Электрофизиологические двигателя Блок Количество Оценка (MUNE) Измерение Соединение мышц потенциала действия (CMap) у мыши задних конечностей Мышцы

Резюме

Мы представляем изысканные протоколы, которые позволяют в естественных условиях мониторинга двигательных единиц функции в мыши. Методы измерения соединение мышцы потенциал действия (CMap) и оценку номер блока двигателя (MUNE) в мышь задних мышц конечностей, иннервируемых седалищного нерва описаны.

Аннотация

Compound muscle action potential (CMAP) and motor unit number estimation (MUNE) are electrophysiological techniques that can be used to monitor the functional status of a motor unit pool in vivo. These measures can provide insight into the normal development and degeneration of the neuromuscular system. These measures have clear translational potential because they are routinely applied in diagnostic and clinical human studies. We present electrophysiological techniques similar to those employed in humans to allow recordings of mouse sciatic nerve function. The CMAP response represents the electrophysiological output from a muscle or group of muscles following supramaximal stimulation of a peripheral nerve. MUNE is an electrophysiological technique that is based on modifications of the CMAP response. MUNE is a calculated value that represents the estimated number of motor neurons or axons (motor control input) supplying the muscle or group of muscles being tested. We present methods for recording CMAP responses from the proximal leg muscles using surface recording electrodes following the stimulation of the sciatic nerve in mice. An incremental MUNE technique is described using submaximal stimuli to determine the average single motor unit potential (SMUP) size. MUNE is calculated by dividing the CMAP amplitude (peak-to-peak) by the SMUP amplitude (peak-to-peak). These electrophysiological techniques allow repeated measures in both neonatal and adult mice in such a manner that facilitates rapid analysis and data collection while reducing the number of animals required for experimental testing. Furthermore, these measures are similar to those recorded in human studies allowing more direct comparisons.

Введение

Мотор номер блока оценки (MUNE) первоначально был описан МакКомас др. более трех десятилетий назад. ¹ Оригинальный метод был модификацией потенциал соединение мышцы действие (СМАР) техники записи, где работал постепенное увеличение стимуляции, чтобы получить субмаксимальные приращения. Эти приращения были подведены и в среднем для определения прогнозируемый размер единичного потенциала одного двигателя (СМУП). Этот размер был разделен на ответ СМАР оценить количество моторных единиц, иннервирующих мышцы проходят испытания. После первоначального описания, многочисленные вариации, используя оба электрофизиологические ответы и инкрементное силы (механические) измерения были использованы в обоих клинических исследованиях на животных моделях и ^2. Техника MUNE был изменен Шефнера и коллег, чтобы исследовать модели мыши боковой амиотрофический склероз (БАС) ^{3, 4.}

В текущем описании, мы подробно simplifСВУ модификации методов MUNE, которые быстро выполнить. Важно отметить, что СМАР и MUNE позволяют надежные меры в обоих новорожденных и взрослых мышей ^5-8. Опытные люди могут выполнять эти меры в 10-20 мин на одно животное, и повторные измерения возможны, который позволяет приобретение продольных данных ^5. В нынешних исследованиях, мы используем клиническую электродиагностических системы. По нашему опыту, клинические электродиагностических системы оптимизированы для быстрого и эффективного захвата электрофизиологических данных в естественных условиях, тем не менее, стандартные электрофизиологические установок может быть легко адаптирована для этого приложения.

протокол

Этот протокол был одобрен и придерживается принципов по уходу за животными и этики университета Wexner медицинского центра штата Огайо.

