidade de Motor (SMUP) Tamanho e MUNE Cálculo
   1. Determine o tamanho médio potencial unidade do motor único (SMUP) com uma técnica de estimulação ¹ adicional. Para obter respostas incrementais, entregar estimulação submáxima de duração 0,1 ms a uma frequência de 1 Hz, aumentando a intensidade em 0,03 mA passos para obter as mínimas tudo-ou-nada respostas. Obter a resposta inicial com intensidade do estímulo entre 0,21 mA e 0,70 mA.
      1. Se a resposta inicial não ocorrer com uma intensidade de estímulo entre 0,21 mA e 0,70 mA, ajustar a posição do cátodo estimulante mais próximo ou mais distante da posição do nervo ciático na coxa proximal para diminuir ou aumentar a intensidade do estímulo necessário, respectivamente.
      2. Se o i inicialncremental resposta é obtida com a intensidade do estímulo entre 0,21 mA e 0,70 mA e preenche os critérios indicados abaixo (3.2.2), armazenar e gravar incrementos adicionais com o aumento da intensidade de estímulo de ajuste em passos de 0,03 mA para obter um total de 9 incrementos adicionais que preencham os critérios estabelecidos.
   2. Durante as medições das respostas incrementais, garantir que cada incremento atenda aos seguintes critérios.
      1. Assegure-se que o pico inicial negativa das respostas incrementais está alinhado temporalmente dentro do pico negativo da resposta máxima CMAP mostrado como a parte sombreada da ilustração CMAP na Figura 2.
      2. Certifique-se que cada resposta incremental é estável e sem fracionamento, estabelecida pela observação três respostas duplicadas. Distinguir visualmente as respostas incrementais em tempo real (sobrepõem-se aos incrementos registrados anteriormente).
         Nota: Cada incremento deverá ser visualmente distintae maior em comparação com a resposta anterior (Figura 3). Análise em tempo real permite o reconhecimento de maior amplitude (incrementais) respostas comparadas com as respostas anteriores, e pequenas mudanças atribuíveis ao ruído de fundo pode ser desconsiderada. Uma vista sobreposta incrementos de 10 é mostrado na Figura 4 (B e D) para ilustrar ainda mais este ponto.
      3. Depois de confirmar visualmente cada incremento, garantir que a diferença de amplitude medido (confirmado resposta de amplitude da resposta antes = diferença de amplitude) é de pelo menos 25 mV.
      4. Se o incremento é inferior a 25 mV, e descartar re-medir a resposta. Depois de gravar 10 respostas incrementais, avaliar os incrementos para assegurar que a amplitude de cada resposta periódica indivíduo não é superior a 1/3 da soma de todos os incrementos de dez (isto é, a amplitude total da resposta final). Se esta condição não for atendida, re-medir as respostas incrementais.
   3. Calcular a média dos 10 valores incrementais para dar uma estimativa do potencial de unidade do motor único (SMUP) amplitude média (Figura 3). Nota: A Figura 3 detalha a base do cálculo da média SMUP, mas a amplitude média SMUP pode ser simplesmente calculado dividindo-se toda a amplitude da resposta periódica final pelo número total de incrementos (por exemplo, 10).
      Exemplo SMUP cálculos individuais (ilustrado na figura 3):
      SMUP 1 = amplitude pico-a-pico de incremento de 1
      SMUP 1 = 0,050 mV
      SMUP 2 (amplitude de pico-a-pico de incremento 2) = - (amplitude do incremento de pico-a-pico 1)
      SMUP 2 = 0,150 mV-0.050 mV = 0,100 mV
      1. Calcule cada aumento subsequente (até um total de 10), e fazer uma média dos incrementos de dez.
   4. Calcular MUNE dividindo a amplitude máxima CMAP (pico-a-pico) pela amplitude média SMUP (pico-a-pico). (MUNE = CMAP / SMUP média). Em alguns sistemas electrofisiológicas, os incrementos SMUP são medidas em mV Considerando que CMAP é tipicamente fornecida em mV. Quando necessário, converter resultados CMAP e SMUP para unidades similares anteriores ao cálculo MUNE.

