Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
Синаптических пузырьков эндоцитоза обнаруживается световой микроскопии pHluorin сливается с синаптических пузырьков белка и электронной микроскопии везикул поглощения.
Во время эндоцитоза расплавленный синаптических пузырьков извлекаются на нервные окончания, позволяя для рециркуляции везикул и, таким образом, поддержание синаптической передачи во время повторяющихся нервных стрельбы. Нарушением эндоцитоза в патологических условиях приводит к уменьшается в синаптической силы и мозга функции. Здесь мы описываем методы, используемые для измерения эндоцитоза синаптических пузырьков на млекопитающих гиппокампа синапсов в нейрональных культуры. Мы мониторинг синаптических пузырьков белка эндоцитоза путем сплавления синаптических везикулярного мембранный белок, включая synaptophysin и VAMP2/Синаптобревин, на стороне везикулярного lumenal, с pHluorin, рН чувствительных Зеленый флуоресцирующий белок, который увеличивает его увеличивает интенсивность флуоресценции как pH. Во время экзоцитоз везикулярной люмен рН увеличивается, тогда как во время эндоцитоза везикулярного люмен рН восстановления подкисленных. Таким образом увеличение интенсивности флуоресценции pHluorin указывает фьюжн, а уменьшение эндоцитоза помечены синаптических пузырьков белка. Помимо использования метода pHluorin изображений для записи эндоцитоза, мы контролируется везикулярного мембраны эндоцитоза измерениями электронной микроскопии (EM) хрен пероксидазы (ПХ) поглощения везикулы. Наконец мы за формирование нервных терминал мембраны ямы в разное время после высокой калия индуцированной деполяризации. Время курс HRP поглощения и мембраны яму формирования указывает время курс эндоцитоз.
Медиаторы хранятся в синаптических пузырьков и выпущенный экзоцитоз. Синаптических везикул мембранных белков затем учитываются путем эндоцитоза и повторно в следующем раунде экзоцитоз. Эндоцитоза синаптических пузырьков имеет важное значение для поддержания синаптических пузырьков бассейны и удаляет выступающих везикулы от плазматической мембраны. РН чувствительных Зеленый флуоресцирующий белок pHluorin, которая угасает в кислотных обстоятельствах и dequenched в нейтральном pH, был использован для измерения времени эндоцитоза курсы в живой клетки1,2,3. PHluorin белок обычно прикрепляется к lumenal стороне синаптических пузырьков белков, таких как synaptophysin или VAMP2/Синаптобревин. В состоянии покоя pHluorin закаленного в 5,5 рН люмен синаптических пузырьков. Сплавливание Vesicle к плазматической мембраны предоставляет везикулярного просвета в внеклеточной решение, где pH ~ 7.3, что привело к увеличению в pHluorin флуоресценции. После экзоцитоз увеличение флуоресценции распадов, благодаря эндоцитоза синаптических пузырьков белков, следуют везикул повторного подкисления в рамках этих восстановленных везикулы. Хотя распад отражает эндоцитоза и везикулярного восстановление подкисления, она главным образом отражает эндоцитоза, потому что восстановление подкисления быстрее, чем эндоцитоза в большинстве условий1,4. Постоянная времени восстановления подкисления является 3-4 s или менее5,6, который обычно быстрее, чем 10 s или более необходимые для везикул эндоцитоза4,5. Если эксперименты необходимо различать эндоцитоза от повторного подкисления, кислоты тушения эксперименты, используя 4-Morpholineethanesulfonic кислота (MES) решение (25 мм) с рН 5,5 может использоваться для определения, извлекаются ли белки синаптических пузырьков из плазматической мембраны через эндоцитоза1,3,4. Таким образом увеличение интенсивности флуоресценции pHluorin отражает баланс экзо - и эндоцитоза, и уменьшение после стимуляции нерва конкретно отражает эндоцитоз.
pHluorin изображений может использоваться не только для того, чтобы измерить время курс эндоцитоза, но и размер синаптических пузырьков бассейны7,8, и вероятность вызвали выпуска и спонтанное выпуск9. Многие факторы и белков, участвующих в регулировании эндоцитоза, таких как кальций, растворимые NSF-вложение белка рецептора (SNARE) белки, factor(BDNF) мозга нейротрофического и кальциневрина были определены с использованием pHluorin изображений1 , 2 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16. Кроме того, освобождение нейромедиатора могут быть обнаружены в нейроны не только основного, но в нейробластома клеток с TIRFM17. Недавно варианты pHluorin, dsRed, mOrange и pHTomato были разработаны для мониторинга одновременной записи множества факторов в одном синапса18,19. К примеру pHTomato сливается с synaptophysin и используется с индикатором генетически закодированный кальция (GCaMP5K) для мониторинга Пресинаптический везикул фьюжн и Ca2 + приток в постсинаптической отсека20. Таким образом pHluorin, придает синаптических белков предоставляет полезный метод для анализа взаимосвязи между эндоцитоза и экзоцитоз.
