In Vivo Imagem de Eficiências de Transdução de Peptídeo de Direcionamento Cardíaco

Resumo

Descrevemos protocolos para avaliar o grau de transdução por peptídeos penetrantes por células utilizando sistemas de imagem ex vivo seguidos de incorporação de parafina, secção e microscopia fluorescente confocal usando peptídeos cardíacos como exemplo. Em nosso protocolo, um único animal pode ser usado para adquirir ambos os tipos de avaliação de imagem dos mesmos órgãos, reduzindo o número de animais necessários para estudos pela metade.

Resumo

Desde a descrição inicial dos domínios de transdução de proteínas, também conhecidos como peptídeos penetrantes celulares, há mais de 25 anos, tem havido intenso interesse no desenvolvimento desses peptídeos, especialmente os específicos de células, como novos vetores para a entrega de materiais diagnósticos e terapêuticos. Nosso trabalho anterior envolvendo exibição de phage identificou um novo, nonnaturally ocorrido, 12 peptídeos de aminoácidos de comprimento que chamamos de peptídeo de alvo cardíaco (CTP) devido à sua capacidade de transdufar tecido cardíaco normal in vivo com captação máxima vista em apenas 15 minutos após uma injeção intravenosa. Realizamos estudos detalhados de biodistribução injetando CTP rotulado com cianeina fluorofora5.5, permitindo que ele circule por vários períodos de tempo, e eutanásia, fixação e secção de múltiplos órgãos seguidos de imagens de microscopia fluorescente. Nesta publicação, descrevemos esses processos, bem como ex vivo de imagens de órgãos colhidos utilizando um sistema de imagem in vivo em detalhes. Fornecemos metodologias e práticas detalhadas para a realização de estudos de transdução, bem como estudos de biodistribução utilizando o CTP como exemplo.

Introdução

A membrana plasmática celular é uma barreira semipermeável que é essencial para a integridade e sobrevivência celular e serve para regular o interior da célula controlando o movimento das substâncias para dentro da célula. Embora vital para a sobrevivência, também apresenta uma barreira para a entrega de carga para a célula. Em 1988, o trans-ativador da proteína de transcrição (Tat) do vírus da imunodeficiência humana foi mostrado para entrar em células cultivadas e promover a expressão genética viral^1,,2, com os domínios responsáveis por essa transdução limitada a uma região rica em arginina e liinoácidos da terceira hélice³ Estes foram assim chamados peptídeos penetrantes de células (CPPs). Isso foi seguido por pesquisas que mostram a capacidade do peptídeo Tat de transportar β-galactosidase funcional em múltiplos tipos de células⁴. Desde a descrição inicial, o número de peptídeos penetrantes por células aumentou dramaticamente. Esses domínios de transdução são peptídeos curtos naturais ou sintéticos, tipicamente de 6 a 20 aminoácidos de comprimento, que são capazes de transportar cargas funcionais através de membranas celulares. Essas cargas podem variar de outros pequenos peptídeos, proteínas de comprimento total, ácidos nucleicos, nanopartículas, partículas virais, moléculas fluorescentes e radioisótopos⁵. Os CPPs iniciais descritos não eram específicos de células, com Tat sendo tomada por vários tipos de células e até mesmo cruzando a barreira hemencefálica⁴, limitando assim seu potencial terapêutico. Para identificar CPPs específicos para células, os investigadores realizaram uma exibição de phage utilizando grandes bibliotecas de phage disponíveis comercialmente⁶. Nosso próprio trabalho utilizando uma metodologia combinatória de exibição in vitro e in vivo phage levou à identificação de um CPP chamado peptídeo de alvo cardíaco (CTP)⁷, um peptídeo de 12 aminoácidos, que ocorre nonnaturalmente (NH₂-APWHLSSQYSRT-COOH) que tem como alvo o coração com pico de captação de 15 minutos após uma injeção intravenosa periférica⁸. Utilizando a colocalização imunofluorescente com actina, um marcador intracelular, e exclusão de laminina, um marcador de membrana celular, mostramos que a CTP é internalizada em cardiomiócitos de camundongos após uma injeção intravenosa⁷. Além disso, incubamos cardiomiócitos pluripotentes induzidos por células-tronco induzidos por humanos com CTP de dupla rotulação, rotulado com 6-carboxyfluoresceína em seu C-terminus e rhodamina em seu n-terminus através de uma ligação ester que só poderia ser cortada por esterases intracelulares. O rápido acúmulo de rhodamina em cardiomiócitos de espancamento foi observado dentro de 15 minutos na microscopia confocal⁸.

Neste artigo, apresentamos duas metodologias complementares que podem ser utilizadas para rastrear a biodistribução e confirmar a internalização específica do tecido das CPPs usando CTP como exemplo. Para essas metodologias, a CTP foi sintetizada, fluorescentemente rotulada no N-terminus com cianeto5.5 (CY5.5), e com amida-tampada no C-terminus para maior estabilidade do peptídeo. As duas metodologias utilizadas são sistemas de imagem óptica fluorescente in vivo e microscopia fluorescente de seções teciduais. Ambos os métodos são muito úteis no estudo da biodistribução, absorção e eliminação de CPPs fluorescentes rotulados. A vantagem de avaliar a biodistribução usando esses métodos em relação a outros, como tomografia de emissão de fótons único (SPECT) ou tomografia de emissão de pósitrons (PET), é que não há necessidade de rotulagem de radiolacção intensiva de CPPs em comparação com a rotulagem fluorescente, que é relativamente fácil e em uso rotineiro em todas as instalações de síntese de peptídeos. O uso de imagens in vivo produz rapidamente dados de biodistribução no contexto de um sistema vivo, enquanto a secção fornece maior informação aprofundada sobre a absorção de peptídeos e a localização dentro das células através da preservação de detalhes morfológicos. Este protocolo pode ser aplicado a uma grande variedade de órgãos e tecidos como coração, pulmão, fígado, rim, cérebro, baço, estômago, intestino grosso, intestino delgado, músculo esquelético, osso, testículos/ovários e olhos.

   

Protocolo

O Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Pittsburgh aprovou todos os protocolos de animais especificados nesta publicação antes de realizar qualquer um desses experimentos em animais.

NOTA: Este protocolo detalha como realizar estudos de biodistribução ex vivo utilizando imagens fluorescentes ópticas ex vivo seguidas de estudos de biodistribução in vivo incorporando os órgãos em parafina, secção e realização de microscopia fluorescente. Embora o CTP seja usado como exemplo, este método pode ser aplicado a qualquer CPP rotulado fluorescentemente.