1. Подготовка животных и анестезии

1. Надевайте перчатки при работе мышей.
2. Обезболить мышей с вдыхаемым изофлураном и место в положении лежа. Вызвать анестезии с использованием 3-5% изофлуран и 1 л на расходе минут _O 2. После вводного наркоза, поддержания анестезии в 2-3% и 1 л на расходе минут _O 2.
   1. Отрегулируйте _O 2 потока и процент ИФ адекватных анестезии в соответствии с государственным заболевания, возраста и частоты дыхания животного. Меньшие или слабые животные могут потребовать меньше изофлуран для адекватного обезболивания (т.е. 1,5- 2,5% ИФ).
   2. Подтвердите адекватной анестезии с применением светового давления подушечку задней конечности с объектом, например, пинцетом, чтобы продемонстрировать отсутствие ответа отмены.;
3. Поддержание температуры при 37 ° С температуры поверхности с термостатическим потепления пластины как изменение температуры может влиять на размер и продолжительность CMAP.
4. Применить ветеринар нефтяной основе мазь для глаз, чтобы предотвратить сухость. Монитор уровень анестезии наблюдения частота дыхания и оценки для ответов отмены следующих приложенного к подушечку лапы с помощью щипцов давления.
5. Удалить волосы с задней конечности, чтобы быть изучены с помощью машинки для стрижки. После удаления волос от задних конечностей (ы), чтобы быть изучены, слегка расширить задних конечностей в колене, похищать у бедер и прикрепить к рабочей поверхности с помощью клейкой ленты (как показано на рисунке 1).
6. После CMap и MUNE записей и прекращения анестезии, не оставляйте без присмотра животное, пока он не восстановил достаточную сознание поддерживать грудины лежачее положение. Не вернуться животное в компании других животных до полного восстановления.

2. Recording установки и оборудование

1. Поместите электроды для записи CMap и MUNE как изображено на рисунке 1.
2. Используйте два прекрасных кольцевых электродов для регистрирующих электродов.
   1. Поместите активную (E1) кольцевой электрод на коже, покрывающей проксимальную часть икроножной мышцы задней конечности, в коленном суставе, и ссылка (Е2) кольца электрода на кожу над среднесрочной плюсневой части стопы.
   2. Для того чтобы уменьшить сопротивление, покрытие кожи, лежащий в основе кольцевыми электродами с гелем, чтобы насытить достаточно остаточного волосы и максимизировать контакт электрода с кожей. Избегайте чрезмерного применения электродов геля, так как это может привести к поражению электрическим мост между электродами и может помешать точному запись.
3. Для стимуляции седалищного нерва на проксимальном задней конечности, используют два изолированных 28 г монополярных иглы как катодом и анодом. Вставьте катод в области проксимальной задней конечности и вставьте АНОде проксимальнее в подкожной ткани, покрывающий крестец.
   1. Избегайте вставки стимулирующие электроды слишком близко к седалищного нерва, или слишком глубоко, что было бы непосредственно травмы седалищного нерва или другая структура. Рисунок 1 иллюстрирует размещение электрода.
4. Для основного электрода, разместить одноразовый поверхности электрода на противоположной задней конечности или хвоста.