Resultados

As técnicas de CMAP e MUNE descrito neste relatório permitem o registo da função neuromuscular dos músculos dos membros posteriores ciáticos inervado utilizando a colocação do eléctrodo minimamente invasiva (figura 1). Supramáxima CMAP tamanho, o que representa a produção total de um grupo muscular, pode ser descrito utilizando os parâmetros de amplitude e área (Figura 2), no entanto, nos métodos correntes, usamos amplitude para quantificar a CMAP e os tamanhos SMUP. Uma vez que as medidas de resposta CMAP summated despolarização das fibras musculares dentro de um músculo, patologia em qualquer lugar do neurónio motor para a fibra muscular pode resultar na redução do tamanho CMAP. Portanto, CMAP dá uma excelente medida do estado funcional total. Como esperado, o tamanho CMAP irá aumentar durante o desenvolvimento ^5. Devido a mudanças compensatórias que podem ocorrer após a desnervação (ou seja, garantia de germinação), tamanho CMAP podem ser mantidas apesar processos de neur do motorou perda axonal motora. Portanto, a técnica de MUNE é necessário para determinar o neurónio motor axon entrada ou ao músculo ou grupo de músculos que estão sendo testadas. Gravação de incrementos individuais (Figura 3) permite estimar a produção média de unidades motoras individuais (tamanho SMUP) para dar informações mais detalhadas sobre o estado funcional das unidades motoras.

CMAP MUNE e pode ser utilizado para medir a função neuromuscular em vários modelos de rato de doença neuromuscular. Na Figura 4, conclusões de um rato controle de adultos e um rato adulto 11 semanas após esmagamento do nervo ciático são contrastados. Na sequência de esmagamento do nervo ciático, MUNE é severamente reduzida a 50 unidades motoras funcionais estimadas em comparação com resultados normais de 278 unidades motoras funcionais no rato controle. Em contraste, a amplitude de CMAP no animal esmagado (39,6 mV linha de base-a-pico, 74,9 mV pico-a-pico) mostra apenas uma redução ligeira em comparação com o controlo (49,0 mV a linha de base--Pico, 84,2 mV pico-a-pico), devido à garantia de germinação.

Figura 1. Colocação de eletrodos. O preto (E1) eletrodo "ativo" (A) e vermelha (E2) eletrodo "referência" de gravação (B) são colocadas sobre o gastrocnêmio na porção proximal do gastrocnêmio no joelho. O estimulante cátodo (preto) (C) e o ânodo (vermelho) (D) são inseridos subcutaneamente proximal para os eléctrodos de registo para gerar respostas distais. Um eletrodo de disco descartável (D) é colocado no membro, cauda ou sacro posterior como um terreno para minimizar artefato. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Composto potencial de acção do músculo. Na foto é uma ilustração de uma resposta representativa CMAP. (A) A amplitude da linha de base-a-pico é medida a partir da linha de base isoeléctrico para o pico negativo inicial (tensão negativa é representado acima da linha de base). ( B) A amplitude pico-a-pico é medida a partir da tensão de pico negativo para pico de voltagem positiva. A área a cinzento indica a área de pico negativo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Respostas incrementais. Duas respostas incrementais representativos são mostrados sobrepostos e em Isolação. Para amplitudes de cálculo MUNE de cada incremento são medidos pico-a-pico. Incremento # 1 é a primeira tudo-ou-nada resposta registada e representa um potencial única unidade motora (SMUP). Cada incremento subsequente (# 2-10) representa um aumento quantal sobreposta sobre a resposta anterior. Portanto, para obter as amplitudes SMUP para incrementos de 2-10, a amplitude da resposta anterior é subtraído da amplitude do incremento obtido. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Exemplo ciático CMAP e MUNE. (A) potencial de ação muscular composto ciático (CMAP) em um adulto (6 meses de idade) do mouse controle com amplitude da linha de base a pico de 49,0 mV e pico-a-amplitude do pico de 84,2 mV. Sensibilidade da tela = 10 mV por divisão e duração ecrã 10 ms. (B) Dez correspondentes respostas incrementais (no rato controle) com amplitude total de 3,028 mV são divididos por 10 para determinar o tamanho médio SMUP (0,3028 mV). Sensibilidade da tela = 0,5 mV e velocidade de varredura de 1 ms por divisão. Calculado MUNE = 278 (MUNE = CMAP / SMUP média (84,2 mV / 0,3028 mV)) (C) ciático CMAP 11 semanas seguintes esmagamento do nervo isquiático de um rato adulto (6 meses de idade), mostrando ligeira redução da amplitude da linha de base a pico ( 39,6 mV) e a amplitude pico-a-pico (74,9 mV). Sensibilidade da tela = 10 mV por divisão e velocidade de varredura de 1 ms por divisão. (D) Ten correspondente respostas incrementais (no rato com esmagamento do nervo), com amplitude total do pico-a-pico de 14,923 mV dividido por 10 para obter uma SMUP média tamanho de 1,4923 mV. Sensibilidade da tela = 2 mV por divisão e uma velocidade de varredura de 1 ms por divisão. Calculado MUNE = 50 (MUNE = CMAP/ SMUP média (74,9 mV / 1,4923 mV)). (** Observe a sensibilidade diferente para as respostas incrementais do mouse esmagamento ciático). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