1. Imagem in vivo

1. Sintetizar CTP utilizando técnicas de síntese de fase sólida^9,10 de uma instalação de síntese de peptídeos usando L-aminoácidos com um N-terminus rotulado com Cy5.5 e C-terminus amide-capped para maior estabilidade.
   NOTA: Todos os CPPs sintetizados devem ser caracterizados por meio de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) e/ou desorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI) antes do uso¹¹.
2. Faça uma solução de estoque de 1 mM ou 10 mM de CTP em sulfóxido de dimetila (DMSO), aliquot e armazene a -80 °C, protegido por luz.
   NOTA: Os peptídeos são entregues como pó liofilizado. O pó linofilizado pode ser armazenado a longo prazo (6 meses-2 anos) em -20 °C, protegido pela luz e sob condições higroscópicas. Quando aliquoso em DMSO e armazenados, os ciclos de congelamento devem ser evitados.
3. Pesar e anestesiar camundongos cd1 de 6 semanas de idade usando 2 μL/g de peso tecidual de uma solução de cetamina/xilazina (100 mg/kg de cetamina e 20 mg/kg xylazine) administrados intramuscularmente (perna traseira) ou intraperitoneal (quadrante inferior esquerdo).
   NOTA: As soluções de cetamina/xilazina devem ser feitas frescas no dia do uso. A cetamina/xilazina não utilizada deve ser eliminada adequadamente e os volumes utilizados versus volumes descartados em um tronco, uma vez que a cetamina é uma substância controlada. O nível adequado de anestesia será alcançado em 5-7 min, conforme avaliado pela falta de resposta a uma pitada de dedo do dedo do dedo.
4. Calcule uma dose de 10 mg/kg de Cy5.5-CTP, dilua com soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) para não mais de 200 μL, e injete retro-orbitalmente ou através da injeção da veia traseira usando uma seringa de insulina(Figura 1A).
5. Deixe que o peptídeo circule pelo tempo pré-especificado, variando de 15 min-6 h.
6. Eutanize o camundongo utilizando o método inalatório de CO₂ elevado, conforme especificado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais e abra a cavidade torácica usando uma tesoura(Figura 1B).
7. Use uma tesoura para colocar um pequeno corte na parede lateral e livre do átrio direito e injetar 3 mL de fosfato formalina tamponado de 10% usando uma agulha de 26 G para o duplo propósito de fixação dos órgãos do mouse e descarga de glóbulos vermelhos(Figura 1C).
8. Disseque coração, pulmão, fígado, rins, baço, intestino grosso, intestinos delgados, bexiga, ovários/testículos, e cérebro e coloque em poços individuais de uma placa de 12 poços para imagem óptica ex vivo(Figura 1D).
9. Inicie o software de aquisição de imagens e clique no botão Iniciar para preparar o sistema para amostras de imagens. Abra o assistente de imagem, selecione fluorescência e, em seguida, estruca o corante Cy5.5 da lista de corantes para aplicar 580 nm excitação e filtros de emissão de 620 nm. Selecione as configurações manuais para parâmetros de exposição e, em seguida, defina a posição do palco para B, defina o tempo de exposição para 1 segundo, defina o F/stop para 8 e defina a binning para pequena.
   NOTA: Os filtros de emissão de excitação variam dependendo do rótulo utilizado. A excitação e a emissão do rótulo utilizado podem ser introduzidos manualmente para que o software atribua filtros de excitação e emissão. Certifique-se de que as contagens estão entre 600-60.000 para evitar a saturação. Dependendo do sistema que está sendo utilizado, a otimização automática de aquisição pode estar disponível. Se o sistema tiver compensação para comparar imagens adquiridas com diferentes configurações, as configurações automáticas podem ser usadas. Se não houver compensação disponível, as configurações precisarão ser determinadas, salvas e usadas consistentemente entre as amostras.
10. Quando o sistema estiver completamente inicializado, organize os órgãos de interesse em uma placa de 12 poços e coloque-o dentro da câmara de imagem óptica, garantindo que as amostras sejam organizadas conforme desejado para as imagens. Selecione a aquisição e selecione um local de salvamento para as imagens. Informações sobre o mouse podem ser escritas na janela pop-up de etiquetas de imagem de edição.
11. Após a imagem, remova as amostras da câmara e armazene em fosfato de formalina 10% tamponado em um volume pelo menos 20 vezes o volume do tecido em frascos de cintilação com proteção luminosa à temperatura ambiente (RT).
12. Quantifique as imagens definindo unidades para A Eficiência Radiante, selecionando o ROI 4x3 e ajustando-se para encaixar cada poço em um quadrado do ROI uniformemente, seguido pela medida de clique. Abra a guia de medição do ROI da grade, selecione a exportação e salve as medidas como um arquivo .cvs.

2. Histologia

NOTA: Siga as etapas 1.1-1.8 para obter diferentes órgãos. Alternativamente, os mesmos órgãos que foram imageados podem ser colocados em formalina imediatamente e usados para secção conforme detalhado abaixo.

1. Armazene cada órgão individualmente em fosfato de formalina tamponada de 10% por um mínimo de 48 h antes de processar para histologia.
2. Quando os órgãos estiverem suficientemente fixos após 48h, transfira os órgãos para o processamento tecidual e incorpore e coloque em uma máquina de processamento de tecidos(Figura 1E).
3. Defina a máquina de processamento para desidratar o tecido em 70% de etanol por 30 min, seguido de 80% de etanol para 30 min, 95% de etanol para 30 min, 95% de etanol por 30 min, 100% etanol por 15 min, 100% etanol por 20 min e, finalmente, 100% etanol por 20 min.
4. Limpe o tecido em xileno 2x, com 30 minutos para cada tratamento de xileno.
5. Infiltrar-se no tecido limpo com cera de parafina 4x a 60 °C por 30 minutos a cada tratamento.
6. Incorporar em parafina usando moldes de metal. Encha o molde com parafina derretida (mantida a 65 °C) e transfira para uma placa fria. À medida que a parafina na parte inferior do molde começa a se solidificar, coloque o órgão na parafina(Figura 1F).
7. Coloque uma fita adesia rotulada em cima do molde como apoio e enchimento com parafina derretida. Deixe esfriar até ficar sólido. Em seguida, armazene o bloco em um congelador de -20 °C durante a noite, permitindo que a cera encolha ainda mais para fácil remoção dos moldes.
   NOTA: Os blocos agora podem ser armazenados em RT com proteção contra luz.
8. Prepare um banho de água de 38 °C com água destilada. Configure o microtome com um ângulo de lâmina de 6° e uma espessura de seção de 10 μm.
9. Monte os blocos teciduais no microtoma e comece a cortar até que seções que contenham tecido sejam obtidas. Em seguida, coloque os blocos de frente para baixo na água por 5 minutos ou até que o tecido tenha absorvido alguma umidade (por exemplo, quando um contorno branco fino do tecido aparece no bloco [Figura 1G]).
   NOTA: A lâmina deve ser substituída com frequência para garantir a qualidade das seções.
10. Coloque o tecido sobre um bloco de gelo plano por 10 minutos, depois devolva-o ao microtome na mesma orientação que na etapa 2.9. Comece a tomar seções e permita que seções truncadas formem fitas longas de 6 a 10 seções cada. Descarte fitas de parafina subótimas até que uma fita de alta qualidade de comprimento suficiente para cobrir um slide seja produzida. Otimize a secção ajustando as velocidades de corte, a hidratação dos tecidos e a temperatura do banho de água, a fim de evitar o corte ou rugas das seções teciduais.
    NOTA: Devem ser descartadas seções que tenham orifícios onde o tecido caiu, rasgos no tecido ou rugas apertadas e dobras no tecido.
11. Escolha cuidadosamente a fita de qualidade escolhida com fórceps de borda sem corte e flutue na superfície do banho de água de 38 °C. Deixe as seções sentarem na superfície até que suavizem, tomando cuidado para não deixá-las muito tempo para evitar que a parafina se desinte com a separação e despedaçasse a seção.
12. Flutue as seções achatadas para a superfície de lâminas de vidro limpas. Coloque os slides em um forno de 65 °C por 30 minutos para derreter a cera.
    NOTA: Estes slides podem ser armazenados em RT com proteção contra luz.
13. Desparafinar os slides em xileno 3x, 10 min para cada tratamento.
14. Reidratar o tecido em 100% etanol por 5 min, seguido por 95% de etanol por 5 min, 70% etanol por 5 min, 50% etanol por 5 min, e finalmente 1x soro fisiológico tris-tampão (TBS) por 5 min (Figura 1H). Deixe os slides secarem durante a noite.
    NOTA: Estes slides podem ser armazenados a longo prazo no RT, desde que estejam protegidos pela luz.
15. Monte os slides com tampas usando 125 μL de mídia de montagem contendo 4′,6-diamidino-2-fenilôndole (DAPI), uma sonda fluorescente nuclear(Figura 1I). Lâminas secas durante a noite no RT, protegidas pela luz.
    NOTA: As lâminas secas podem ser armazenadas a longo prazo a 4 °C, protegidas por luz.
16. Slides de imagem usando microscopia fluorescente.
    NOTA: Imagens saturadas devem ser evitadas, pois não são quantitativamente úteis. O ajuste das configurações de exposição e ganho pode ser reduzido para evitar a saturação. Tenha o cuidado de usar as mesmas configurações em todas as amostras que estão sendo comparadas. Evite branqueamento do tecido limitando os tempos de exposição.

Resultados

Usando este protocolo, tratamos três camundongos com uma dose de 10 mg/kg de Cy5.5-CTP através de uma injeção retro-orbital(Figura 1A). Depois de permitir que o peptídeo circulasse por 15 minutos, os camundongos foram eutanizados usando uma câmara de CO_2, o peito aberto através de uma incisão de esternotomia mediana, o átrio direito foi cortado, e a perfusão de camundongos fixada usando 3 mL de formalina tamponada de fosfato de 10%(Figura 1B,C). Após a fixação, o coração, pulmões, fígado, rim, baço e cérebro foram dissecados e dispostos em uma placa de 12 poços para imagem fluorescente óptica ex vivo(Figura 1D e Figura 2A). Três camundongos de controle sem injeções também foram perfundidos, dissecados e imageados(Figura 1B-D e Figura 2B). Os dados de fluorescência adquiridos para cada conjunto de órgãos podem ser comparados devido à contagem sendo convertida em eficiência radiante, a unidade relativa de fluorescência do software de imagem. Esses dados podem ser quantificados para produzir imagens qualitativas e dados quantitativos para cada órgão em questão (Figura 2C) em diferentes pontos de tempo para estudos de biodistribução. A autofluorescência de diferentes órgãos em resposta a diferentes comprimentos de onda de excitação é demonstrada na Figura 3A−E. Comprimentos de onda de excitação mais curtos, como o aumento da proteína fluorescente verde (EGFP), estão associados com maior autofluorescência, especialmente no fígado e no cérebro, do que os comprimentos de onda de excitação de vermelho-distante (Cy5.5) ou próximos (Cy7)(Figura 3). Os órgãos de imagem foram fixados em formalina tamponada de fosfato de 10% na RT por um mínimo de 48 h, seguida de transferência para processamento tecidual e incorporação de(Figura 1E). Os órgãos foram processados e parafinados em uma máquina de processamento de tecidos, posicionados em moldes cheios de parafina, congelados em um estágio de -20 °C, e armazenados durante a noite a -20 °C (Figura 1F). As amostras foram seccionadas(Figura 1G) e tratadas com trocas de solução para reidratar o tecido(Figura 1H). Os slides preparados foram então montados com meio de montagem fluorescente DAPI(Figura 1I). Uma vez secos, geralmente durante a noite, os slides foram imagens usando microscopia fluorescente. Imagens representativas de cada órgão de um rato são mostradas na Figura 4A. As imagens de diferentes órgãos foram adquiridas utilizando configurações idênticas para permitir a comparação entre camundongos e permitir quantificação(Figura 4B).

Figura 1: Colhendo órgãos de camundongos para imagem fluorescente óptica ex vivo e secção. (A) Rato tipo selvagem injetado retro-orbitalmente com CTP-Cy5.5. (B) Mouse dissecado com peito aberto, átrio direito cortado, para fixação de perfusão. (C) Coração injetado com 3 mL de fosfato formalina tamponado de 10% para fixação de perfusão do animal. (D) Órgãos de interesse colhidos e dispostos em uma placa de 12 poços para imagem óptica fluorescente. (E) Coração carregado em um e processado usando um processador de tecido. (F) Coração embutido na parafina. (G) Coração seccionado em um microtome. (H) Slides desparaffinizados através de uma série de trocas de soluções. (I) Seções montadas com deslizamentos de tampas utilizando DAPI. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Imagens representativas de órgãos tratados e de controle. (A) Órgãos de um rato tratado com 10 mg/kg CTP-Cy5.5. (B) Órgãos de um rato de controle não tratado. (C) Quantificação da fluorescência para cada conjunto de órgãos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Órgãos de camundongos não tratados retratados em diferentes comprimentos de onda de emissão de excitação para demonstrar como comprimentos de onda mais longos produzem menos autofluorescência. (A) Cy7: 740-790. (B) Cy5.5: 660-710. (C) Cy5: 620-670. (D) Cy3: 520-570. (E) EGFP: 480-520. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Transdução de coração, pulmão, fígado e rim após injeção intravenosa em camundongos. Os camundongos do tipo selvagem foram injetados com 10 mg/kg de Cy5.5-CTP, ou um peptídeo aleatório (RAN-Cy5.5), e eutanizados nos pontos de tempo indicados. (A) A transdução de pico do tecido cardíaco foi observada em 15 min com diminuição constante da fluorescência ao longo do tempo. Alguma captação capilar foi notada nos pulmões com transdução robusta no fígado, bem como nos capilares glomerulares renais, este último implicando um mecanismo renal de excreção. (B) Quantificação da intensidade fluorescente mostra aumento significativo da absorção cardíaca de CTP-Cy5.5 sobre RAN-Cy5.5. Barra de escala = 500 μm. Este número foi modificado de Zahid et al.⁸. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Modelos animais são essenciais para o desenvolvimento de medicamentos pré-clínicos em todas as etapas do processo, desde a identificação de novos CPPs, estudos de biodistribução, mecanismo de transdução, até, em última instância, testes para a eficácia da carga entregue usando esses novos CPPs como vetores. Existem muitos métodos comumente usados disponíveis para avaliar a biodistribução, como histologia, imagem de medicina nuclear (SPECT e PET), e imagem óptica in vivo¹². Os métodos de imagem nuclear podem ser complicados devido à disponibilidade limitada de pequenos sistemas SPECT e PET animais, bem como a capacidade de produzir conjugados radiolabel-droga, que requerem a experiência de um radioquímico. Em contraste, os rótulos fluorescentes são muito mais simples e podem ser econômicos para trabalhar. O protocolo descrito neste artigo permite uma análise rápida da biodistribução utilizando múltiplos métodos. A imagem óptica fluorescente de órgãos ex vivo permite a comparação imediata da fluorescência em diferentes tecidos e grupos de tratamento e pode identificar a captação de órgãos e o tempo para o pico de captação de órgãos de interesse de forma semiquantitativa. A histologia quantitativa do tecido requer processamento mais extenso para tratar, seção, imagem e analisar tecidos, mas fornece mais dados sobre o nível microscópico e é uma técnica padrão atual. Vale ressaltar que a comparação direta e quantitativa entre as duas técnicas não é possível, pois a autofluorescência observada com cada técnica para diferentes órgãos e comprimentos de onda de excitação varia significativamente.

