разведение<em&gt; Черноногий клещ,</em&gt; Черный ноги Tick: Кормление незрелых стадий на мышах

Резюме

Производство здоровых лабораторными выращены клещи необходимо исследования по клещу биологии, и тик-патоген взаимодействий. Здесь мы демонстрируем простой протокол для незрелого кормления клеща, что является экономически эффективными и менее напряженным для мышей.

Аннотация

Ixodes scapularis , вектор болезни Лайма, является одним из наиболее важных переносчиков заболеваний в восточной и среднезападной части Соединенных Штатов. Этот вид представляет собой трёхмерный клещ, для которого требуется кровь из позвоночного хозяина для каждой стадии развития, а взрослым самкам требуется кровь для размножения. Клещи личинок прикрепляются к хозяину в течение 3 - 5 дней для кормления и высадки хозяина при полном насыщении. Эта зависимость от нескольких разных хостов и длительное время присоединения для нагрубания затрудняет выращивание клещей в лабораторных условиях. Тем не менее, чтобы понять биохимию клещей и клещевые патогенные взаимодействия, производство здоровых, лабораторно выращенных клещей очень важно. Здесь мы демонстрируем простой, рентабельный протокол для незрелого клещевого кормления на мышах. Мы модифицировали существующие протоколы для снижения стресса у мышей и увеличили успех клещей и выживаемость, используя одноразовые клетки без дна сетки, чтобы избежать контакта клещей wiЙ воды, загрязненной мочой мышей и фекалиями.

Введение

Клещи являются обязательными гематофагическими эктопаразитами позвоночных и распространены во всем мире. В Соединенных Штатах, по крайней мере, 11 видов клещей являются переносчиками патогенов, имеющих важное значение для общественного здоровья ¹ . Ixodes scapularis ответственен за передачу нескольких патогенов, таких как возбудители болезни Лайма ( Borrelia burgdorferi ), рецидивирующая лихорадка ( B.miyamotoi), гранулоцитарный анаплазмоз человека ( Anaplasma phagocytophilum ) и бабезиоз (Babesia spp.). Несмотря на важность I. scapularis как вектор болезни, сбор этих паукообразных в изобилии из дикой природы для исследований в лаборатории не всегда возможен. Таким образом, производство здоровых лабораторных клещей имеет важное значение для изучения биологии клещей и клещевого патогенного взаимодействия.

Жизненный цикл всех тяжелых клещей (семейство Ixodidae), включая I. scapularis, состоит из яйца и трех активныхЕ стадии: личинка, нимфа и взрослый. Каждая активная стадия питается позвоночным хозяином. Сложные взаимодействия, которые происходят между клещами и их хозяевами в течение нескольких дней прикрепления и кормления, почти невозможны для репликации с использованием искусственных фидеров, и вряд ли они обеспечат достаточное количество сытых клещей для массового выращивания ^{2 , 3 , 4} . Поэтому живые мыши и кролики чаще всего используются в качестве хозяев для выращивания незрелых (личинок и нимф) и зрелых стадий (взрослых) клещей, соответственно. Требование множественных хостов для кроветворения в течение каждой стадии развития усложняет клещевое разведение и требует значительных затрат времени и средств ^{5 , 6 , 7} . Большинство протоколов размножения клещей требуют удерживания мышей в клетке ⁷ или ⁸ в подвесной проволочной сетке или в цилиндрическом саGE таких размеров , что животное не может свободно перемещаться и жених себя ^{6, 9, 10.}

Эти цилиндрические клетки, которые затем переносили в обувной коробке клетку с проволочной сеткой. Напитавшиеся, отдельные клещи затем собирает из воды под ним. Тем не менее, этот метод приводит к обнажая кормили клещей воды , загрязненной мочой и калом , которые могут увеличить рост грибковой и тикают смертность ^9. Кроме того, это увеличивает возможность клеща выхода из воды желоба, а также вызывает стресс у мышей. Чтобы обойти эти проблемы, мы здесь демонстрируем личиночное кормление клеща на мышах в течение пластик коробки типа одноразовых клеток. Этот метод позволяет нормальное поведение мышей, увеличивается напитавшихся восстановление тик, тик и уменьшает смертность вследствие загрязнения.

протокол

Протокол (Номер-00682), описанный ниже, одобрен Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованием (IACUC) в Университете Невады Рено и соответствует принципам Университета штата Невада, комитета по этическим исследованиям животных Рено. Короче говоря, мышей анестезировали изофлураном, а носовой конус использовался для поддержания непрерывного уровня изофлурана в течение 20 мин. Мазь ветеринара использовалась для предотвращения высыхания глаз под наркозом. Для определения уровня анестезии использовали уровень пальцев стопы, а во время процедуры измеряли интенсивность дыхания. Мышей держали в отдельных клетках и контролировали до тех пор, пока сознание не было восстановлено. Мыши использовались только один раз для кормления клещей и подвергались эвтаназии после восстановления клеща. Эвтаназия была проведена сотрудниками лаборатории лабораторной медицины. CO ₂ и дислокация шейки матки использовались для эвтаназии животных.

ПРИМЕЧАНИЕ. Работа с клещами требует использования полного персонального защитного эквалайзераНАС ТРОЙКА. Для подсчета незрелых клещей, носить белые халаты, длинные нитриловые перчатки, чтобы покрыть рукав открытие лаборатории пальто с крышкой с резинками и закрытым носок обувь. Для паразитирующего мышея с клещами, используйте сетку для волос, одноразовые комбинезоны, с длинными рукавами, перчатки на рукава и охватывает ножной. Используйте белый или светлый цвета комбинезона для обнаружения своенравных тиков. Периодически проверяйте перчатки и рукав для клещей.

1. Подготовка номеров для содержания животных

1. Назначьте отдельную комнату для домовых мышей, зараженных клещами. Поместите липкий коврик или двухсторонний ковер ленту снаружи и внутри двери для предотвращения случайного побега клеща.

2. Подсчет Кусачки для мыши зараженности

1. Поместите двухстороннюю ленту вокруг верхних краев х 5" х 14" пластмассовой тары 7" и заполняют водой до приблизительно 2 см.
2. Поместите еще один небольшой ящик или чашку Петри в центре контейнера и залить водой до 1 см создавая &# 34; ров»вокруг этого контейнера
3. Храните флакон, содержащий личинки или нимфы в чашке Петри.
4. Используйте тонкую кисть для удаления личинок или нимф из флакона и подсчета под микроскопом. Количество 50 личинок или 25 нимф в отдельные сцинтилляционные флаконы. Накройте чаши сразу с нейлоновой сеткой или органди экран ткани и близко с резинками.

3. Заполнять Мыши с незрелыми тиками

1. Используйте белый или светло-окрашенный верстак и наклеить двухсторонний скотч по периметру рабочей зоны.
2. Обезболить мышь с изофлураном. Проверьте уровень анестезии схождения крайнем случае. После того, как наркоз, передать мышь на грелку, покрытой бумажным полотенцем и приложите к конусообразной для продолжения изофлурановым питания.
3. Применение вазелина на основе глазную мазь, чтобы избежать сухости. Обратите внимание на шаблон дыхания мыши, чтобы регулировать уровни изофлурана (80 -. 230 вдохов в мин нормально, Снижение уровня изофлурана, если ушСкорость выедания менее 80 вдохов в минуту, чтобы избежать убийства животного).
4. Возьмите один флакон из 50 личинок или 25 нимф и поместите клещей под шерсть на голове между ушами с помощью кисти ( рис. 1 ). Держите мышь под анестезией в течение 20 минут после размещения, чтобы дать достаточно времени для прикрепления клещей.
5. Переместите мышь в стандартную пластиковую коробку с одноразовой пластиковой коробкой для обуви с статическими крышками и белыми постельными принадлежностями. Обеспечьте игрушки, воду и пищу ad libitum в соответствии с нормальным уходом за мышью.
6. Храните клетку для мыши внутри большей клетки крысы или песчанки, выложенной двухсторонней липкой лентой вокруг верхних краев. Заполните внешнюю клетку 3 см воды ( рис. 2 ).

4. Сбор мышей от мышей

1. Незрелые клещи отделяются между 3 и 6 днями кормления. Проверяйте клетки и водный ров для насыщенных клещей каждый день после третьего дня.
2. Соберите отдельные клещи из клетки между 4 и 6 днями. Используйте больКисть или мягкие щипцы для сбора насыпных клещей и хранения в чистых сцинтилляционных флаконах, увенчанных нейлоновой сетчатой ​​тканью, закрепленной резинками.
3. Анестезируйте и проверьте мышь на 7-й день для всех остальных прикрепленных клещей.
4. Проверьте постельные принадлежности, кормушку и бутылку с водой для насыщенных клещей на 7-й день. Усыпейте мышей, следуя процедуре, описанной выше. Автоклавируйте одноразовые клетки, подстилку, бутылку с водой и кормушку для продуктов питания, чтобы избежать вылета с голодных клещей.

5. Хранение тиков ФРС

1. Поддерживать насыщенные клещи при влажности 90%, 20 ° C и 12:12 светлого-темного цикла в инкубаторе с контролируемой влажностью и температурой до тех пор, пока не произойдет линька. Это может занять от 12 до 18 недель.
2. В то время как высокая влажность способствует выживанию клещей, это также делает клещей, склонных к разрастанию грибков. Проверяйте подкожные клещи под микроскопом не реже одного раза в неделю для плесени. Если обнаружено, вымыть оставшихся в живых в 70% этанола для 5мин., промыть в воде, переносят в фильтровальную бумагу, чтобы высушить и перенести на новые, чистые флаконы.

Результаты

Мы модифицировали существующие протоколы Tick выращивания ^{6, 10} для улучшения эффективности кормления и снижение нагрузки на хосте мыши. Полученные результаты показывают, что стандартные садки коробки типа мышей хорошо подходят для клещ?...

Обсуждение

Критические шаги в рамках Протокола

Важно иметь несколько уровней мер безопасности при выращивании клещей, чтобы избежать случайного выхода. Использование липкой ленты и водяного рва имеет решающее значение для обеспечения безопасности. Важно держать анестезированную...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Puralube vet ointment	Amazon		Available from any Pet store or online store
Disposable mouse cage	Innovive, San Diego, CA	MV 2	Set of bottom and lid
White Alpha dri bedding	Lab Supply, Fort Worth, TX	ALPHA-Dri™