3. Сбор данных

1. Седалищного СМАР
   1. Получить седалищного ответов CMap стимулируя седалищный нерв с прямоугольными импульсами 0,1 мс и интенсивностью в диапазоне от 1-10 мА.
   2. Приобретать ответов CMap с увеличивая интенсивность стимула до амплитуды отклика больше не увеличивается. Затем, для того, чтобы обеспечить сверхмаксимальном стимуляции, увеличивают стимуляцию до ~ 120% от интенсивности стимула, используемого для получения максимального ответа и получить дополнительную реакцию. Если нет дальнейшего увеличения не яп размер СМАР, запишите этот ответ как максимальной CMAP.
   3. Запись базовой до пика и пика до пика CMap амплитуд в мВ (рис 2).
2. Нормальное двигателя Блок потенциал (СМУП) Размер и MUNE Расчет
   1. Определить среднюю одиночный моторесурс (СМУП) размер с дополнительных техники стимуляции ^1. Чтобы получить дополнительные ответы, доставить субмаксимальную стимуляции 0,1 мс при частоте 1 Гц, а увеличение интенсивности в 0,03 мА шагов, чтобы получить минимальные все или ничего ответов. Получить первоначальный ответ с интенсивностью стимула между 0,21 мА и 0,70 мА.
      1. Если первоначальная реакция не происходит с интенсивностью стимула между 0,21 мА и 0,70 мА, отрегулируйте положение катодного стимулирующее либо ближе или дальше от позиции седалищного нерва в проксимальной бедра, чтобы уменьшить или увеличить требуемый интенсивности стимула, соответственно.
      2. Если начальный Incremental ответ получен с интенсивности стимула между 0,21 мА и 0,70 мА и соответствует критериям, отмеченные ниже (3.2.2), магазин и записать дополнительные приращения при увеличении интенсивности стимула регулировочные с шагом 0,03 мА, чтобы получить в общей сложности 9 дополнительных шагом, что отвечают установленным критериям.
   2. Во время измерений дополнительных ответов, убедитесь, что каждое приращение отвечает следующим критериям.
      1. Убедитесь, что начальное отрицательное пик дополнительных ответов выравнивается по времени в течение отрицательного пика максимальной ответ СМАР показано, как затененной части иллюстрации СМАР на рисунке 2.
      2. Убедитесь, что каждый инкрементальный ответ стабильно и без фракционирования, установлено, наблюдая три повторяющихся ответов. Различают визуально дополнительные ответы в режиме реального времени (накладывается на ранее записанных с шагом).
         Примечание: Каждое приращение должно быть визуально отличаетсяи больше по сравнению с предыдущим ответом (рис 3). Анализ в режиме реального времени позволяет признание большей амплитудой (дополнительных) ответов по сравнению с предыдущими ответами, и небольшие изменения, связанные с фоновым шумом можно пренебречь. Наложенного вид с шагом 10 показана на фиг.4 (Б и Г), чтобы проиллюстрировать эту точку.
      3. После визуального подтверждения каждого приращения, убедитесь, что измеряемая амплитуда разница (подтверждено ответ-амплитуда предварительного ответ = амплитуда разница) составляет не менее 25 мкВ.
      4. Если приращение составляет менее 25 мкВ, отбросить и заново измерить реакцию. После записи 10 инкрементных ответов, оценки приращения для того, чтобы амплитуда каждого отдельного дополнительных ответа не превышает 1/3 от суммы всех приращений десяти (т.е. полной амплитуды окончательного ответа). Если это условие не выполняется, повторно измерить дополнительные ответы.
   3. Среднее значение на 10 дополнительные значения, чтобы дать оценку средней одиночный моторесурс (СМУП) амплитуды (рисунок 3). Примечание: На рисунке 3 детали в основу расчета средней СМУП, но средняя амплитуда СМУП можно вычислить путем деления всей амплитуды конечного дополнительных ответ на общее количество приращений (например, 10).
      Пример отдельные расчеты СМУП (показано на рисунке 3):
      СМУП 1 = пик-пик амплитуда приращения 1
      СМУП 1 = 0,050 мВ
      СМУП 2 = (пик-пик амплитуда приращения 2) - (пик-пик амплитуда приращения 1)
      СМУП 2 = 0,150 мВ-0,050 мВ = 0,100 мВ
      1. Рассчитать каждое последующее приращение (в общей сложности до 10), и сделать в среднем из десяти шагом.
   4. Рассчитать MUNE путем деления максимальной амплитуды CMAP (от пика до пика) по средней амплитуды СМУП (пик-пик). (MUNE = СМАР / средняя СМУП). В некоторых электрофизиологических систем, приращения СМУП измеряются в мкВ тогда СМАР обычно обеспечивается в мВ. При необходимости, конвертировать CMap и СМУП результаты аналогичных единиц, предшествующих расчета MUNE.

Результаты

Методы CMAP и MUNE описано в настоящем докладе позволяют записывать нервно-мышечной функции седалищного иннервируются мышцы задних конечностей с использованием малоинвазивных размещение электрода (рисунок 1). Сверхмаксимальном СМАР размер, который представляет собой общий объем от группы мышц, может быть описано с помощью параметров амплитуды и площади (рис 2), однако, в настоящее время методов, мы используем амплитуду количественно CMap и размеры СМУП. Поскольку меры реагирования CMAP суммируется деполяризацию мышечных волокон в мышце, патология в любом из двигательного нейрона к мышечного волокна может привести к уменьшению размера СМАР. Таким образом, СМАР дает отличный показатель общего функционального состояния. Как и ожидалось, размер СМАР увеличится в процессе разработки ^5. В связи с компенсационными изменений, которые могут произойти следующее денервацию (т.е. обеспечение прорастания), размер СМАР может поддерживаться, несмотря на процессы двигателя Neurили потери в электродвигателе аксонов. Таким образом, методика MUNE требуется определить мотонейрона или вход аксона к мышце или группе мышц проходит испытания. Запись отдельных шагом (рис 3) позволяет оценить среднюю мощность одного двигательных единиц (размер СМУП), чтобы дать более подробную информацию о функциональном состоянии двигательных единиц.

СМАР и MUNE могут быть использованы для измерения нервно-мышечной функции в различных мышиных моделях нервно-мышечных заболеваний. На рисунке 4, выводы в контрольной взрослых мышей и взрослой мыши 11 недель следующим седалищного нерва давка противопоставляются. После седалищного нерва давка, MUNE сильно уменьшается в 50 расчетных функциональных двигательных единиц по сравнению с нормальными результатами 278 функциональных двигательных единиц в контрольной мыши. В противоположность этому, амплитуда СМАР в измельченной животного (39,6 мВ базовый до пика, 74,9 мВ от пика до пика) показывает только умеренную снижение по сравнению с контролем (49,0 мВ базовый к-пик, 84,2 мВ от пика до пика) в связи с залоговой прорастания.

Рисунок 1. Электрод Размещение. Черный (E1) "активный" электрод (А) и красный (Е2) "опорного" записи электрод (В) помещают над икроножной в проксимальной части икроножной в колене. Стимулирующая катод (черный) (С) и анод (красный) (D) вводятся подкожно проксимально к записи электродов для генерирования дистальных ответов. Одноразовый дискового электрода (D), находится на задней конечности, хвост или крестца в землю, чтобы свести к минимуму артефакт. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

всегда
Рисунок 2. Соединение мышц потенциала действия. Изображенный является иллюстрацией представительной ответ СМАР. (А) Амплитуда базового до пика измеряется от изоэлектрической линии до начальной отрицательного пика (отрицательное напряжение изображен выше базовой линии). ( Б) Амплитуда пика до пика измеряется от отрицательного пикового напряжения к положительному пикового напряжения. Серо-заштрихованная область обозначает негативное площадь пика. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3. Дополнительные ответы. Два представительных дополнительные ответы приведены наложенные в Isolaния. Для расчета MUNE амплитуд каждого приращения измеряются пик-пик. Прирост # 1 начальная все или никто ответа не записывается и представляет собой единичную моторесурс (СМУП). Каждый последующий прирост (# 2-10) представляет собой квантовую увеличение накладывается на предшествующий ответ. Поэтому, чтобы получить амплитуды СМУП для приращений 2-10, амплитуда предварительного ответ вычитается из амплитуды приращения получены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4. Пример седалищного СМАР и MUNE. (А) седалищного соединение мышцы потенциал действия (СМАР) у взрослых (в возрасте 6 месяцев) контроль мышь с базовой до пика амплитуды 49,0 мВ и пиковой-To-максимальная амплитуда 84,2 мВ. Чувствительность экрана = 10 мВ на деление и продолжительность экран 10 мс. (Б) Десять соответствующие дополнительные ответы (в контрольной мыши) с общей амплитудой 3.028 мВ делятся на 10, чтобы определить, средний размер СМУП (0,3028 мВ). Чувствительность экрана = 0,5 мВ и скорости развертки 1 мс на деление. Расчетное MUNE = 278 (MUNE = СМАР / средняя СМУП (84,2 мВ / 0,3028 мВ)) (С) седалищного СМАР 11 недель после седалищного давке нерва в взрослой мыши (6-месячного возраста), показывающие мягко снижение амплитуды базовой до пика ( 39,6 мВ) и пик-пик амплитуда (74,9 мВ). Чувствительность экрана = 10 мВ на деление и скорости развертки 1 мс на деление. (D) Десять соответствующие дополнительные ответы (в мыши с нерва давка) с общей амплитудой от пика до пика 14.923 мВ разделенной на 10, чтобы получить среднюю СМУП размер 1.4923 мВ. Чувствительность экрана = 2 мВ на деление и скорость развертки 1 мс на деление. Расчетное MUNE = 50 (MUNE = СМАР/ средняя СМУП (74,9 мВ / 1,4923 мВ)). (** Обратите внимание на различную чувствительность для дополнительных ответов седалищного раздавить мышь). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

MUNE и СМАР клинически соответствующие меры часто используются в научных исследованиях и в мониторинге пациентов с нервно-мышечными расстройствами, такими как ALS и спинальной мышечной атрофии (SMA) ^{9, 10.} Например, в SMA, СМАР и MUNE хорошо коррелируют с возрастом, тяжести и клинических Меры функции ^10-14. Обе эти меры минимально инвазивной и позволяют оценить функции в продольном направлении в той же особи. Важно отметить, что эти меры не могут измерить активацию или набор блока электродвигателя по корковых двигательных нейронов, но они обеспечивают клинически соответствующую оценку целостности двигательного нейрона и его функционального аналога, блок двигателя.

Животные модели нервно-мышечных заболеваний имеют решающее значение для понимания патогенетических механизмов заболевания человека и на доклинической разработки потенциально эффективных терапевтических средств. Возможность перевести меры результата и биомаркеров, которые могут бытьиспользовать разных видов могут облегчить и ускорить перевод перспективных доклинических выводах клинических испытаний. Несколько групп ранее использовали как электрофизиологические и сила (механические) измерения для оценки двигательной функции блока в мышиных моделях ^{2-4, 15-22.} Из-за относительной сложности мер, мы усовершенствовали эти методы в визуальном формате, чтобы более широкого использования и реализации на мышах. Формат видео демонстрации и обучения, позволяет ключевым этапы процедуры будут выделены и возможные подводные камни, которые будут рассмотрены. Применение этих методов в доклинических испытаний потенциальных методов лечения в нейронных заболеваний двигательных может улучшить перевод предполагаемых лечения от мышей до человека болезни.

Есть несколько важных шагов в процессе приобретения ответов CMap и MUNE. Правильное и последовательное размещение электродов записи и достаточно контактный электрод с ланьюконечности имеют решающее значение для воспроизводимого измерения амплитуды и уменьшения фонового шума. Таким образом, тесный контакт между задней кожи конечностей и электроды должны быть последовательно подтверждены. Мы обнаружили, что поверхностные электроды предложить более последовательные и CMap MUNE записи, чем игольчатых электродов. В связи с очень тонкими подкожных тканей, мелкие движения иглы поверхности могут привести к широкой вариации в CMap амплитуд. Кроме того, более инвазивных характер игольчатых электродов не является оптимальным для новорожденных мышей или продольных исследований в связи с нарушением мышечного потенциала и травмы. Один потенциальный недостаток неселективных, поверхности электрода записей относится к возможности уменьшенной разрешением фенотипа, если конкретный мышцы более или менее вовлечены в сравнении с другой, и это было сообщено в модели ALS мыши ^21.

Приобретение средний размер СМУП технически более сложным по сравнению с CMAP. Из-за небольших RESPONSРазмер электронной (в диапазоне мкВ, а не мВ) фонового шума может быть более проблематичным. Фоновый шум может быть уменьшен путем регулировки заземляющий электрод, анод, катод и проверки другое электрооборудование рядом с экспериментальной установки. Клетка Фарадея, как правило, используется для внутриклеточных электрофизиологических приложений, не требуется. Визуальное определение отдельных ответов СМУП является самым трудным умение приобретать и требует практики для получения стабильных результатов с надлежащей повторяемости. Важно, чтобы гарантировать, что SMUPs, что в процессе записи инициировать в пределах продолжительности максимального ответа СМАР. Мы определили критерии для принятия индивидуальных дополнительных ответов, чтобы этот процесс более простым для выполнения и повысить надежность внутри- и между оценщик.

