In vivo Imaging di Efficienza trasduzione di Peptide Targeting Cardiac

Riepilogo

Descriviamo protocolli per valutare il grado di trasduzione mediante peptidi che penetrano nelle cellule utilizzando sistemi di imaging ex vivo seguiti dall'incorporamento della paraffina, dalla sezionamento e dalla microscopia fluorescente confocale utilizzando come esempio il peptide di puntamento cardiaco. Nel nostro protocollo, un singolo animale può essere utilizzato per acquisire entrambi i tipi di valutazione dell'imaging degli stessi organi, dimezzando così il numero di animali necessari per gli studi.

Abstract

Dalla descrizione iniziale dei domini di trasduzione delle proteine, noti anche come peptidi penetranti delle cellule, oltre 25 anni fa, c'è stato un forte interesse nello sviluppo di questi peptidi, in particolare quelli specifici delle cellule, come nuovi vettori per la fornitura di materiali diagnostici e terapeutici. Il nostro lavoro passato che ha coinvolto il fago ha identificato un nuovo peptide, non naturale, lungo 12 aminoacidi che abbiamo chiamato peptide bersaglio cardiaco (CTP) a causa della sua capacità di trasdurre il tessuto cardiaco normale in vivo con picco di assorbimento visto in appena 15 min dopo un'iniezione endovenosa. Abbiamo intrapreso studi dettagliati sulla biodistribuzione iniettando CTP etichettato con cianina fluoroforo5.5, permettendogli di circolare per vari periodi di tempo, e di eutanasia, fissaggio e sezionamento di più organi seguiti dall'imaging microscopio fluorescente. In questa pubblicazione, descriviamo questi processi e l'imaging ex vivo degli organi raccolti utilizzando un sistema di imaging in vivo in dettaglio. Forniamo metodologie e pratiche dettagliate per intraprendere la trasduzione e studi di biodistribuzione utilizzando la CTP come esempio.

Introduzione

La membrana plasmatica cellulare è una barriera semipermeabile che è essenziale per l'integrità e la sopravvivenza delle cellule e serve a regolare l'interno della cellula controllando il movimento delle sostanze nella cellula. Anche se vitale per la sopravvivenza, presenta anche una barriera alla consegna del carico alla cellula. Nel 1988, il trans-attivatore della proteina di trascrizione (Tat) del virus dell'immunodeficienza umana è stato indicato per entrare nelle cellule coltivate e promuovere l'espressione genica virale^1,2, con i domini responsabili di questa trasduzione limitata ad una regione di arginina e lisina ricca 13-aminoacido della terza elica³ Questi sono stati quindi chiamati colture di peptingtide (PPC). Questo è stato seguito da una ricerca che ha dimostrato la capacità del peptide Tat di trasportare la parola funzionale -galactosidase in più tipi cellulari⁴. Dalla descrizione iniziale, il numero di peptidi penetranti nelle cellule è aumentato drasticamente. Questi domini di trasduzione sono peptidi corti naturali o sintetici, in genere lunghi 6-20 aminoacidi, che sono in grado di trasportare carichi funzionali attraverso le membrane cellulari. Questi carichi possono variare da altri piccoli peptidi, proteine a lunghezza intera, acidi nucleici, nanoparticelle, particelle virali, molecole fluorescenti e radioisotopi⁵. I CpP iniziali descritti non erano specifici per le cellule, con Tat assunto da più tipi di cellule e persino attraversando la barriera emato-encefalica⁴, limitando così il suo potenziale terapeutico. Al fine di identificare i CPC specifici delle cellule, gli investigatori hanno intrapreso il display dei faghi utilizzando grandi librerie di fagè disponibili in commercio⁶. Il nostro lavoro utilizzando una metodologia combinatoria in vitro e in vivo di visualizzazione dei fagi ha portato all'identificazione di un CPP denominato peptide di targeting cardiaco (CTP)⁷, un peptide 12-aminoacido, non naturale (NH₂-APWHLSSQYSRT-COOH) che si rivolge al cuore con picco di aumento a 15 min dopo un'iniezione peripal intravace⁸. Utilizzando la co-localizzazione immunofluorescente con actina, un marcatore intracellulare, ed esclusione della laminina, un marcatore di membrana cellulare, abbiamo mostrato che ctP viene interiorizzato in cardiomiociti del topo dopo un'iniezione per via endovenosa⁷. Inoltre, abbiamo incubato cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo che picchiano cardiomiociti con CTP a doppio marchio, etichettati con 6 carboxyfluorescein a c-terminus e rododerina al suo N-terminus attraverso un collegamento di ester che poteva essere tagliato solo da intracellulari. Il rapido accumulo di rhodamina nel battere cardiomiociti è stato osservato entro 15 min sulla microscopia confocale⁸.

