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Resumo

Acidente vascular cerebral isquêmico é um evento complexo, no qual a contribuição específica dos astrócitos à região afetada do cérebro exposto a privação de oxigênio glicose (OGH) é difícil de estudar. Este artigo apresenta uma metodologia para obter isolados astrócitos e estudar sua reatividade e proliferação em condições OGH.

Resumo

Acidente vascular cerebral isquêmico é uma lesão complexa do cérebro causada por um trombo ou êmbolo obstruindo o fluxo sanguíneo para partes do cérebro. Isto leva à privação de oxigênio e glicose, o que faz com que a falha de energia e morte neuronal. Depois de um insulto isquêmico, astrócitos tornar-se reativa e proliferam em torno do local da lesão, como ela se desenvolve. Sob esse cenário, é difícil estudar a contribuição específica dos astrócitos, a região do cérebro exposto à isquemia. Portanto, este artigo apresenta uma metodologia para estudar a reatividade astrocyte primária e proliferação sob um modelo in vitro de um ambiente, como isquemia, chamado de privação de oxigênio glicose (OGH). Astrócitos foram isolados a partir de dia 1-4-velhos ratos Neonatais e o número de células hamartomas específico foi avaliada utilizando marcador seletivo de astrocyte gliais de proteína ácida fibrilar (GFAP) e coloração nuclear. O período em que astrócitos estão sujeitos à condição de OGH pode ser personalizado, bem como a percentagem de oxigênio que estão expostos. Essa flexibilidade permite aos cientistas caracterizar a duração do estado isquêmico, como em diferentes grupos de células in vitro. Este artigo discute os prazos de OGH que induzem a reatividade astrocyte, morfologia hipertrófica e proliferação, como medido por imunofluorescência usando Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA). Além de proliferação, astrócitos passam por energia e estresse oxidativo e respondem a OGH pela liberação de fatores solúveis no meio de célula. Este meio pode ser coletado e utilizado para analisar os efeitos das moléculas lançados por astrócitos em culturas neuronal preliminares sem interação célula a célula. Em resumo, este modelo de cultura celular primária pode ser usado com eficiência para entender o papel dos astrócitos isolados após lesão.

Introdução

Traço é definido como "uma aguda disfunção neurológica de origem vascular com súbito ou rápido desenvolvimento de sintomas e sinais, correspondentes à participação de áreas focais no cérebro"1,2. Existem dois tipos de AVC: isquêmico e hemorrágico. Quando a disfunção vascular é causada por um aneurisma ou uma avaria arteriovenosa, acompanhado pelo enfraquecimento com posterior ruptura de uma artéria, este é denominado acidente vascular cerebral hemorrágico3 que, na maioria dos casos, leva à morte. Quando um trombo ou um êmbolo obstrui o fluxo sanguíneo, causando uma temporária privação de oxigênio e glicose para uma região do cérebro, é chamado de acidente vascular cerebral isquêmico4. Falha para nutrir as células ao redor da área afetada ou núcleo isquêmico leva a um desequilíbrio homeostático e metabólico, disfunção energética, morte neuronal e inflamação5, que pode induzir a uma deficiência ao longo da vida para pacientes6.

Acidente vascular cerebral isquêmico é uma lesão multifatorial, envolvendo vários tipos de células que reagem e exercem seus efeitos nos pontos de tempo diferentes. Muitas interações criam um ambiente difícil para estudar o comportamento de células individuais. Então, como é que estudamos o contributo de um tipo de célula específica em um ambiente tão complexo? Um modelo aceito em vitro de isquemia consiste em expor as células à privação de oxigênio e glicose (OGH), durante um determinado período, seguido da restauração das células para um ambiente normoxic. Este sistema simula um acidente vascular cerebral isquêmico seguido de reperfusão de sangue. Neste método, as células ou tecidos são expostos a uma mídia livre de glicose em um ambiente purificado de oxigênio, utilizando uma câmara especializada hipóxica. O tempo de incubação OGH pode variar de alguns minutos até 24 h, dependendo da hipótese de que quer ser testado. Estudos têm mostrado que, dependendo da época do OGH e normoxic ambiente, fenótipos específicos do curso (ou seja, aguda ou subcrónica) pode ser alcançado. Primários isolados astrócitos, expostos a OGH com posterior restauração às condições normoxic, é um modelo de celular bem estudado para imitar o traço in-vitro7. Usando OGH é possível revelar os mecanismos moleculares independentes de células isoladas em um ambiente semelhante ao curso.

