Criação<em&gt; Ixodes scapularis,</em&gt; O Ticked Black-legged: Alimentando estágios imaturos em ratos

Resumo

A produção de carrapatos criadas em laboratório saudáveis ​​é essencial para estudos sobre a biologia carrapato, e carrapato-patógeno interações. Aqui demonstramos um protocolo simples para a alimentação carrapato imaturo que é rentável e menos stressante para ratinhos.

Resumo

Ixodes scapularis , o vetor da doença de Lyme, é um dos vetores de doenças mais importantes no Leste e no Centro-Oeste dos Estados Unidos. Esta espécie é um carrapato de três hospedeiros que requer uma refeição de sangue de um hospedeiro vertebrado para cada estágio de desenvolvimento, e as fêmeas adultas requerem uma refeição de sangue para reprodução. Os carrapatos larvalos ligam-se ao seu hospedeiro durante 3-5 dias para alimentação e deixam o hospedeiro quando totalmente engorgado. Esta dependência de vários hospedeiros diferentes e o tempo de ligação prolongado para ingurgitamento complica a criação de carraças no ambiente laboratorial. No entanto, para entender a biologia das carraças e as interações do carrapato-patógeno, a produção de carrapatos saudáveis ​​criados em laboratório é essencial. Aqui, demonstramos um protocolo simples e econômico para a alimentação de carrapatos imaturos em camundongos. Modificamos os protocolos existentes para diminuição do estresse em camundongos e aumento do sucesso e sobrevivência da alimentação de carrapatos usando gaiolas descartáveis ​​sem fundo de malha para evitar o contato de carrapatos.Água contaminada com urina e fezes de ratos.

Introdução

Os carrapatos são ectoparasitas hematófagos obrigatórios de vertebrados e são distribuídos em todo o mundo. Nos Estados Unidos, pelo menos 11 espécies de carrapatos são vetores de patógenos de importância para a saúde pública ¹ . Ixodes scapularis é responsável pela transmissão de vários patógenos, tais como os agentes causadores da doença de Lyme ( Borrelia burgdorferi ), febre recidivante ( B. miyamotoi), anaplasmose granulocítica humana ( Anaplasma phagocytophilum ) e babesiose (Babesia spp.). Apesar da importância de I. scapularis como vetor de doença, a coleta desses aracnídeos em abundância da natureza para estudos no laboratório nem sempre é viável. Portanto, a produção de carrapatos saudáveis ​​criados em laboratório é essencial para estudos de biologia de carrapatos e interações de carrapatos-patógenos.

O ciclo de vida de todos os carrapatos duros (família Ixodidae), incluindo I. scapularis, consiste no ovo e em três activE estádios: larva, ninfa e adulto. Cada estágio ativo se alimenta de um hospedeiro vertebrado. As interações complexas que ocorrem entre os carrapatos e seus hospedeiros ao longo de vários dias de apego e alimentação são quase impossíveis de replicar usando alimentadores artificiais, e é improvável que fornecem números suficientes de carrapatos alimentados para a criação em massa ^{2 , 3 , 4} . Portanto, ratos vivos e coelhos são usados ​​mais freqüentemente como hospedeiros para a criação de imaturos (larvas e ninfas) e estádios maduros (adultos) de carrapatos, respectivamente. A necessidade de múltiplos hospedeiros para alimentação de sangue durante cada estágio de desenvolvimento complica a criação de carrapatos e é tempo e custo intensivo ^{5 , 6 , 7} . A maioria dos protocolos de criação de carrapatos requerem manter os ratos em uma gaiola ^{7 , 8} ou em umge de tais dimensões que o animal não pode mover-se livremente e se lamber ^{6, 9, 10.}

Estas gaiolas cilíndricas são depois transferidos para uma gaiola de caixa de sapatos com uma grelha de arame. Ingurgitadas, carrapatos destacadas são depois recolhidos a partir da água por baixo. No entanto, este método resulta em expor alimentado carrapatos à água contaminada com fezes e urina que pode aumentar o crescimento de fungos e carrapatos mortalidade ^9. Além disso, aumenta a possibilidade de fuga carrapato a partir da calha de água, bem como fazendo com que o stress a ratinhos. Para contornar estes problemas, que aqui demonstrar alimentação carrapato larval em ratinhos dentro de plástico do tipo caixa de sapatos gaiolas descartáveis. Este método permite que o comportamento normal dos ratos, os aumentos ingurgitadas recuperação carraça, e reduz a mortalidade carrapato devido a contaminação.

Protocolo

O protocolo (Número-00682) descrito a seguir é aprovado pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Universidade de Nevada Reno e segue as diretrizes da Universidade de Nevada, animal comitê de ética em pesquisa do Reno. Resumidamente, os ratinhos foram anestesiados com isoflurano e um cone de ponta foi utilizada para manter os níveis de isoflurano contínua durante 20 min. Uma pomada veterinário foi usado para evitar a secagem dos olhos sob anestesia. pitada dedo do pé foi usada para determinar o nível de anestesia e a taxa de respiração foi medido ao longo do procedimento. Ratos foram mantidos em gaiolas individuais e monitorados até que a consciência foi recuperado. Os ratinhos foram usados ​​apenas uma vez para a alimentação carrapato e foram sacrificados recuperação da carraça. A eutanásia foi realizada pelo Laboratório de pessoal da equipe Medicina Animal. CO ₂ e deslocamento cervical foram utilizados para a eutanásia de animais.

NOTA: Trabalhando em carrapatos requer o uso de eq de protecção individual completouipment. Para a contagem carrapatos imaturos, usar revestimentos brancos de laboratório, luvas de borracha nitrílica longos para cobrir a abertura da manga do revestimento do laboratório tapado com elásticos, e sapatos fechados. Para infestando ratos com carrapatos, use uma rede de cabelo, macacões descartáveis, luvas de manga comprida sobre as mangas, e tampas do pé. Utilizar combinações de cor branca ou luz para detectar carrapatos rebeldes. Verifique periodicamente luvas e mangas para carrapatos.

1. Quarto Preparação para o alojamento dos animais

1. Designar uma sala separada a ratinhos de casas infestadas com carraças. Coloque uma esteira ou fita adesiva de dupla face tapete pegajoso fora e dentro da porta para evitar a fuga acidental carrapato.

2. Contagem Carrapatos para Mouse Infestação

1. Colocar fita de face dupla em todo as bordas superiores de um x 5" x 14" recipiente de plástico 7" e encher com água a cerca de 2 cm.
2. Colocar uma outra pequena caixa ou uma placa de Petri, no centro do recipiente e encher com água a 1 cm a criação de um &# 34; fosso" em torno deste recipiente
3. Armazenar o frasco contendo larvas ou ninfas dentro da placa de Petri.
4. Use um pincel fino para remover as larvas ou ninfas do frasco e contar sob o microscópio. Contagem de 50 larvas ou ninfas 25 em frascos de cintilação separados. Cobrir os frascos imediatamente com malha de nylon ou de tela de tecido organdy e fechar com bandas de borracha.

3. Infestando ratos com Imaturo Os carrapatos

1. Use uma bancada de trabalho de cor branca ou luz e cole fita dupla face em torno do perímetro da área de trabalho.
2. Anestesiar rato com isoflurano. Verifique o nível de anestesia por pitada dedo do pé. Uma vez anestesiados, transferir o mouse para uma almofada de aquecimento coberta com toalhas de papel e anexar a um cone de nariz para o abastecimento de isoflurano continuou.
3. Aplique de petróleo à base de gelatina pomada para evitar a secura. Nota o padrão de respiração do rato para ajustar os níveis de isoflurano (80 -. 230 respirações por minuto é normal, reduz-se o nível de isoflurano brÉ inferior a 80 respirações por minuto para evitar a morte do animal).
4. Tome um frasco de 50 larvas ou 25 ninfas e coloque carrapatos sob a pele na cabeça entre as orelhas com um pincel ( Figura 1 ). Mantenha o rato sob anestesia durante 20 minutos após a colocação para dar tempo suficiente para as carraças se fixarem.
5. Mova o mouse para um padrão, caixa de plástico sapato-tipo gaiola descartável do mouse com tampas estáticas e cama branca. Fornecer brinquedos, água e alimentos ad libitum como por cuidado normal do mouse.
6. Armazene a gaiola do mouse dentro de uma gaiola de rato ou gerbil maior alinhada com fita adesiva dupla face em torno das bordas superiores. Encha a gaiola exterior com 3 cm de água ( Figura 2 ).

4. Coleta de carrapatos de ratos

1. Os carrapatos imaturos destacam-se entre os dias 3 e 6 da alimentação. Verifique as gaiolas e fossos de água para carrapatos engorged todos os dias após o dia 3.
2. Colete tiques isolados da gaiola entre os dias 4 e 6. Use uma dort escova ou fórceps suaves para pegar carrapatos ingurgitadas e armazenar em frascos de cintilação limpas cobertas com pano de malha de nylon protegido com bandas de borracha.
3. Anestesiar e vá rato no dia 7 para qualquer restantes carrapatos anexas.
4. Verifique a roupa de cama, calha de alimentação, e uma garrafa de água por carrapatos ingurgitadas em ratinhos dia 7. eutanásia seguindo o processo como descrito acima. Autoclave o descartável gaiolas, cama, garrafa de água, e comida calha para evitar carrapatos em jejum escapando.

5. Armazenamento de Fed Carrapatos

1. Manter carrapatos ingurgitadas a 90% de humidade, 20 ° C, e uma luz 0:12: escuro ciclo, num incubador de humidade e temperatura controladas até que muda ocorre. Isto pode demorar cerca de 12 a 18 semanas para ocorrer.
2. Enquanto humidade elevada promove a sobrevivência carrapato, que também faz com que os carrapatos propensas ao crescimento de fungos. Verificar alimentado carrapatos sob o microscópio, pelo menos, uma vez por semana para o molde. Se for detectada, lavar sobreviventes em 70% de etanol durante 5Min., Enxaguar em água, transferir para um papel de filtro para secar e transferir para novos frascos limpos.

Resultados

Modificamos os protocolos existentes de criação de carrapatos ^{6 , 10} para melhorar a eficiência alimentar e reduzir o estresse no hospedeiro do mouse. Os resultados demonstram que as gaiolas padrão de mouse estilo estilo sapato são bem adequados para a criação de carrapatos. A roupa branca forneceu um bom contraste para fácil coleta de carrapatos alimentados. A maioria dos carrapatos subiu as paredes dos recipientes após...

Discussão

Passos críticos dentro do Protocolo

É importante ter vários níveis de medidas de segurança quando a criação carrapatos para evitar fuga acidental. Uso de fita adesiva e um fosso de água são fundamentais para garantir a segurança. É importante para manter o rato anestesiado em uma almofada de aquecimento para manter a temperatura constante do corpo. Nós também descobrimos que raspar o mouse não fornece qualquer benefício extra para fixação do carrapato. Um ratinho individual pod...

Materiais

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