impennata<em&gt; Ixodes scapularis,</em&gt; Il Tick Black-legged: Alimentazione stadi immaturi sui topi

Riepilogo

La produzione di zecche allevate in laboratorio sano è essenziale per gli studi di biologia tick, tick e-patogeno interazioni. Qui mostriamo un semplice protocollo per l'alimentazione tick immaturo che è costo-efficace e meno stressante per i topi.

Abstract

Ixodes scapularis , il vettore della malattia di Lyme, è uno dei più importanti vettori delle malattie negli Stati Uniti orientali e mediorientali. Questa specie è un trifoglio host che richiede un pasto di sangue da un ospite vertebrato per ogni fase di sviluppo e le femmine adulte richiedono un pasto di sangue per la riproduzione. Le zecche di larve si attaccano al loro ospite per 3 - 5 giorni per l'alimentazione e scendono l'ospite quando sono completamente ingolfati. Questa dipendenza da diversi host differenti e il lungo periodo di attacco per l'ingranaggio complicano l'allestimento del ticchettio nell'ambiente di laboratorio. Tuttavia, per comprendere la biologia dei tick e le interazioni tra tick-pathogen, la produzione di zecche sane e testate da laboratorio è essenziale. Qui dimostriamo un semplice e conveniente protocollo per l'immatura del tick in mouse sui topi. Abbiamo modificato i protocolli esistenti per diminuire lo stress sui topi e aumentare il successo e la sopravvivenza di alimentazione dei ticchetti usando gabbie monouso senza fondi a maglie per evitare il contatto di ticks wiAcqua contaminata con urine e feci di topi.

Introduzione

Le zecche sono obbligati ectoparassiti ematofagi dei vertebrati e sono distribuiti in tutto il mondo. Negli Stati Uniti, almeno 11 specie di zecche sono vettori di agenti patogeni di importanza per la salute pubblica ^1. Ixodes scapularis è responsabile per la trasmissione di diversi agenti patogeni come gli agenti causali della malattia di Lyme (Borrelia burgdorferi) febbre ricorrente (B. miyamotoi), anaplasmosi granulocitica umana (Anaplasma phagocytophilum), e babesiosi (Babesia spp.). Nonostante l'importanza di I. scapularis come vettori di malattie, la raccolta di questi aracnidi in abbondanza in natura per gli studi in laboratorio non è sempre fattibile. Pertanto, la produzione di zecche allevate in laboratorio sano è essenziale per gli studi di biologia tick, tick e-patogeno interazioni.

Il ciclo di vita di tutte le zecche dure (famiglia Ixodidae), tra cui I. scapularis, è costituito da l'uovo e tre activE stadi: larva, ninfa e adulti. Ogni fase attiva viene alimentata da un host vertebrato. Le complesse interazioni che si verificano tra zecche e loro ospiti durante diversi giorni di attacco e di alimentazione sono quasi impossibili da replicare usando mangimi artificiali e sono improbabili che forniscono un numero sufficiente di zecche alimentate per l'allevamento di massa ^{2 , 3 , 4} . Pertanto, i topi e conigli vivi vengono utilizzati più frequentemente come host per l'allevamento di immaturi (larve e ninfe), e fasi mature (adulti) di zecche, rispettivamente. Il requisito di ospedali multipli per l'alimentazione del sangue durante ogni fase di sviluppo complica l'allattamento dei ticchetti e è tempo e costi intensivi ^{5 , 6 , 7} . La maggior parte dei protocolli per l'allevamento del ticchettio richiede la conservazione dei topi in una gabbia a pavimento griglia metallica sospesa ^{7 , 8} o in un cilindro caGe di tali dimensioni che l'animale non può muoversi liberamente e lo sposo stesso ^{6 , 9 , 10} .

Queste gabbie cilindriche vengono successivamente trasferite in una gabbia di scarpiere con una griglia metallica. Quindi vengono raccolti le zecche ad anello incastrate e smontate. Tuttavia, questo metodo consente di esporre le zecche alimentate ad acqua contaminata da urine e feci che possono aumentare la crescita delle funghi e la mortalità dei segni. Inoltre, aumenta la possibilità di fuggire dal bacino dell'acqua, oltre che causare stress ai topi. Per aggirare questi problemi, qui dimostriamo che la tambura di larvale è alimentata su topi all'interno di gabbie monouso di tipo plastic shoebox. Questo metodo consente il normale comportamento dei topi, aumenta il recupero ingorgo del ticchettio e diminuisce la mortalità dei segni a causa della contaminazione.

Protocollo

Il protocollo (Number-00682) descritto qui di seguito è stato approvato dal Comitato Istituzionale cura degli animali ed uso (IACUC) presso l'Università del Nevada Reno e segue le linee guida della University of Nevada, animale comitato etico della ricerca di Reno. In breve, i topi sono stati anestetizzati con isoflurano e un'ogiva è stato utilizzato per mantenere livelli isoflurano continui per 20 min. Un unguento veterinario è stato usato per l'essiccamento della occhi sotto anestesia. Toe pinch stata utilizzata per determinare il livello di anestesia e la frequenza respiratoria è stata misurata durante tutta la procedura. I topi sono stati tenuti in gabbie individuali e monitorati finché fu recuperato. I topi sono stati utilizzati una sola volta per l'alimentazione zecche e sono stati sottoposti ad eutanasia recupero post tick. L'eutanasia è stata realizzata dal Laboratorio di personale di staff animale medicina. CO ₂ e dislocazione cervicale sono stati utilizzati per l'eutanasia degli animali.