À medida que aumenta nosso conhecimento da biologia de astrocyte, tornou-se evidente que eles são cruciais para manter as sinapses e sustentar de reparação, desenvolvimento e plasticidade neural8. Em condições normais, astrócitos liberar e respondem às citocinas, quimiocinas, factores de crescimento e gliotransmitters, mantendo o equilíbrio metabólico e homeostase dentro sinapses5,9. Em neuroinflammation aguda, tais como acidente vascular cerebral isquêmico, estas células podem tornar-se reativa, mostrar uma superexpressão de longo prazo de Glial fibrilar ácida proteína (GFAP) e mostrar hipertrofia em sua morfologia5,10, 11 , 12. como o infarto isquêmico se desenvolve, a homeostase fornecida por astrócitos torna-se afetado, em relação a captação de glutamato normal, metabolismo energético, troca de moléculas ativas e antioxidante atividade13.

Reativados astrócitos proliferam em torno do tecido de infarto enquanto leucócitos migram para o lesado área14. Hamartomas proliferação pode ser medida usando marcadores como antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA), Ki67 e bromodeoxyuridine (BrdU)15. Esta resposta proliferativa é gerada de forma dependente do tempo e ajuda a formar a cicatriz glial, uma matriz de astrócitos reativos irreversivelmente ao longo do parênquima do local danificado após uma lesão de9. Uma das funções iniciais desta cicatriz é limitar o extravasamento de células imunes dessa área. No entanto, estudos têm mostrado que a cicatriz se torna um impedimento físico para axônios estender, como eles liberam moléculas inibindo o crescimento axonal e criar uma barreira física, impedindo que os axônios estendendo-se ao redor da área lesada16. No entanto, há evidências científicas mostrando que após uma lesão na medula espinhal, impedir completamente a formação de cicatriz glial pode prejudicar a regeneração de axônios17. Assim, o contexto no qual é medida a resposta hamartomas específica, deve ser considerado em cima do quadro da lesão estudada.

A metodologia apresentada pode ser aplicada para estudar a função individualizada de astrócitos após privação de glicose oxigênio e ele pode ser modificado dependendo as perguntas que o investigador quer responder. Por exemplo, além da alteração morfológica e os marcadores expressados em momentos diferentes do OGH, os sobrenadantes de astrócitos expostos a OGH podem ser mais analisados para identificar fatores solúveis liberados por essas células, ou usado como uma mídia condicionada para avaliar sua efeito em outras células do cérebro. Esta abordagem permite estudos sobre reatividade astrocyte que poderia levar a elucidação dos fatores que governam e modulam sua resposta em um cenário acidente vascular cerebral isquêmico.

Protocolo

pós-natal ratos (Sprague Dawley) 1-4 dias de idade são usados para isolar os córtices. O método de eutanásia é decapitação, conforme aprovado pelas diretrizes do NIH.

1. preparação de instrumentos e materiais para cirurgia

  1. instrumentos esterilize em autoclave (temperatura: 121 ° c, pressão: 15 libras por polegada quadrada, tempo: 30 minutos) usando uma caixa de aço ou uma mágica instantânea selagem bolsa de esterilização. Ver os materiais na Tabela de materiais.

2. Concluir a preparação de DMEM

  1. em um copo de um litro contendo 700 mL de água esterilizada, adicionar Dulbecco ' s Modified Eagle ' s médio pó à temperatura ambiente.
  2. Adicionar 3,7 g/L de bicarbonato de sódio, enquanto a solução é agitada com um agitador magnético.
  3. Ajustar o pH para 7,4, com água esterilizada trazer o volume até 1 L e, em seguida, filtrar. Para fins de cultura, completar o volume desejado de mídia com 10% FBS e 1% penicilina/estreptomicina e morno em 37 ˚ c. Ver os materiais na Tabela de materiais.
    Nota: O pH foi ajustado para 7,4 através de inserir o eletrodo medidor de pH em meios de comunicação. Então a mídia deve ser agitação, adicionar lentamente 1 M NaOH, usando um conta-gotas.