Один потенциальный недостаток в дополнительных техники MUNE включает возможность переоценить количество функциональных двигательных единиц в связи с чередованием мотог единиц. Мы использовали методику, аналогичную Шефнер др. что каждый ответ должен быть воспроизводимым видел в общей сложности 3 раза, чтобы уменьшить влияние этого явления ^3.

По нашему опыту, клинические электродиагностических системы оптимизированы для исследований, описанных здесь, в связи с улучшением экзаменатор-Electrodiagnostic интерфейса системы эргономики, что облегчает контроль. Система двухканальный используется в нашей лаборатории оснащены два не с коммутацией каналов усилителя с использованием усилителя с 24 разрядным аналого-цифровой преобразователь и частоту дискретизации 48 кГц на канал. Усиления Оборудование может быть в диапазоне от 10nV 100 мВ / деление. Фильтр низких частот имеет диапазон от 0,2 Гц-5 кГц, и настройки высокочастотный фильтр в диапазоне от 30 Гц-10 кГц. Постоянная тока стимулятор используется (интенсивность: 0-100 мА; продолжительность: 0,02-1 мс). Большинство клинических системы имеют подобные функции соответствующие и могут быть скорректированы, чтобы обеспечивать надлежащий учет и CMap MUNE ответов.dditionally, стандартные электрофизиологические установки могут быть собраны адекватно записывать CMap и MUNE, но интерфейс может потребоваться корректировка для простоты регулировки стимуляции и быстрой идентификации CMap и СМУП ответов.

Ранее мы уже использовали методы CMAP и MUNE описано здесь для обеспечения быстрого и воспроизводимого оценку седалищного иннервируются мышцы задней конечности у мышей в течение раннем послеродовом периоде взросления ^5. Эти методы позволяют оценить в мышиных моделях, когда поведенческая тестирование на моторной функции не представляется возможным или является менее надежным. Применение этой методики неонатальной мышей облегчает изучение развития двигательной единицы, и имеет потенциал для расширения нашего понимания двигательных нейронов иннервации и обрезки. Например, мы показали, что количество функциональных двигательных единиц, записанных с MUNE будет увеличиваться в течение обрезки от polyneuronal в mononeuronal иннервации в течение первых двух неделис жизни в неонатальном мышей ^5. Возможность проверить мышей в течение длительных периодов времени с этой техникой поддается изучению двигательных единиц ответ на периферических нервов, травмы наследственных заболеваний нервно-мышечных и старения.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pro trimmer Pet Grooming Kit	Oster	078577-010-003	clippers for hair removal
Synergy T2 EMG system	Natus Neurology	Model no longer available	portable electrodiagnostic system
monopolar needles 28 gauge	Teca	017K121	cathode and anode stimulating electrodes
Alpine Biomed Digital Ring Electrode with twisted wires and 1.5 mm TP connectors.	Alpine Biomed	9013S0312	recording electrodes
Helping Hands alligator clip with iron base	Radio Shack	64-079	Maintaining recording electrode placement
Spectra 360 Electrode Gel	Parker Laboratories	9013G5012	applied to reduce skin impedance
monoject curved tip irrigating syringe	Covidien	81412012	utilized for application of electrode gel
EMG needle cable	Teca	902-RLC-TP	to connect monopolar electrodes to electrodiagnostic stimulator
Disposable 2" x 2" Electrode or similar trimmed as needed	Carefusion	019-415000	ground electrode
Small Heating Plate with built-in RTD sensor, 15x10cm	World Precision Instruments	61830	warming plate used with animal temperature controller to transmit heat to animal
Silicone pad for use with ATC2000	World Precision Instruments	503573	conductive removable pad to cover warming plate for easy cleaning
Animal temperature controller	World Precision Instruments	ATC2000	low noise animal heating system for maintaining animal temperature
Veterinarian petroleum-based ophthalmic ointment	Puralube	26870	applied during anesthesia to avoid corneal injury