EM является еще одним методом, обычно используется для изучения эндоцитоза, благодаря высоким пространственным разрешением, которая показывает ультраструктурные изменения во время эндоцитоз. Две общие области являются способность визуализировать патологические изменения в нейрональных клеток21 и отслеживать везикул белки22. В частности наблюдение за поглощение синаптических пузырьков, мембраны кривизны покрытием Клатрин в зоне periactive, и от англ структуры возможны с EM3,23,24,25 ,26,27,28. В то время как EM включает потенциальных артефактов, таких как фиксатор индуцированной пороков, которые могут повлиять на эндоцитоза, и анализ данных является трудоемким, резолюция обеспечивает привлекательной возможностью для визуализации клеточной структуры. Под высоким давлением, замораживания, предоставляя быстрый и не химический метод стабилизации деликатные структуры, присутствующие во время эндоцитоза27может преодолеть потенциальные фиксирующие проблемы и ограничения в EM временное разрешение.
Примечание: следующий протокол описывает методы визуализации pHluorin и EM методы, используемые в культивированный Нейроны гиппокампа. pHluorin мониторы синаптических пузырьков белка поглощения в живых клетках и EM обнаруживает усвоение синаптических пузырьков и ультраструктурные изменения.
Уход за животными и процедура руководящими низ и были одобрены NIH животных ухода и использования Комитетом.
1. pHluorin Imaging
2. Электронная микроскопия
С помощью метода перевозчик липидов, SpH была выражена в Нейроны гиппокампа, позволяя для идентификации boutons (рис. 1a). Электрическая стимуляция клеток индуцированной экзоцитоз и соответствующее увеличение интенсивности флуоресценции. Увеличение флуоре...
Здесь мы продемонстрировать два метода для мониторинга синаптических пузырьков эндоцитоз. В первом методе мы наблюдает pHluorin сливается с протеином синаптических пузырьков в transfected нейронов и впоследствии электрически стимулировали. Во-вторых мы использовали EM изображений HRP поглощен?...
Авторы не имеют ничего сообщать.
Мы благодарим д-р Ён-Линг Zhu за предоставление synaptophysin-pHluorin2x конструкцию и д-р Джеймс э. Ротман для обеспечения VAMP2-phluorin. Мы благодарим д-р Сьюзен Чэн и Вирджиния Crocker NINDS микроскопии фонда за их техническую поддержку и помощь. Эта работа была поддержана Национальный институт неврологических нарушений и инсульта интрамуральных исследовательской программы в США и Грант от KRIBB исследовательской инициативе программы (корейский биомедицинских ученый программа стипендий), Корея научно-исследовательский институт Бионауки и биотехнологии, Республика Корея.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Lipofectamine LTX with Plus | Thermo Fisher | 15338-100 | Transfection of plasmid DNA including synaptophysin or VAMP2-pHluorin |
neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103-049 | Growth medium for neuron, Warm up to 37°C before use |
B27 | Thermo Fisher | 17504-044 | Gradient for neuronal differentiation |
Glutamax | Thermo Fisher | 35050-061 | Gradient for neuronal culture |
Poly-D-Lysine coated coverslip | Neuvitro | GG-25-pdl | Substrate for neuronal growth and imaging of pHluorin |
Trypsin XI from bovine pancrease | Sigma | T1005 | Neuronal culture-digest hippocampal tissues |
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D5025 | Neuronal culture-inhibits viscous cell suspension |
pulse stimulator | A-M systems | model 2100 | Apply electrical stimulation |
Slotted bath with field stimulation | Warner Instruments | RC-21BRFS | Apply electrical stimulation |
stimulus isolation unit | Warner Instruments | SIU102 | Apply electrical stimulation |
lubricant | Dow corning | 111 | pHluorin imaging-seal with coverslip and imaging chamber, avoid leak from chamber |
AP5 | Tocris | 3693 | Gradient for normal saline, selective NMDA receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity |
CNQX | Tocris | 190 | Gradient for normal saline, competitive AMPA/kainate receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity |
Illuminator | Nikon | C-HGFI | Metal halide light source for pHluorin |
EMCCD camera | Andor | iXon3 | pHluorin imaging, detect pHluorin fluorescence intensity |
Inverted microscopy | Nikon | Ti-E | Imaging for synaptophysin or VAMP2 pHluorin transfected cells |
NIS-Elements AR | Nikon | NIS-Elements Advanced Research | Software for imaging acquisition and analysis |
Igor Pro | WaveMetrics | Igor pro | Software for imaging analysis and data presentation |
imaging chamber | Warner Instruments | RC21B | pHluorin imaging, apply field stimulation on living cells |
poly-l-lysine | Sigma | P4832 | Electron microscopy, substrate for neuronal growth, apply on multiwell plate for 1 h at room temperature then wash with sterilized water 3 times |
Horseradish peroxidase(HRP) | Sigma | P6782 | Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by catalyzing DAB in presence hydrogen peroxide, final concentration is 5 mg/mL in normal saline, make fresh before use |
Na cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | Electron microscopy, buffer for fixatives and washing, final concentration is 0.1 N |
3,3′-Diaminobenzidine(DAB) | Sigma | D8001 | Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles, substrate for HRP, final concentration is 0.5 mg/mL in DDW and filtered, make fresh before use |
Hydrogen peroxide solution | Sigma | H1009 | Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by inducing HRP-DAB reaction, final concentration is 0.3% in DDW, make fresh before use |
glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16365 | Electron microscopy, fixatives, final concentration is 4% in Na-cacodylate buffer, make fresh before use, shake well before to use |
TEM | JEOL | 200CX | Electron microscopy, imaging of endocytosed vesicles and ultrastructural changes |
CCD digital camera | AMT | XR-100 | Electron microscopy, capturing images |
Lead citrate | Leica microsystems | 16707235 | Electron microscopy, grid staining |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены