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Method Article
Endocitose da vesícula sináptica é detectada pela microscopia de luz de pHluorin fundido com proteínas de vesículas sinápticas e por microscopia eletrônica de absorção da vesícula.
Durante a endocitose, fundidas vesículas sinápticas são recuperadas em terminais nervosos, permitindo a reciclagem de vesículas e, portanto, a manutenção da transmissão sináptica durante o disparo repetitivo do nervo. Endocitose prejudicada em condições patológicas leva a diminuições em funções sinápticas de força e cérebro. Aqui, descrevemos os métodos utilizados para medir a endocitose da vesícula sináptica na sinapse hippocampal mamífera na cultura neuronal. Temos monitorado endocitose de proteínas de vesícula sináptica pela fusão de uma proteína de membrana vesicular sináptica, incluindo Sinaptofisina e VAMP2/synaptobrevin da, o lado lumenal vesicular, com pHluorin, uma proteína fluorescente verde sensíveis ao pH que aumenta sua intensidade de fluorescência como o pH aumenta. Durante a exocitose, pH do lúmen vesicular aumenta, Considerando que durante o lúmen vesicular endocitose pH é re-acidificado. Assim, um aumento da intensidade de fluorescência pHluorin indica fusão, enquanto uma diminuição indica endocitose da proteína rotulados vesícula sináptica. Além de usar o pHluorin método de imagem para gravar endocitose, temos monitorado endocitose da membrana vesicular por microscopia de elétron (EM) medições de absorção de Horseradish peroxidase (HRP) por vesículas. Finalmente, temos monitorado a formação dos poços de membrana terminal do nervo em vários momentos após a despolarização induzida por potássio alto. O tempo de curso de formação de poço de captação e membrana HRP indica o tempo de curso de endocitose.
Os neurotransmissores são armazenados em vesículas sinápticas e liberados por exocitose. A membrana da vesícula sináptica e a proteína são então internalizadas por endocitose e reutilizadas na próxima rodada de exocitose. Endocitose das vesículas sinápticas é importante para a manutenção de piscinas de vesícula sináptica e remove salientes vesículas de membrana plasmática. O pHluorin sensíveis ao pH proteína verde fluorescente, que é saciada em circunstâncias ácidas e dequenched em pH neutro, tem sido usado para medir tempo de endocitose cursos em vivem células1,2,3. A proteína de pHluorin normalmente é unida ao lado lumenal das proteínas de vesículas sinápticas, tais como Sinaptofisina ou VAMP2/synaptobrevin da. No resto, pHluorin é extinguido no lúmen 5.5 pH das vesículas sinápticas. Fusão de vesículas para a membrana plasmática apresenta o lúmen vesicular à solução extracelular onde o pH é ~ 7.3, resultando em um aumento na fluorescência do pHluorin. Após a exocitose, decompõe-se o aumento da fluorescência, devido a endocitose das proteínas de vesículas sinápticas seguido por re-acidificação de vesículas dentro dessas vesículas recuperadas. Embora a decadência reflete tanto a endocitose e a re-acidificação vesicular, principalmente reflete endocitose, porque re-acidificação é mais rápido que endocitose na maioria das condições1,4. A constante de tempo de re-acidificação é 3-4 s ou menos5,6, que é geralmente mais rápido que o 10 s ou mais necessários para vesículas endocitose4,5. Se experimentos são necessários para distinguir a endocitose de re-acidificação, ácidos resfriamento experimentos usando a solução de (MES) ácido 4-Morpholineethanesulfonic (25 mM) com um pH de 5,5 podem ser usados para determinar se as proteínas de vesículas sinápticas são recuperadas da membrana plasmática através de endocitose1,3,4. Assim, o aumento de intensidade de fluorescência pHluorin reflete um equilíbrio de exo e endocitose, e a diminuição após a estimulação do nervo especificamente reflete endocitose.
pHluorin imagem pode ser usada não apenas para medir o tempo de curso de endocitose, mas também o tamanho da vesícula sináptica piscinas7,8, e9de lançamento a probabilidade de lançamento evocado e espontânea. Muitos fatores e proteínas envolvidas na regulação da endocitose, tais como cálcio, solúvel NSF-acessório da proteína do receptor (SNARE) proteínas, neurotrófico derivado do cérebro factor(BDNF) e calcineurina foram identificadas usando pHluorin de imagens1 , 2 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16. Além disso, a liberação do neurotransmissor pode ser detectada nos neurônios não apenas primários, mas em células de neuroblastoma com TIRFM17. Recentemente, pHTomato, dsRed, mOrange e variantes de pHluorin foram desenvolvidos para o monitoramento de gravações simultâneas de vários fatores em uma única sinapse18,19. Por exemplo, pHTomato tem sido fundido com Sinaptofisina e usado com um indicador de cálcio geneticamente codificado (GCaMP5K) para monitorar fusão de vesícula pré-sináptica e Ca2 + influxo no compartimento pós-sináptica20. Portanto, pHluorin ligado a proteínas sinápticas fornece um método útil para analisar a relação entre endocitose e exocitose.
É outro método comumente usado para estudar a endocitose, devido a alta resolução espacial que mostra as alterações ultra-estruturais durante a endocitose. Duas áreas gerais são a capacidade de visualizar as alterações patológicas dentro de células neuronais21 e faixa de proteínas de vesícula22. Em particular, a observação da absorção da vesícula sináptica, curvatura de membrana revestida por Clatrina na zona de periactive, e CDDP estruturas são possíveis com EM3,23,24,25 ,26,,27,28. Enquanto EM envolve artefatos potenciais, tais como malformações induzidas pelo fixador, que pode afetar a endocitose e análise de dados é de trabalho intensivo, que a resolução prevê uma oportunidade atraente para visualizar a estrutura celular. Potenciais problemas de fixador e a limitação em resolução temporal EM podem ser superados por alta pressão, congelamento, fornecendo um método rápido e não-químicas de estabilizar as delicadas estruturas presentes durante a endocitose27.