NOTA: Lavorare su zecche richiede l'uso di completa eq di protezione individualeAZIONE DEI DISPOSITIVI. Per il conteggio delle zecche immature, indossare cappotti di laboratorio bianco, guanti nitrilici lunghi per coprire l'apertura del manicotto del cappotto di laboratorio con bande di gomma e scarpe chiuse. Per infestare i topi con le zecche, utilizzare una rete di capelli, tuta da lavoro usa e gonna, guanti a maniche lunghe sulle maniche e coprisedili. Utilizzate tute bianche o colorate per rilevare le zecche instabili. Controllare periodicamente i guanti e le maniche per le zecche.

1. Preparazione della sala per l'alloggiamento degli animali

1. Designare una stanza separata per ospitare i topi infestati da zecche. Posizionare una tappetino appiccicoso o un nastro di moquette su entrambi i lati dentro e fuori la porta per evitare fughe accidentali.

2. Conteggio delle zecche per l'infestazione del mouse

1. Inserire nastro a doppia faccia intorno ai bordi superiori di un contenitore di plastica da 7 "x 5" x 14 "e riempire con acqua a circa 2 cm.
2. Inserire un'altra piccola scatola o un piatto di Petri al centro del contenitore e riempi con acqua a 1 cm creando un &# 34; fossero "intorno a questo contenitore
3. Conservare il fiale contenente le larve o le ninfe all'interno del piatto di Petri.
4. Utilizzare un pennello di vernice fine per rimuovere le larve o le ninfe dalla fiala e contare sotto il microscopio. Conta 50 larve o 25 nimfe in flaconi di scintillazione separati. Coprire immediatamente i flaconcini con lo strato di maglia nylon o organdy e chiudere con fasce di gomma.

3. Infestare i topi con le immature zecche

1. Utilizzare una panca da lavoro bianco o leggera e bastone a nastro biadesivo lungo il perimetro dell'area di lavoro.
2. Anestetizzare il mouse con isoflurano. Controllare il livello di anestesia con il pizzico della punta. Una volta anestetizzato, trasferire il mouse su un tappetino riscaldato rivestito di tovaglioli di carta e fissarlo a un cono di naso per la fornitura continua di isoflurano.
3. Applicare unguento a base di gelatina petrolifera per evitare la secchezza. Si noti il ​​pattern di respirazione del mouse per regolare i livelli di isoflurano (80 - 230 respiri per min è normale., Ridurre il livello di isoflurano in brIl tasso di eathing è inferiore a 80 breath per min per evitare l'uccisione dell'animale).
4. Prendete un fiale di 50 larve o 25 nimfe e posizionate le zecche sotto la pelliccia sulla testa tra le orecchie con un pennello ( figura 1 ). Tenere il mouse sotto l'anestesia per 20 minuti dopo il posizionamento per dare tempo sufficiente per le zecche da attaccare.
5. Spostare il mouse su una gabbia usa e getta monouso tipo scatola in plastica con coperchi e biancheria bianca. Fornire giocattoli, acqua e cibo ad libitum come per la cura del mouse normale.
6. Conservare la gabbia del mouse all'interno di una gabbia più grande di ratto o gerbil, rivestita di nastro adesivo su due lati intorno ai bordi superiori. Riempire la gabbia esterna con 3 cm di acqua ( Figura 2 ).

4. Raccolta di zecche dai topi

1. I ticchetti immaturi si separano tra i giorni 3 e 6 dell'alimentazione. Controllare ogni giorno dopo giorno le gabbie e il fossato d'acqua per le zecche ingannate.
2. Raccogli le zecche distaccate dalla gabbia tra i giorni 4 e 6. Utilizzate un doloreT pennello o pinze morbide per raccogliere le zecche ingrassate e conservare in flaconi di scintillazione puliti con panno in maglia nylon fissati con bande di gomma.
3. Anestetizzare e controllare il mouse il giorno 7 per qualsiasi rimanente zecche allegate.
4. Controllare la biancheria da letto, l'alimento e la bottiglia d'acqua per le zecche ingannate il giorno 7. Eutanizzare i topi seguendo la procedura descritta in precedenza. Autoclave le gabbie usa e getta, la biancheria, la bottiglia d'acqua e il cibo per evitare qualsiasi scompigliamento delle zecche senza peli.

5. Immagazzinamento delle zecche di Fed

1. Mantenere le zecche ingrossate all'umidità del 90%, 20 ° C, e una luce 12:12: il ciclo scuro in un incubatore di umidità e temperatura controllato fino a quando si verifica un molting. Ciò può richiedere circa 12 a 18 settimane.
2. Mentre l'elevata umidità favorisce la sopravvivenza del bersaglio, rende anche i ticks suscettibili di sovrapposizione fungina. Controllare le zecche alimentate sotto il microscopio almeno una volta alla settimana per lo stampo. Se rilevato, lavare i sopravvissuti in etanolo al 70% per 5Min., Sciacquare in acqua, trasferire su un filtro da asciugare e trasferirlo in flaconi nuovi e puliti.

Risultati

Abbiamo modificato i protocolli ^{6 , 10} per l'allevamento dei tick ^, per migliorare l'efficienza di alimentazione e ridurre lo stress sull'host del mouse. I risultati dimostrano che le gabbie di mouse standard in stile shoebox sono adatte per l'allevamento dei ticchetti. La biancheria bianca forniva un buon contrasto per una facile raccolta di zecche alimentate. La maggior parte delle zecche si sono arra...

Discussione

Passi critici all'interno del protocollo

È importante avere diversi livelli di misure di sicurezza durante l'allevamento delle zecche per evitare fuga accidentale. L'uso di nastro adesivo e fossato d'acqua sono fondamentali per garantire la sicurezza. È importante mantenere il mouse anestetizzato su un tappetino per mantenere costante la temperatura corporea. Abbiamo anche scoperto che la rasatura del mouse non fornisce alcun vantaggio in più per l'attaccatura del tick. U...

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