In questo articolo, presentiamo due metodologie gratuite che possono essere utilizzate per monitorare la biodistribuzione e confermare l'internalizzazione specifica dei CPP utilizzando CTP come esempio. Per queste metodologie, ctP è stato sintetizzato, fluorescente etichettato al N-terminus con cianine5.5 (CY5.5), e amide-capped al capolinea C per una maggiore stabilità peptide. Le due metodologie utilizzate sono i sistemi di imaging ottico fluorescente in vivo e la microscopia fluorescente delle sezioni tissutali. Entrambi i metodi sono molto utili nello studio della biodistribuzione, dell'assorbimento e dell'eliminazione di CPC etichettati fluorescentmente. Il vantaggio di valutare la biodistribuzione utilizzando questi metodi rispetto ad altri, come la tomografia a emissione di singoli fotoni (SPECT) o la tomografia a emissione di positroni (PET), è che non è necessario un'intensa radioetichettatura dei PCC rispetto all'etichettatura fluorescente, che è relativamente facile e in uso di routine in tutti gli impianti di sintesi peptide. L'uso dell'imaging in vivo produce rapidamente dati di biodistribuzione nel contesto di un sistema vivente, mentre la sezionamento fornisce maggiori informazioni approfondite sull'assorbimento e la localizzazione dei peptidi all'interno delle cellule attraverso la conservazione dei dettagli morfologici. Questo protocollo può essere applicato a una vasta gamma di organi e tessuti come il cuore, polmone, fegato, rene, cervello, milza, stomaco, intestino crasso, intestino tenue, muscolo scheletrico, osso, testicoli / ovaie, e gli occhi.

   

Protocollo

Il Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Pittsburgh ha approvato tutti i protocolli animali specificati in questa pubblicazione prima di intraprendere uno qualsiasi di questi esperimenti sugli animali.

NOTA: Questo protocollo descrive in dettaglio come eseguire studi di biodistribuzione ex vivo utilizzando l'imaging fluorescente ottico ex vivo seguito da studi di biodistribuzione in vivo incorporando gli organi in paraffina, sezionamento ed esecuzione di microscopia fluorescente. Anche se CTP viene utilizzato come esempio, questo metodo può essere applicato a qualsiasi CPP fluorescente.

1. Imaging in vivo

1. Sintetizza ctP utilizzando tecniche di sintesi in fase solida^9,10 da un impianto di sintesi di peptidi utilizzando gli aminoacidi L con un N-terminus etichettato con Cy5.5 e C-terminus amide-capped per una maggiore stabilità.
   NOTA: tutti i CPP sintetizzati devono essere caratterizzati mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) e/o desorption/ionizzazione laser assistita a matrice (MALDI) prima di utilizzare¹¹.
2. Fare una soluzione di riserva di 1 mM o 10 mM di CTP in solfuro dimetile (DMSO), aliquota, e conservare a -80 gradi centigradi, protetto dalla luce.
   NOTA: I peptidi vengono consegnati come polvere liofilizzata. La polvere liofilizzata può essere immagazzinata a lungo termine (6 mesi-2 anni) in -20 gradi centigradi, protetta dalla luce e in condizioni igroscopiche. Quando l'aliquota è in DMSO e immagazzinata, i cicli di congelamento del gelo devono essere evitati.
3. Pesare e anestesizzare topi femminili CD1 di 6 settimane utilizzando 2 luna/g di peso tissutale di una soluzione di ketamina/xylazina (100 mg/kg di ketamina e 20 mg/kg di xilazina) somministrati per via intramuscolare (gamba posteriore) o intraperitinalmente (quadrante inferiore sinistro).
   NOTA: Le soluzioni di ketamina/xylazina devono essere rese fresche il giorno dell'uso. La chetamina/xilola disuso inutilizzata deve essere smaltita in modo appropriato e i volumi utilizzati rispetto ai volumi scartati registrati in un tronco, poiché la chetamina è una sostanza controllata. Un adeguato livello di anestesia sarà raggiunto in 5-7 min, come valutato dalla mancanza di risposta a un pizzico di dita dei tempi.
4. Calcolare una dose di 10 mg/kg di Cy5.5-CTP, diluire con la salina tamponata di fosfato (PBS) a non più di 200 l e iniettare in modo retrò orbitalmente o attraverso l'iniezione di vena della coda utilizzando una siringa di insulina (Figura 1A).
5. Lasciare che il peptide circoli per il tempo prespecificato, che va da 15 min-6 h.
6. Eutanasia del topo utilizzando il metodo inalazionale di CO₂ elevato come specificato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali e aprire la cavità toracica utilizzando le forbici (Figura 1B).
7. Utilizzare le forbici per posizionare un piccolo nick nella parete laterale libera dell'atrio destro e iniettare 3 mL di 10% di fosfato formalina tamponato utilizzando un ago da 26 G per il duplice scopo di fissare gli organi del topo e lavare i globuli rossi (Figura 1C).
8. Dissezionare cuore, polmone, fegato, reni, milza, intestini grandi, intestini piccoli, vescica, ovaie / test, e cervello e mettere in singoli pozzi di una piastra 12 pozzo per l'imaging ottico ex vivo (Figura 1D).
9. Avviare il software di acquisizione delle immagini e fare clic sul pulsante Inizializza per preparare il sistema per gli esempi di imaging. Aprire la procedura guidata di imaging, selezionare la possibile di fluttuazione, quindi filtrare la coppia, quindi selezionare il coloranti Cy5.5 dall'elenco di coloranti per applicare filtri di eccitazione 580 nm e filtri di emissione 620 nm. Selezionare le impostazioni manuali per i parametri di esposizione, quindi impostare la posizione della fase su B, impostare il tempo di esposizione su 1 secondo, impostare F/stop su 8 e impostare il raccoglimento su piccolo.
   NOTA: i filtri di emissione di eccitazione variano a seconda dell'etichetta utilizzata. L'eccitazione e l'emissione dell'etichetta utilizzata possono essere inserite manualmente per il software per assegnare filtri di eccitazione ed emissione. Assicurarsi che i conteggi siano compresi tra 600-60.000 per evitare la saturazione. A seconda del sistema in uso, potrebbe essere disponibile l'ottimizzazione automatica dell'acquisizione. Se il sistema ha una compensazione per confrontare le immagini acquisite con impostazioni diverse, è possibile utilizzare le impostazioni automatiche. Se non è disponibile alcuna compensazione, le impostazioni dovranno essere determinate, salvate e utilizzate in modo coerente tra i campioni.
10. Quando il sistema è completamente inizializzato, disporre gli organi di interesse in una piastra da 12 pozzetto e posizionarlo all'interno della camera di imaging ottico, assicurando che i campioni siano disposti come desiderato per le immagini. Selezionare Acquisisci, quindi selezionare un percorso di salvataggio per le immagini. Le informazioni sul mouse possono essere scritte nella finestra a comparsa Modifica etichette immagine.
11. Dopo l'imaging, rimuovere i campioni dalla camera e conservare in 10% fosfato formalina tamponato in un volume almeno 20 volte il volume del tessuto in fiale scintillanti con protezione della luce a temperatura ambiente (RT).
12. Quantifica le immagini impostando le unità su Radiant Efficiency, quindi selezionando il ROI 4x3 e regolandole per adattarle in modo uniforme in un quadrato del ROI, seguito dal clic sulla misura. Aprire la scheda delle misure del ROI della griglia, selezionare Esporta e salvare le misure come file .cvs.

2. Istologia

NOTA: Seguire i passaggi 1.1.1.8 per ottenere organi diversi. In alternativa, gli stessi organi che sono stati immagine possono essere collocati immediatamente in formalina e utilizzati per sezionare come descritto di seguito.