3. Cultura primária de Astrocyte

Nota: após a semeadura, mídia celular deve ser alterada a cada três dias e as células podem ser cultivadas até confluência (dias 11-13). No terceiro dia, toque o frasco várias vezes para elevador microglial células e as células progenitoras oligodendrocyte fora da cultura, remover todos os ' velho ' mídia, lavar duas vezes com 10 mL de PBS, aspirar a PBS, em seguida, adicionar mídia nova fresca. Ver os materiais na Tabela de materiais.

  1. De dissecação do cérebro de rato recém-nascido
    1. executar a dissecação de um capuz de cultura de tecidos. Obter o 1-4 dias velho filhotes recém-nascidos (2 cérebros de ratos são usados por balão de 75 cm 2).
    2. Preparar três pratos de petri 60mm e pipetar 5 mL de DMEM completa em cada um.
      Nota: Eles podem ser divididos da seguinte forma: #1 para cada rato no cérebro, #2 para todos os córtices dos cérebros e #3 para todos os córtices pelados (sem as meninges).
    3. Segure o filhote e spray com etanol a 70%. Decapitá-lo e descartar o corpo em um recipiente de resíduos de risco biológico pequeno.
    4. Usando as pinças microdissecando, segure a cabeça e cortar a pele em cima da cabeça para expor o crânio.
    5. Com outro par de tesouras, fazer um " T " incisão começando da parte de trás do crânio em direção ao nariz. Usar um par de pinças para remover suavemente o crânio.
    6. Remover o cérebro exposto com um par de pinças e colocar o cérebro em um dos pratos petri previamente preenchidos com meio.
    7. Usar um outro conjunto de instrumentos esterilizados para as etapas subsequentes.
    8. Usar fórceps microdissecando delicadamente, colocar um cérebro na pálpebra invertida de um prato de petri de 60 mm. Quando o prato de petri é colocado em gaze estéril, é possível ver claramente o cérebro, e é mais fácil dissecar.
    9. Firme o cérebro com pinças microdissecando e separe o hemisfério cerebral por provocando suavemente ao longo da fissura mediana com a ponta da pinça microdissecando.
    10. Transferir e descasque os córtices, deixando para trás a matéria branca e transferi-los para um prato de petri, previamente rotulado #2. Repita o procedimento para todos os cérebros, combinando todos os córtices dissecados no prato de petri rotulados #2.
    11. Retire o hipocampo de debaixo de cada córtex e descartá-lo
    12. Usar a pinça microdissecando e uma petri 60mm para descasque delicadamente as meninges de lóbulos corticais individuais e colocá-los no prato de petri rotulado #3.
  2. Dissociação de tecido: método de misturador homogeneizador
    1. despeje o saco estéril liquidificador suspensão de tecido/médio (córtices descascadas do cérebro) e adicionar suficiente médio para trazer o volume total no saco de 5 mL.
    2. Coloque o saco dentro o misturador homogeneizador, deixando aproximadamente 2 cm do saco visível acima da porta fechada. A dissociação de célula é feita durante 2,5 min em alta velocidade.
      Nota: Como alternativa, isso pode ser feito, fechando o saco e batendo-lo suavemente com um copo no bairro. Certifique-se de usar um pano entre o saco e o copo para evitar atritos.
    3. Despeje a suspensão de células em uma peneira de malha de número 60 e em seguida despeje o fluxo do filtrado através para a peneira de número 100, permitindo-lhe filtrar por gravidade.
    4. Usando 15 mL tubos, centrifugar a suspensão de célula x 200 g em uma centrífuga clínica (de preferência balanço balde rotor) 5 min.
    5. Decantar o sobrenadante em um copo, em seguida, usando uma pipeta sorológica, re-suspender e dissociar o pellet de células em um prazo máximo de 5 mL de mídia.
  3. Celular contando
    1. com uma micropipeta, coletar 100 µ l de suspensão de células em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL e adicionar 100 µ l de azul trypan.