Uma parte importante deste protocolo é selecionar o fluoróforo certo para rotular CPPs candidatos para experimentos. Um problema em potencial é a sobreposição de espectros, o que pode ser problemático quando são necessários fluoroforos múltiplos. A mídia de montagem fluorescente DAPI e cy5.5 não têm espectros sobrepostos. No entanto, para certas aplicações onde são necessários fluoroforos múltiplos, o risco de sobreposição espectral precisa ser cuidadosamente considerado. Dependendo do sistema que está sendo utilizado, a seleção fluorófora pode ser limitada. Portanto, o conhecimento das capacidades do sistema é fundamental. Sistemas ópticos fluorescentes são melhor utilizados com fluoroforos vermelhos ou quase infravermelhos devido à alta absorção tecidual de comprimentos de onda mais curtos¹³. Fluoroforos na gama de proteína fluorescente verde aumentada têm uma grande limitação, porque há autofluorescência significativa de órgãos vistas em seu comprimento de onda de excitação, especificamente no cérebro e tecido hepático. Dependendo das condições de um experimento, alguns fluoroforos são melhor evitados. Alguns fluoroforos orgânicos solúveis em água têm uma forte interação com bicamadas lipídicas, o que pode causar falsos positivos. Assim, tomar medidas para determinar se um fluoróforo tem forte afinidade com o tecido de interesse é aconselhável¹⁴. Outro fator a considerar é selecionar o método apropriado de conjugação fluorófora, que pode ser um parâmetro importante que afeta os resultados. Os CPPs podem ser rotulados fluorescentemente no n- ou C-terminus através de uma ligação covalente entre o N-terminus do peptídeo e o grupo carboxyl do corante como Cy5.5-NHS. Deve-se tomar cuidado, pois o mecanismo de transdução da maioria das CPPs não é compreendido em detalhes e a conjugação em uma extremidade pode afetar mais o mecanismo de absorção do que na outra extremidade. Outra possibilidade de rotular CPPs é através da biotininging do N-terminus para conjugação para streptavidina fluorescentemente rotulado. O uso dessa estratégia tem a conveniência de permitir que diferentes conjugados fluorescentes de streptavidina sejam utilizados. No entanto, uma possível limitação dessa estratégia é que um complexo biotina-streptavidina é uma grande construção, que poderia potencialmente interferir na transdução.

Sistemas de imagem óptica fluorescente são uma estratégia eficaz para gerar comparação da fluorescência entre diferentes órgãos e tratamentos de forma eficiente, mas são incapazes de produzir uma medida quantitativa de concentrações absolutas no tecido. Isso se deve aos efeitos de dispersão da luz dentro do tecido, que é ainda mais agravado pela variedade natural em tamanhos e densidades teciduais, e diferenças na vascularização, com dispersão variável de fluorescência. A autofluorescência tecidual também pode ser um fator, devido a fontes bioquímicas de ocorrência natural, como colágeno, ou fontes dietéticas como clorofila nos alimentos¹³.

A histologia é o método mais usado para medir a biodistribução e pode potencialmente ser usado para medir e comparar com precisão a absorção entre diferentes tecidos ao longo do tempo. Problemas de dispersão de luz são evitados usando este método porque todos os tecidos são seccionados para a mesma espessura¹⁵. Uma grande vantagem deste método é a capacidade de incluir rótulos fluorescentes adicionais para a imunohistoquímica. Embora a adição de outro fluoróforo possa tornar a imagem mais desafiadora, o uso de rótulos fluorescentes pode ser útil para a localização de um CPP para compartimentos intracelulares particulares, como lysosomes ou mitocôndrias. Um anticorpo poderia ser usado em um experimento de microscopia confocal para determinar se um CPP candidato transduzido coloca com uma estrutura de interesse, o que pode mostrar o potencial de um CPP como agente de entrega. Uma limitação deste método é que a preparação de slides a partir de amostras de órgãos pode ser demorada, trabalhosa intensiva e propensa a erro humano^12,15. Ao deslizar de imagem, deve-se tomar cuidado para não imaginar o mesmo local por muito tempo para evitar fotobleaching. Algumas fotos serão inevitáveis, dependendo da sensibilidade do fluoróforo. Deve-se tomar cuidado em cada etapa deste protocolo para proteger as amostras da luz ambiente e armazená-las adequadamente¹⁶. Recomendamos que os slides sejam armazenados a 4 °C, protegidos por luz, para imagens futuras.

Existem uma variedade de métodos disponíveis para medir a biodistribução de um CPP candidato que requerem equipamentos especializados e podem produzir resultados comparáveis, embora possam exigir rotulagem CPP mais complexa. O protocolo descrito neste artigo utiliza dois métodos compatíveis para produzir dados de biodistribução eficientemente no contexto de um sistema vivo, permitindo a aquisição de informações mais aprofundadas sobre a internalização do peptídeo dentro das células da mesma amostra, reduzindo pela metade o número de animais necessários para um estudo. Esses métodos foram utilizados para gerar os dados acima, que demonstram que ambos os métodos podem ser utilizados sequencialmente no mesmo animal, e a qualidade dos dados gerados por cada um. Nossos resultados também destacam a incapacidade de correlacionar diretamente os resultados entre as duas técnicas de forma quantitativa.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Buffered Formalin Phosphate	ThermoFisher	SF100-4
10x Tris Buffered Saline (TBS)	ThermoFisher	BP2471-1
12-well Cell Culture Plate	ThermoFisher	353043
1x TBS Solution			10x TBS is diluted 1:10 with deionized water. This solution can be stored at room temperature.
20 mL Scintillation Vials	Wheaton	334173
26G Needles	Becton Dickinson	305110
28G 0.5ml Insulin syringes	Becton Dickinson	329461
3mL Syringe	Becton Dickinson	309657
CD1 Mice	Charles River	022	6 to 12 week old albino, female mice
Cover Glass	ThermoFisher	12-544-14
Cy5.5-CTP-amide			Prepared by peptide synthesis, conjugated with Cy5.5 fluorophore, and purified using HPLC. Lyophilized powder is reconstituted in DMSO at 10mM concentration. After reconstituting, store at -80 °C.
Dapi Fluoromount G	SouthernBiotech	0100-20
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	99150-20
Ethanol
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08
Ketamine HCl 100mg/mL	KetaVed	NDC 50989-161-06
Ketamine/Xylazine Solution			Ketamine HCl is mixed with Xylazine 1:1 to produce a stock solution containing 50mg/mL ketamine and 10mg/mL Xylazine. This solution is made fresh before each use.
Leica RM2235 Rotary Microtome	Leica	RM2235
Microscope Slides	ThermoFisher	B9992000TN
Paraplast X-TRA	Sigma	P3808-1KG
Perkin Elmer Lumina S5 IVIS	Perkin Elmer	CLS148588
Sparkle Optical Lens Cleaner	ThermoFisher	NC0090079
Tissue-Tek Processing/Embedding Cassettes	ThermoFisher	NC9499605
Tissue-Tek VIP Processing machine	Tissue-Tek	VIP 5A-F1
Xylazine 20 mg/mL	AnaSed	NDC 59399-110-20
Xylenes	ThermoFisher	X5-4