MUNE e CMAP são medidas clinicamente relevantes freqüentemente utilizados em estudos de investigação e no monitoramento de pacientes com doenças neuromusculares, como a ALS e atrofia muscular espinhal (AME) ^{9, 10.} Por exemplo, no SMA, CMAP e MUNE correlacionam-se bem com a idade, gravidade e clínica medidas de função ^10-14. Ambas as medidas são minimamente invasivos e permitir a avaliação da função longitudinalmente no mesmo indivíduo. É importante ressaltar que estas medidas não se pode medir a ativação ou recrutamento da unidade motora por neurônios do córtex motor, mas eles fornecem uma avaliação clinicamente relevante da integridade do neurônio motor eo seu homólogo funcional, a unidade do motor.

Os modelos animais de doença neuromuscular são críticas para a compreensão dos mecanismos patogénicos da doença humana e para o desenvolvimento pré-clínico de agentes terapêuticos potencialmente eficazes. A capacidade de traduzir medidas de resultados e biomarcadores que podem serutilizado em várias espécies podem facilitar e acelerar a concretização dos resultados pré-clínicos promissores para testes clínicos em humanos. Vários grupos já utilizou as duas medidas eletrofisiológicas e de força (mecânicos) para estimar função unidade do motor em modelos do rato ^{2-4, 15-22.} Devido à relativa complexidade das medidas, temos refinado estas técnicas em um formato visual para permitir o uso mais disseminado e implementação em camundongos. O formato de vídeo de demonstração e instrução, permite principais etapas do procedimento a ser destacado e potenciais armadilhas a serem abordados. A aplicação destas técnicas para testes pré-clínicos de terapias potenciais em doenças motoras neuronais pode melhorar a tradução de terapias putativos dos ratos para a doença humana.

Há vários passos críticos no processo de aquisição das respostas CMAP e MUNE. A colocação do eletrodo de gravação adequada e consistente e contato suficiente com o eletrodo traseiramembro são críticos para a medição da amplitude e reprodutível para diminuir o ruído de fundo. Portanto, um contacto estreito entre traseira da pele do membro e eletrodos devem ser consistentemente confirmado. Descobrimos que eletrodos de superfície oferecem mais consistentes gravações CMAP e MUNE do que eletrodos de agulha. Devido aos tecidos subcutâneos muito finos, pequenos movimentos da superfície de gravação agulha pode levar a grande variação na amplitudes CMAP. Além disso, a natureza mais invasiva de eletrodos de agulha não é o ideal para os ratos neonatais ou estudos longitudinais devido ao rompimento potencial muscular e lesões. Uma desvantagem potencial de eléctrodo de superfície, gravações não selectivos relaciona-se com a possibilidade de resolução fenótipo enfraquecidas se um músculo em particular é mais ou menos envolvido em comparação com outro, e esta tem sido relatada em um modelo de ratinho de ALS ^21.

Adquirir o tamanho médio SMUP é tecnicamente mais difícil em comparação com a CMAP. Devido às menores responsTamanho E (na gama de mais do que mV mV) o ruído de fundo pode ser mais problemático. O ruído de fundo pode ser reduzido, ajustando o eletrodo terra, cátodo, ânodo, e verificando outros equipamentos eléctricos perto da configuração experimental. Uma gaiola de Faraday, normalmente utilizados para aplicações de electrofisiologia intracelulares, não é necessária. A determinação visual das respostas SMUP individuais é a habilidade mais difícil de adquirir e requer prática para resultados consistentes com repetibilidade adequada. É importante assegurar que as SMUPs que estão a ser gravados iniciar dentro da duração da resposta máxima CMAP. Nós definimos critérios para a aceitação de respostas incrementais individuais para tornar esse processo mais simples de executar e para aumentar a confiabilidade intra e inter-avaliadores.