    2. Inserir 10 µ l da suspensão coletada no hemocytometer e contar todas as células que são viáveis nos quatro cantos da Praça.
    3. As fórmulas para o cálculo da densidade das células antes de preparar os frascos são:
      figure-protocol-5732
      figure-protocol-5806
    4. adicionar pelo menos 500.000 células por balão de 25 cm 2. Pipete até 5 mL de DMEM para cada balão. A mistura não deve alcançar o pescoço do balão. Colocá-los numa incubadora 37 ° C em 5% CO 2, por 3 dias e, em seguida, alterar a mídia.
  4. Técnicas de purificação de astrocyte: mídia alterar, mecânicas e químicas estratégias
    Nota: a taxa metabólica de astrócitos é elevada em comparação com outros tipos de células, portanto, em nutricionalmente sem condições, estas células apresentam taxas de sobrevivência baixa depois de alguns dias. Ao contrário de astrócitos, micróglia não são afetados pela privação nutricional e proliferam em tais ambientes, 18. Para manter um número reduzido de células microglial, os autores mudam os meios de cultura de células de Ralevic cada 3 dias. Esta mudança constante nos meios de comunicação celular também irá diminuir a população de microglial que pode crescer em cima a monocamada celular hamartomas no balão 19.
    1. Uso um Pasteur pipeta para aspirar a mídia com células não-aderentes microglial de cada um dos frascos. Lavagem de todos os resíduos deixados para trás usando PBS estéril filtrada a cada um dos frascos de forma gota a gota (5 mL/frasco).
    2. Adicionar o filtrado estéril DMEM (com soro bovino fetal e antibiótico) gota a gota a cada balão (5 mL/frasco). Agitar suavemente em movimentos circulares para cobrir toda a superfície.
    3. Lugar as células em um 37 ° C incubadora a 5% de CO 2 por 8-10 dias até os frascos alcançar confluência (> 95% de cobertura de chapa).
      Nota: Vários protocolos têm mostrado que, quando astrócitos alcançar confluência, métodos mecânicos, tais como a cultura de 2 a 24 h, a tremer conduz para o destacamento de células que se encontram em cima destes astrócitos, principalmente microglia e precursor de células 19 , 20.
    4. Células Non-hamartomas é reduzidos em cultura através da realização de agitação orbital a 180 rpm por 30 min. Depois de remover células no sobrenadante, mídia fresca é pipetada para o balão (~ 15 mL).
    5. Para eliminar as células progenitoras oligodendrocyte, aumentar a velocidade de agitação para 200 rpm para 6 h 21 , 22 , 23, aspirado de sobrenadante e pipetar fresco mídia.
      Nota: Para diminuir a presença de micróglia nas culturas, dois métodos químicos podem ser usados em sequência (não simultaneamente) na metodologia de cultura celular primária: citosina arabinosa (Ara-C) e L-leucina metil éster (LME) 24.
    6. Imediatamente quando células alcançar confluência (100%), 3-4 dias após a remoção mecânica de micróglia, estas células podem ser tratadas com 8 µM da antimitóticas citosina arabinosa composta (Ara-C) em DMEM por 5 dias (mudança diariamente ao fresco Ara-C em DMEM).
      Nota: Ponto para adicionar Ara-C de tempo é crítico, uma vez que este composto é uma droga antimitóticas, que reduz o número de células, dividindo rapidamente como micróglia 19 , 25 e fibroblastos 26 . Em contraste com microglia, quando confluentes, astrócitos param proliferando através de da inibição de contato 27.
    7. Permitir que 2 dias para as células para se recuperar do tratamento de Ara-C.
    8. Para reduzir ainda mais a contaminação microglial, depois que células alcançar confluência, usa a 50mm de éster metílico de L-leucina (LME) em DMEM fixado em pH 7,4, por 1h em 37 ˚ c.
      Nota: LME atravessa a membrana das células e organelas, e após ser hidrolisado, a L-leucina produzido acumula-se nos lisossomos dessas células. A acumulação deste aminoácido leva a um edema osmótica e ruptura dos lisossomos 28 , 29. LME é altamente eficaz em eliminar microglia, em comparação com outras células 20 , 30.