Nota: O seguinte protocolo descreve os métodos de imagem pHluorin e métodos EM neurônios hippocampal culta. pHluorin monitores vesícula sináptica proteína absorção em células vivas e EM detecta a absorção da vesícula sináptica e as alterações ultra-estruturais.
cuidados com animais e procedimento seguiu as diretrizes do NIH e foram aprovados pelo Comitê de uso e cuidados do Animal NIH.
1. pHluorin Imaging
2. Microscopia eletrônica de
Usando o método de transportadora de lipídios, SpH foi expressa em neurônios hippocampal, permitindo a identificação de boutons (Figura 1a). Estimulação elétrica das células induzidas por exocitose e um correspondente aumento na intensidade de fluorescência. O aumento na fluorescência (ΔF) foi interrompido por encerrar o estímulo (Figura 1b). O aumento da fluorescência foi seguido por uma diminuição lenta, devido ...
Aqui demonstramos dois métodos para monitorar a endocitose da vesícula sináptica. O primeiro método, temos monitorado pHluorin fundiu-se com uma proteína de vesícula sináptica nos neurônios transfectadas e posteriormente eletricamente estimulado. Em segundo lugar, usamos EM imagem latente de captação HRP como induzida por KCl. Usamos diferentes estímulos por duas razões. Primeiro, aplicação elevada de potássio induz a despolarização dos neurônios todos na cultura. Isso facilita o exame EM, dado que a no...
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecemos o Dr. Yong-Ling Zhu por prevê construção Sinaptofisina-pHluorin2x e Dr. James E. Rothman fornecendo VAMP2-phluorin. Agradecemos o Dr. Susan Cheng e Virginia Crocker da facilidade de microscopia eletrônica de NINDS pelo apoio técnico e ajuda. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Disorders Neurological e curso Intramural Research Program nos EUA e uma bolsa da KRIBB iniciativa programa de pesquisa (Korean biomédica cientista Fellowship Program), Instituto de pesquisa da Coreia do Biociências e biotecnologia, República da Coreia.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Lipofectamine LTX with Plus | Thermo Fisher | 15338-100 | Transfection of plasmid DNA including synaptophysin or VAMP2-pHluorin |
neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103-049 | Growth medium for neuron, Warm up to 37°C before use |
B27 | Thermo Fisher | 17504-044 | Gradient for neuronal differentiation |
Glutamax | Thermo Fisher | 35050-061 | Gradient for neuronal culture |
Poly-D-Lysine coated coverslip | Neuvitro | GG-25-pdl | Substrate for neuronal growth and imaging of pHluorin |
Trypsin XI from bovine pancrease | Sigma | T1005 | Neuronal culture-digest hippocampal tissues |
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D5025 | Neuronal culture-inhibits viscous cell suspension |
pulse stimulator | A-M systems | model 2100 | Apply electrical stimulation |
Slotted bath with field stimulation | Warner Instruments | RC-21BRFS | Apply electrical stimulation |
stimulus isolation unit | Warner Instruments | SIU102 | Apply electrical stimulation |
lubricant | Dow corning | 111 | pHluorin imaging-seal with coverslip and imaging chamber, avoid leak from chamber |
AP5 | Tocris | 3693 | Gradient for normal saline, selective NMDA receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity |
CNQX | Tocris | 190 | Gradient for normal saline, competitive AMPA/kainate receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity |
Illuminator | Nikon | C-HGFI | Metal halide light source for pHluorin |
EMCCD camera | Andor | iXon3 | pHluorin imaging, detect pHluorin fluorescence intensity |
Inverted microscopy | Nikon | Ti-E | Imaging for synaptophysin or VAMP2 pHluorin transfected cells |
NIS-Elements AR | Nikon | NIS-Elements Advanced Research | Software for imaging acquisition and analysis |
Igor Pro | WaveMetrics | Igor pro | Software for imaging analysis and data presentation |
imaging chamber | Warner Instruments | RC21B | pHluorin imaging, apply field stimulation on living cells |
poly-l-lysine | Sigma | P4832 | Electron microscopy, substrate for neuronal growth, apply on multiwell plate for 1 h at room temperature then wash with sterilized water 3 times |
Horseradish peroxidase(HRP) | Sigma | P6782 | Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by catalyzing DAB in presence hydrogen peroxide, final concentration is 5 mg/mL in normal saline, make fresh before use |
Na cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | Electron microscopy, buffer for fixatives and washing, final concentration is 0.1 N |
3,3′-Diaminobenzidine(DAB) | Sigma | D8001 | Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles, substrate for HRP, final concentration is 0.5 mg/mL in DDW and filtered, make fresh before use |
Hydrogen peroxide solution | Sigma | H1009 | Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by inducing HRP-DAB reaction, final concentration is 0.3% in DDW, make fresh before use |
glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16365 | Electron microscopy, fixatives, final concentration is 4% in Na-cacodylate buffer, make fresh before use, shake well before to use |
TEM | JEOL | 200CX | Electron microscopy, imaging of endocytosed vesicles and ultrastructural changes |
CCD digital camera | AMT | XR-100 | Electron microscopy, capturing images |
Lead citrate | Leica microsystems | 16707235 | Electron microscopy, grid staining |
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