Uma desvantagem potencial da técnica MUNE incrementais inclui a possibilidade de superestimar o número de unidades motoras funcionais devido a alternância de motounidades r. Nós usamos uma técnica semelhante para Shefner et al. em que cada resposta deve ser visto de forma reprodutível um total de 3 vezes para reduzir o impacto deste fenómeno ^3.

Em nossa experiência, os sistemas electrodiagnostic clínicos são otimizados para os estudos aqui descritos devido à ergonomia melhorada interface do sistema examinador-electrodiagnostic permitindo facilidade de controle. O sistema de dois canais, utilizados no nosso laboratório está equipado com dois canais não comutado amplificador usando um amplificador com 24 bits conversor analógico para digital e uma taxa de amostragem de 48 kHz por canal. Ganho de Hardware pode ser ajustado de 10nV a 100 mV / divisão. O filtro de baixa freqüência tem um alcance de 0,2 Hz-5 kHz, e as configurações de filtro de alta freqüência variar de 30 Hz-10 kHz. Um estimulador de corrente constante é usada (intensidade: 0-100 mA; duração: 0,02-1 ms). A maioria dos sistemas clínicos têm características apropriadas semelhantes e pode ser ajustado para gravar adequadamente CMAP e MUNE respostas. UMAdditionally, sondas electrofisiológicos padrão podem ser montadas adequadamente para gravar e CMAP MUNE, mas a interface pode necessitar de ser ajustada para facilitar o ajuste da estimulação e a rápida identificação de CMAP SMUP e respostas.

Temos anteriormente utilizadas as técnicas de CMAP e MUNE descrito aqui para permitir a avaliação rápida e reprodutível do ciático muscular inervado do membro posterior em ratos durante o período pós-natal precoce para a idade adulta ^5. Estas técnicas permitem a avaliação em modelos do rato quando o teste comportamental para a função motora não é viável ou é menos confiável. A aplicação desta técnica para ratos neonatal facilita o estudo do desenvolvimento da unidade motora e tem o potencial para expandir nossa compreensão da inervação do neurônio motor e poda. Por exemplo, demonstramos que o número de unidades motoras funcionais gravados com MUNE irá aumentar durante a poda de polyneuronal a inervação mononeuronal durante as duas primeiras semanass de vida em ratos neonatal ^5. A capacidade para testar ratinhos durante longos períodos de tempo com esta técnica presta-se para o estudo da resposta da unidade motora para a lesão do nervo periférico, distúrbios neuromusculares hereditárias e envelhecimento.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pro trimmer Pet Grooming Kit	Oster	078577-010-003	clippers for hair removal
Synergy T2 EMG system	Natus Neurology	Model no longer available	portable electrodiagnostic system
monopolar needles 28 G	Teca	017K121	cathode and anode stimulating electrodes
Alpine Biomed Digital Ring Electrode with twisted wires and 1.5 mm TP connectors.	Alpine Biomed	9013S0312	recording electrodes
Helping Hands alligator clip with iron base	Radio Shack	64-079	Maintaining recording electrode placement
Spectra 360 Electrode Gel	Parker Laboratories	9013G5012	applied to reduce skin impedance
monoject curved tip irrigating syringe	Covidien	81412012	utilized for application of electrode gel
EMG needle cable	Teca	902-RLC-TP	to connect monopolar electrodes to electrodiagnostic stimulator
Disposable 2" x 2" Electrode or similar trimmed as needed	Carefusion	019-415000	ground electrode
Small Heating Plate with built-in RTD sensor, 15 x10 cm	World Precision Instruments	61830	warming plate used with animal temperature controller to transmit heat to animal
Silicone pad for use with ATC2000	World Precision Instruments	503573	conductive removable pad to cover warming plate for easy cleaning
Animal temperature controller	World Precision Instruments	ATC2000	low noise animal heating system for maintaining animal temperature
Veterinarian petroleum-based ophthalmic ointment	Puralube	26870	applied during anesthesia to avoid corneal injury