4. Cultivando os astrócitos em placas boas 6

  1. revestimento lamelas com poli-lisina-D
    1. colocar uma lamela em cada prato de petri de 35 milímetros, em seguida adicionar 100 µ l da solução diluída para cada lamela poli-D-lisina e esperar 1 h.
    2. Remover o poli-D-lisina e lavar duas vezes com água estéril de 2 mL.
    3. Remover água e esperar por lamelas secar o interior do capô. Armazenar as lamelas a-20 ° C por até duas semanas.
      Nota: Congelar a solução diluída de poli-D-lisina; pode ser armazenado por até duas semanas.
  2. Trypsinization
    1. com uma pipeta Pasteur, Aspire o meio dos frascos. Adicionar 5 mL/frasco de PBS estéril filtrada para lavar delicadamente as células.
    2. Aspirado fora da PBS e em seguida, adicione 5 mL/frasco estéril filtrada 0,25% tripsina e 0,5 mM da solução de EDTA. Colocar o balão o ˚ c 37, 5% CO 2 incubadora durante 10 min.
      Nota: Enquanto as células estão incubando, aquecer 5 mL/frasco de fresco DMEM completa em 37 ° C.
    3. Após 10 min de incubação, agitar para certificar-se de todas as células são levantadas fora do frasco. Adicionar rapidamente a 5 mL de DMEM completa quente a cada balão, para neutralizar a tripsina.
    4. Pipetar suavemente as células acima e para baixo várias vezes para quebrar qualquer " grupos ". Transferência de células suspensas de dois balões para um tubo de centrifuga conico de 15 mL.
    5. Centrifugar durante 5 min à x 200 g para coletar o centrifugado. Ressuspender o pellet em 500 µ l de meio e prosseguir para colocar as células em balões a.
      Nota: Exemplos de análises deve ser feita com células: 1) reação em cadeia do polymerase transcrição reversa (RT-PCR) para analisar a expressão do gene; 2) Western blot para avaliar a expressão de proteínas; 3) análise de citometria de fluxo de para quantificar o número de células progenitoras neurais e proteínas de interesse; 4) imunofluorescência para analisar a expressão da proteína e localização.
  3. a semeadura de astrócitos
    1. após o tratamento os astrócitos primários com tripsina (ver 4.2), coletar 100 μL da suspensão de células em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL e adicionar 100 μL de 0,5% trypan azul.
    2. Adicionar 10 μL da suspensão coletada em trypan azul para o hemocytometer e contar todas as células que são viáveis.
    3. Use as fórmulas na etapa 3.3 para calcular a densidade das células antes de preparar os frascos.
    4. Preparar o poço de vários pratos, adicionando um estéril, poli-D-lisina revestido lamela a cada poço. Pipetar as 50.000 células e preencher o restante do volume em cada prato multi bem com meio fresco (cerca de 2 mL).
    5. Coloque os pratos multi bem dentro da incubadora 37 ˚ c a 5% de CO 2 e, depois de 5-7 dias, astrócitos podem crescer e cobrir toda a superfície das lamelas.

5. OGH protocolo para astrócitos primário

  1. preparação média OGH
    1. Dulbecco suplemento ' s modificado águia ' glicose livre médio de s com 3,7 g/L de bicarbonato de sódio e 1% penicilina/estreptomicina. Ver os materiais na tabela 4.
    2. Purga 20 mL do meio livre de glicose por borbulhamento com 95% N 2 / 5% de CO 2 por 10 min a um caudal de 15 L/min (indicado com o medidor de fluxo) através da inserção de uma pipeta sorológica para o sistema de gás no meio de.
      Nota: Após a purga o meio de oxigênio, ajustar o pH em 7,4 (consulte a nota no passo 2.1).
    3. Filtrar o meio livre de glicose eliminado usando um sistema de filtro do tubo de 50 mL.
      Nota: Fazer meio OGH fresco para cada experimento, borbulhando com 95% N 2 / 5% de CO 2 antes de utilizar, para assegurar que as células estão expostas a um ambiente purificado de oxigênio.
  2. Procedimento experimental
    1. dentro do capô de cultura de tecidos, remover mídia astrocyte de lamelas previamente preparadas (consulte a etapa 4.3.5) e lavagem com PBS celular duas vezes para remover qualquer glicose nas células.
    2. Adicionar 2 mL da mídia OGH a cada bem e coloque os pratos multi bem dentro da câmara de hipóxia com folga suas tampas
    3. Conectar-se a mistura de gás para a válvula de entrada e deixar a válvula de saída aberta. Lave a câmara com a mistura de gás de 95% N 2 / 5% CO 2, a 15 L/min para 5 min.
    4. Parar o fluxo de gás e primeiro feche a fixação da válvula de saída, em seguida, feche a braçadeira do tubo de válvula de entrada de gás.
      Nota: Certifique-se de não há nenhum escapamento do gás, abrangendo o selo da câmara com água e sabão. Se o selo for seguro, sem bolhas formam.
    5. Coloque a câmara inteira dentro da incubadora de cultura de célula a 37 ° C por 1 h ou h 6 em OGH.
    6. Depois que acabou o tempo de incubação, aspirar a mídia OGH e cuidadosamente Pipetar 2 mL de DMEM completa para cada 4,67 cm 2 bem para o normoxic processar 24 h.

6. Protocolo para a preparação de imunofluorescência primário Astrocyte

Nota: para avaliar a pureza de astrocyte, células cerebrais diferentes tipos tais como os neurônios, oligodendrócitos e micróglia podem ser detectados por imunofluorescência utilizando marcadores de célula diferente. Marcadores de proliferação, PCNA e iodeto de propidium (PI) podem ser usados em astrócitos principais expostos a OGH seguido por normoxic condições. Ver os materiais na Tabela de materiais.

  1. Preparação de imunofluorescência
    Nota: este é um protocolo geral de imunofluorescência, pequenas modificações podem ser executadas para alcançar uma óptima do sinal (por exemplo, longos períodos de incubação, temperatura de incubação). Cada marcador da tabela 1 pode ser usado de acordo com o fabricante ' protocolo s.
    1. Para avaliar a viabilidade celular, as células podem ser incubadas por 5 min a 37 ° C com PI (5 µM em DMEM completa) e lavar duas vezes com 2 mL de PBS para 5 min. de células que mostram coloração PI são menos viáveis.
      Nota: Uso as células tratadas na etapa 5.2.6.
    2. Corrigir células após coloração de PI, adicionar 2 mL de formol a 4% por 4,67 cm 2 bem, 20 minutos a 4 ˚ c. Para amostras rotuladas com PCNA, a solução preferida de fixação é metanol durante 10 minutos a 4 ˚ c.
      Atenção: Formol e metanol são tóxicos.
      Nota: Verifique sempre os protocolos de anticorpo específico de cada empresa.
    3. Lavar as células com 2 mL de PBS durante 5 min e repita este passo 3 vezes.
    4. Incubar células em solução de bloqueio (tensoativo não-iônico de 0,5%, 10% FBS em PBS) por 30 min à temperatura ambiente com agitação suave.
    5. Lavar as células com 2 mL de PBS durante 5 min, repetir a lavagem 3 vezes.
    6. Incubar a 4 ° C, durante a noite (16 h), com o anticorpo primário (PCNA, GFAP) em uma solução de 1% FBS em PBS.
    7. Remover a solução de anticorpo primário, lavam-se as células com 2 mL de PBS durante 5 min e repita este passo 3 vezes.
    8. Incubar com anticorpo secundário conjugado com fluoróforo em uma solução de 1% FBS em PBS, por 1h, à temperatura ambiente.
    9. Lavar as células com 2 mL de PBS durante 5 minutos, repita este passo 3 vezes. Adicionar 1 µ g/mL de DAPI (4 ', 6 ' - diamidino - 2-phenylindole) por 5 min manchar o núcleo de células.
    10. Lavar as células com 2 mL de PBS 5 min, repetir esta etapa duas vezes e manter em PBS.
    11. Preparar as lamelas em uma corrediça do microscópio usando o meio de montagem.
  2. Microscópio confocal
    1. após a criação do microscópio, coloque o lado de lamela para baixo no palco microscópio.
    2. Usando o software, selecione um feixe de laser em 543nm para GFAP-Cy3 anticorpo conjugado.

7. Ensaio da viabilidade de células

  1. Trypsinize e quantificar astrócitos seguindo as etapas 4.3 e 4.4.
  2. Adicionar 1 x 10 4 células/poço para placas de 96 poços e cultivá-las a confluência.
  3. Usando a metodologia da etapa 5, expor culturas placas de 96 poços para quer normoxic 1h OGH ou 6 h OGH.
  4. OGH após tratamento, normoxic mídia é adicionada a todas as células para 24h e viabilidade é medida usando o ensaio de reagente MTT (usar como fabricante ' instruções s indicam).
  5. De uma solução MTT 5 mg/mL, adicionar 10% do volume total a cada poço e incubar durante 3 h a 37 ˚ c com o reagente MTT.
  6. Remover mídia e ressuspender cristais usando 200 µ l dimetil sulfóxido. Leia a placa em espectrofotómetro a 570 nm.
    Nota: Uma diminuição da absorvância em relação a células de controle será correlacionar com menor viabilidade.

Resultados

Uma das principais preocupações da cultura hamartomas primária é a presença de outras células, como neurônios, oligodendrócitos, micróglia e fibroblastos. Na Figura 1, células isoladas de córtices rato tinham alterações de mídia a cada 3 dias em foram ou não tratada ou tratada com adicionado LME para 1 h. 24 horas mais tarde, as células foram immunostained para GFAP e counterstained com DAPI. Células não tratadas mostraram uma média de 39% ...

Discussão

Este protocolo descreve o isolamento de astrócitos de córtices de rato. Neste método, é fundamental para diminuir a contaminação com outros tipos celulares como fibroblasto, oligodendrócitos e micróglia. Para reduzir o número de micróglia, várias medidas podem ser tomadas: mudando a mídia, orbital tremendo e tratamentos químicos. Uma vez que a pureza da cultura é confirmada por imunofluorescência usando marcadores celulares seletivas ou para os contaminantes mais proeminentes de célula, experiências pode...

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Os autores querem agradecer Paola López Pieraldi pela assistência técnica. A.H.M é grato para o 8G12MD007600 de subsídios e U54-NS083924 que suporte esta publicação. Agradecemos a subvenção de NIH-NIMHD-G12-MD007583 para o suporte de instalação. D.E.R.A. é grato para a bolsa fornecida pelo NIHNIGMS-R25GM110513. Estamos gratos pelo uso da área comum de instrumentação e a ajuda do Dr. Priscila Sanabria para o uso da instalação de imagem óptico do programa RCMI por conceder G12MD007583. Além disso, queremos agradecer seu papel proeminente em filmagem e edição do protocolo visual Jose Padilla.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Instruments for Surgery - Step 1
Operating scissor 5.5”Roboz CompanyRS-6812Tools used to decapitate the rats.
Curved forceps 7” Roboz CompanyRS-5271Holds the skin of the rat while the skull is removed.
Micro-dissecting scissors 4” Roboz CompanyRS-5882Cuts both the skin and skull of the rat.
Micro-dissecting forceps 4” angled, fine sharp Roboz CompanyRS-5095Holds the skin of the rat while the skull is removed.
Micro-dissecting forceps 4” slightly curved 0.8Roboz CompanyRS-5135Tool used to separate cortices.
Micro-dissecting tweezersRoboz CompanyRS-4972Peels brain meninges.
Dissection microscopeOlympusSZX16Important for removing the meninge from the cortices.
DMEM Preparation - step 2
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)GibCo. Company11995-065Supports the growth of cells.
Sodium bicarbonateSigma-Aldrich CompanyS7277Supplement for the cell culture media.
Fetal bovine serum (FBS)GibCo. Company10437-010Serum-supplement for the cell culture.
Penicillin-Streptomycin GibCo. Company15140-148Inhibits the growth of bacterias in the cell culture.
Filter System 1L with 0.22um poreCorning431098
Astrocyte culture - step 3
Serological pipets 5mLVWR89130-896To pipette DMEM to containers with cells.
Serological pipets 10mLVWR89130-898To pipette DMEM to containers with cells.
Serological pipets 25mLVWR89130-900To pipette DMEM to containers with cells.
Centrifuge conical tube 15mLSanta Cruz Biotechnologysc-200250
Safe-lock tube 1.5mLEppendorf022363204
Barrier Tips 200 uLSanta Cruz Biotechnologysc-201725
Barrier Tips 1 mLSanta Cruz Biotechnologysc-201727
Biohazard Orange Bag 14 x 19"VWR14220-048
60mm petri dishesFalcon351007
Sterile gauze padsHoneywell Safety89133-086
Stomacher 80 BiomasterSewar Lab System030010019Triturate the brain tissue.
Stomacher 80 Blender Sterile BagsSewar Lab SystemBA6040Sterile bag for the stomacher cell homogenizer.
Beaker 400mLPyrex1000
Sterile cell dissociation sieve, mesh #60 Sigma-Aldrich CompanyS1020To obtain a uniform single cell suspension.
Sterile cell dissociation sieve, mesh #100Sigma-Aldrich CompanyS3895To obtain a uniform single cell suspension.
Invert phase microscopeNikonEclypse Ti-SVerify cells for contamination or abnormal cell growth.
75cm2 sterile flasksFalcon353136
Multi-well plateFalcon353046
Micro cover glasses (coverslips), 18mm, roundVWR48380-046
Bright-Line hemacytometerSigma-Aldrich CompanyZ359629
Pasteur pipettesFisher Scientific13-678-20D
Ethyl alcohol Sigma-Aldrich CompanyE7023
L-leucine methyl ester hydrochloride 98% (LME)Sigma-Aldrich CompanyL1002Promotes the elimination of microglia cells in the primary cortical astrocyte cultutre.
Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C)Sigma-Aldrich CompanyC1768
Poly-D-Lysine Hydrobromide, mol wt 70,000-150,000Sigma-Aldrich CompanyP0899
Trypsin/EDTAGibCo. Company15400-054
Trypan BlueSigma-Aldrich CompanyT8154
Phosphate buffer saline (PBS) tabletsCalbiochem524650
Sterile WaterSigma-Aldrich CompanyW3500
 OGD Medium Preparation - step 5
Centrifuge conical tube 50 mLVWR89039-658
Dulbecco’s modified Eagle’s medium-free glucoseSigma-Aldrich CompanyD5030Supports the growth of cells.
Sodium bicarbonateSigma-Aldrich CompanyS7277Supplement for the cell culture media.
Penicillin-Streptomycin GibCo. Company15140-148Inhibits the growth of bacterias in the cell culture.
200mM  L-glutamine GibCo. Company25030-081Amino acid that supplements the growth of cells.
Phospahet buffer saline (PBS) tabletsCalbiochem524650
Filter System 50mL with 0.22um poreCorning430320
Centrifuge conical tube 50 mLVWR89039-658
Single Flow Meter Billups-RothenbergSMF3001Measure gas flow in oxygen purge.
Hypoxia Incubator Chamber StemCell27310Generates a hypoxic environment for the cell culture.
Traceable Dissolved Oxygen MeterVWR21800-022
95% N2/ 5% CO2 Gas MixtureLindePurges the environment of oxygen.
primary astrocyte immunofluorescence - step 6
Phosphate buffer saline (PBS) tabletsCalbiochem524650
Formaline Solution Neutral Buffer 10%Sigma-AldrichHT501128Solution used to fix cells.
Methanol FisherA4544Solution used to fix cells.
Non-ionic surfactant (Triton X-100)Sigma-AldrichT8787
Fetal bovine serum (FBS)GibCo. Company10437-010Serum-supplement for the cell culture.
Anti-NeuNCell Signaling24307Detects mature neurons, serves to validate the astrocytic culture.
Anti-PCNACell Signaling2586Detects proliferating cells.
Propidium Iodide (PI)Sigma-Aldrich CompanyP4170Apoptosis staining.
Anti-Olig1AbcamAB68105Detects mature oligodendrocytes.
Anti-Iba1+Wako016-20001Detects microglial cells.
Anti-GFAP Conjugated with Cy3 Sigma-Aldrich CompanyC9205Detects reactive astrocytes in the treated cells.
Alexa Fluor 488Molecular Probe Life TechnologyA1101Anti-Mouse Secondary Antibody
Alexa Fluor 555Molecular Probe Life TechnologyA21428Anti-Rabbit Secondary Antibody
4’,6’-diamidino-2-phenylindole (DAPI)Sigma-Aldrich CompanyD9542Nuclear staining
Confocal microscopeOlympus

Referências

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