1. Conservare ogni organo singolarmente nel 10% di formalina tampolatata per un minimo di 48 h prima della lavorazione per l'istologia.
2. Quando gli organi sono sufficientemente fissati dopo 48 h, trasferire gli organi nella lavorazione dei tessuti e incorporare le cassette e metterli in una macchina per la lavorazione dei tessuti (Figura 1E).
3. Impostare la macchina di lavorazione per disidratare il tessuto nel 70% di etanolo per 30 min, seguito da 80% di etanolo per 30 min, 95% etanolo per 30 min, 95% etanolo per 30 min, 100% etanolo per 15 min, 100% etanolo per 20 min, e infine 100% etanolo per 20 min.
4. Cancellare il tessuto in xilene 2x, con 30 min per ogni trattamento di xilene.
5. Infiltrare il tessuto eliminato con cera di paraffina 4x a 60 gradi centigradi per 30 min con ogni trattamento.
6. Incorporare in paraffina utilizzando stampi metallici. Riempire lo stampo con paraffina fusa (mantenuta a 65 gradi centigradi) e trasferirlo su una piastra fredda. Quando la paraffina nella parte inferiore dello stampo inizia a solidificare, posizionare l'organo nella paraffina (Figura 1F).
7. Posizionare una cassetta etichettata sopra lo stampo come un sostegno e riempire eccessivamente con paraffina fusa. Lasciar raffreddare fino a quando non è solido. Quindi conservare il blocco in un congelatore da -20 gradi centigradi durante la notte, consentendo alla cera di ridursi ulteriormente per una facile rimozione dagli stampi.
   NOTA: i blocchi possono ora essere memorizzati in RT con protezione dalla luce.
8. Preparare un bagno d'acqua a 38 gradi con acqua distillata. Impostare il microtoma con un angolo di lama di 6 gradi e uno spessore di sezione di 10 m.
9. Montare i blocchi di tessuto nel microtoma e iniziare il taglio fino a ottenere sezioni contenenti tessuto. Quindi posizionare i blocchi a faccia in giù nell'acqua per 5 min o fino a quando il tessuto ha assorbito un po 'di umidità (ad esempio, quando un sottile contorno bianco del tessuto appare nel blocco [Figura 1G]).
   NOTA: La lama deve essere sostituita frequentemente per garantire la qualità delle sezioni.
10. Posizionare il tessuto su un blocco di ghiaccio piatto per 10 min, quindi riportarlo al microtoma nello stesso orientamento del punto 2.9. Iniziare a prendere le sezioni e lasciare che le sezioni troncate formino lunghi nastri di 6,10 sezioni ciascuna. Eliminare i nastri di paraffina non ottimali fino a quando non viene prodotto un nastro di alta qualità di lunghezza sufficiente a coprire una diapositiva. Ottimizzare il sezionamento regolando la velocità di taglio, l'idratazione dei tessuti e la temperatura del bagno d'acqua per evitare la tosatura o la rugosità delle sezioni tissutali.
    NOTA: Le sezioni con fori in cui il tessuto è caduto, strappi nel tessuto o rughe strette e pieghe nel tessuto devono essere scartate.
11. Scegli con cura il nastro di qualità di scelta con pinze di rispido smussate e galleggia sulla superficie del bagno d'acqua a 38 gradi centigradi. Lasciare che le sezioni si siedano sulla superficie fino a quando non si levigano, facendo attenzione a non lasciarle troppo a lungo per evitare che la paraffina si disintegri e strappi la sezione.
12. Far galleggiare le sezioni appiattite sulla superficie dei vetrini di vetro puliti. Mettete i vetrini in un forno a 65 gradi centigradi per 30 min per sciogliere la cera.
    NOTA: Questi vetrini possono essere memorizzati in RT con protezione dalla luce.
13. Deparaffinizzare i vetrini in xilene 3x, 10 min per ogni trattamento.
14. Reidratare il tessuto in etanolo al 100% per 5 min, seguito dal 95% di etanolo per 5 min, 70% etanolo per 5 min, 50% etanolo per 5 min, e infine 1x tris-buffered salin (TBS) per 5 min (Figura 1H). Lasciare asciugare i vetrini durante la notte.
    NOTA: Queste diapositive possono essere conservate a lungo termine a RT, purché siano protette dalla luce.
15. Montare i vetrini con copricopertine utilizzando 125 l di supporti di montaggio contenenti 4,6-diamidino_2-fenylindole (DAPI), una sonda fluorescente nucleare (Figura 1I). Asciugare i vetrini durante la notte al RT, protetti dalla luce.
    NOTA: I vetrini secchi possono essere conservati a lungo termine a 4 gradi centigradi, protetti dalla luce.
16. Diapositive di immagini con microscopia fluorescente.
    NOTA: le immagini sature devono essere evitate, in quanto non sono quantitativamente utili. Regolazione delle impostazioni di esposizione e guadagno può essere abbassata per evitare la saturazione. Prestare attenzione a utilizzare le stesse impostazioni tra i campioni confrontati. Evitare lo sbiancamento del tessuto limitando i tempi di esposizione.

Risultati

Utilizzando questo protocollo, abbiamo trattato tre topi con una dose di 10 mg/kg di Cy5.5-CTP attraverso un'iniezione retro-orbitale (Figura 1A). Dopo aver permesso al peptide di circolare per 15 min, i topi sono stati eutanasiati utilizzando una camera CO_2, il torace si è aperto attraverso un'incisione sternotomia mediana, l'atrio destro è stato intaccato e i topi perfusione fissata utilizzando 3 mL di formalina 10% bufferdiato di fosfato (Figura 1B,C). Dopo la fissazione, il cuore, i polmoni, il fegato, il rene, la milza e il cervello sono stati sezionati e disposti in una piastra di 12 pozze per l'imaging fluorescente ottico ex vivo (Figura 1D e Figura 2A). Tre topi di controllo senza iniezioni sono stati anche perffusi, sezionati e immagini(Figura 1B-D e Figura 2B). I dati di fluorescenza acquisiti per ogni serie di organi possono essere confrontati a causa della conversione dei conteggi in efficienza radiante, l'unità di fluorescenza relativa del software di imaging. Questi dati possono essere quantificati per produrre sia immagini qualitative che dati quantitativi per ogni organo in questione (Figura 2C) in diversi punti temporali per gli studi di biodistribuzione. L'autofluorescenza di diversi organi in risposta a diverse lunghezze d'onda di eccitazione è dimostrata nella Figura 3A-E. Lunghezze d'onda di eccitazione più brevi, come proteine fluorescenti verdi potenziate (EGFP), sono associate a una maggiore autofluorescenza, specialmente nel fegato e nel cervello, rispetto alle lunghezze d'onda di eccitazione infrarosse (Cy5.5) di colore lontano (Cy5.5) o vicino all'infrarosso (Cy7) (Figura 3). Gli organi di immagine sono stati fissati in formalina tampone al 10% di fosfato a RT per un minimo di 48 h, seguita da un trasferimento alle cassette di lavorazione e incorporamento dei tessuti (Figura 1E). Gli organi sono stati lavorati e paraffinati in una macchina per la lavorazione dei tessuti, posizionati in stampi riempiti di paraffina, congelati su uno stadio di -20 gradi centigradi e conservati durante la notte a -20 gradi centigradi (Figura 1F). I campioni sono stati sezionati (Figura 1G) e trattati con scambi di soluzioni per reidratare il tessuto (Figura 1H). I vetrini preparati sono stati poi montati con supporto di montaggio fluorescente DAPI (Figura 1I). Una volta asciutti, di solito durante la notte, i vetrini sono stati immagine utilizzando microscopia fluorescente. Le immagini rappresentative di ogni organo di un topo sono mostrate nella Figura 4A. Le immagini provenienti da organi diversi sono state acquisite utilizzando impostazioni identiche per consentire il confronto tra i topi e per consentire la quantificazione (Figura 4B).

Figura 1: Raccolta di organi di topo per l'imaging e il sezionamento ottico ex vivo. (A) Mouse di tipo selvaggio iniettato in orbita retro-orbita con CTP-Cy5.5. (B) Topo sezionato con il torace aperto, atrio destro snipped, per fissazione perfusione. (C) Cuore iniettato con 3 mL di 10% tampone di fosfato formalina per la fissazione perfusione dell'animale. (D) Organi di interesse raccolti e disposti in una piastra da 12 pozze per l'imaging ottico fluorescente. (E) Cuore caricato in una cassetta ed elaborato con un robot per tessuti. (F)Cuore incorporato nella paraffina. (G) Cuore sezionato su un microtoma. (H) Diapositive deparaffinate attraverso una serie di scambi di soluzioni. (I) Sezioni montate con copricopertine utilizzando DAPI. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Immagini rappresentative provenienti da organi trattati e di controllo. (A) Organi di un topo trattato con 10 mg/kg CTP-Cy5.5. (B) Organi da un topo di controllo non trattato. (C) Quantificazione della fluorescenza per ogni serie di organi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Organi di topo non trattati immagine a diverse lunghezze d'onda di emissione di eccitazione per dimostrare come le lunghezze d'onda più lunghe producano meno autofluorescenza. (A) Ci7: 740-790. (B) Ci5,5: 660-710. (C) Ci5: 620-670. (D) Ci3: 520-570. (E) EGFP: 480-520. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Trasduzione di cuore, polmone, fegato e rene dopo l'iniezione endovenosa nei topi. I topi selvatici sono stati iniettati con 10 mg/kg di Cy5.5-CTP, o un peptide casuale (RAN-Cy5.5), e eutanasia ai punti temporali indicati. (A) La trasduzione di picco del tessuto cardiaco è stata osservata a 15 min con una costante diminuzione della fluorescenza nel tempo. Alcuni assorbimento capillare è stato notato nei polmoni con trasduzione robusta nel fegato e nei capillari glomerari renali, quest'ultimo implica un meccanismo renale di escrezione. (B) La quantificazione dell'intensità fluorescente mostra un aumento significativo dell'assorbimento cardiaco della CTP-Cy5,5 su RAN-Cy5.5. Barra della scala: 500 m. Questa cifra è stata modificata da .ahid et^al. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

I modelli animali sono essenziali per lo sviluppo preclinico di farmaci in ogni fase del processo, dall'identificazione di nuovi CPC, studi di biodistribuzione, meccanismo di trasduzione, alla verifica in ultima analisi dell'efficacia del carico consegnato utilizzando questi nuovi CPC come vettori. Ci sono molti metodi comunemente utilizzati disponibili per valutare la biodistribuzione come l'istologia, l'imaging della medicina nucleare (SPECT e PET) e l'imaging ottico in vivo¹². I metodi di imaging nucleare possono essere ingombranti a causa della limitata disponibilità di piccoli sistemi animali SPECT e PET, nonché della capacità di produrre coniugati radioetichetta-farmaco, che richiedono l'esperienza di un radiochimico. Al contrario, le etichette fluorescenti sono molto più semplici e possono essere convenienti con cui lavorare. Il protocollo descritto in questo documento consente un'analisi rapida della biodistribuzione utilizzando più metodi. L'imaging ottico fluorescente dell'intero organo in vivo consente l'immediato confronto della fluorescenza tra diversi tessuti e gruppi di trattamento e può identificare l'assorbimento degli organi e il tempo necessario per raggiungere il picco di assorbimento degli organi di interesse in modo semiquantitativo. L'istologia quantitativa dei tessuti richiede un'elaborazione più estesa per trattare, sezione, immagine e analizzare i tessuti, ma fornisce più dati a livello microscopico ed è una tecnica standard corrente. Vale la pena notare che il confronto diretto e quantitativo tra le due tecniche non è possibile, perché l'autofluorescenza osservata con ogni tecnica per organi diversi e lunghezze d'onda di eccitazione varia in modo significativo.

Una parte importante di questo protocollo è la scelta del fluoroforo giusto per etichettare i CCP candidati per gli esperimenti. Un problema potenziale è la sovrapposizione degli spettri, che può essere problematica quando sono necessari più fluorofori. Il supporto di montaggio fluorescente DAPI e Cy5.5 non hanno spettri sovrapposti. Tuttavia, per alcune applicazioni in cui sono necessari più fluorofori, il rischio di sovrapposizione spettrale deve essere attentamente considerato. A seconda del sistema utilizzato, la selezione del fluoroforo può essere limitata. Pertanto, la conoscenza delle capacità del sistema è fondamentale. I sistemi ottici fluorescenti sono meglio utilizzati con fluorofori di gran lunga rosso o vicino infrarosso a causa dell'elevato assorbimento dei tessuti di lunghezze d'onda più corte¹³. I fluorofori nella gamma di proteine fluorescenti verdi potenziate hanno una grande limitazione, perché c'è una significativa autofluorescenza dell'organo osservata alla sua lunghezza d'onda di eccitazione, in particolare nel tessuto cerebrale e epatico. A seconda delle condizioni di un esperimento, alcuni fluorofori sono meglio evitare. Alcuni fluorofori organici solubili in acqua hanno una forte interazione con i bistrati lipidici, che possono causare falsi positivi. Quindi, prendere misure per determinare se un fluoroforo ha una forte affinità con il tessuto di interesse è consigliabile¹⁴. Un altro fattore da considerare è la selezione del metodo appropriato di coniugazione fluoroforo, che può essere un parametro importante che influenzano i risultati. I PPP possono essere etichettati fluorescente al capoN o C attraverso un legame covalente tra il N-terminus del peptide e il gruppo carboxyl del colorante come Cy5.5-NHS. Occorre prestare attenzione, perché il meccanismo di trasduzione della maggior parte dei CPC non è compreso nei dettagli e la coniugazione a un'estremità può influenzare il meccanismo di assorbimento più che all'altra estremità. Un'altra possibilità per etichettare i CPC è attraverso la biotinyillazione dell'N-terminus per la coniugazione alla streptavidina etichettata a fluorescenza. L'utilizzo di questa strategia ha la comodità di consentire l'utilizzo di diversi coniugati fluorescenti streptavidin. Tuttavia, una possibile limitazione di questa strategia è che un complesso di biotina-streptavidin è un grande costrutto, che potrebbe potenzialmente interferire con la trasduzione.

I sistemi di imaging ottico fluorescente sono una strategia efficace per generare un confronto della fluorescenza tra diversi organi e trattamenti in modo efficiente, ma non sono in grado di produrre una misura quantitativa delle concentrazioni assolute nel tessuto. Ciò è dovuto agli effetti di dispersione della luce all'interno del tessuto, che è ulteriormente aggravato dalla varietà naturale nelle dimensioni e densità dei tessuti, e dalle differenze nella vascolarizzazione, con dispersione variabile di fluorescenza. L'autofluorescenza dei tessuti può essere anche un fattore, a causa di fonti biochimiche naturali come il collagene, o fonti dietetiche come la clorofilla negli alimenti¹³.

L'istologia è il metodo più comunemente usato per misurare la biodistribuzione e può essere potenzialmente utilizzato per misurare e confrontare con precisione l'assorbimento tra diversi tessuti nel tempo. I problemi di dispersione della luce sono evitati con questo metodo perché tutti i tessuti sono sezionato allo stesso spessore¹⁵. Uno dei principali vantaggi di questo metodo è la capacità di includere etichette fluorescenti aggiuntive post-sezione per l'immunohistochimica. Anche se l'aggiunta di un altro fluoroforo potrebbe rendere l'imaging più impegnativo, l'uso di etichette fluorescenti può essere utile per la localizzazione di un CPP in particolari compartimenti intracellulari, come lisosomi o mitocondri. Un anticorpo potrebbe essere utilizzato in un esperimento di microscopia confocale per determinare se un CPP candidato transdotto colocalizza con una struttura di interesse, che può mostrare il potenziale di un CPP come agente di consegna. Una limitazione di questo metodo è che la preparazione di diapositive da campioni di organo può richiedere molto tempo, laboriosa e soggetta^all'erroreumano 12^,15. Quando si immaginano i vetrini, è necessario prestare attenzione a non visualizzare la stessa posizione per troppo tempo per evitare il fotosbleaching. Alcuni fotosbiancamento saranno inevitabili, a seconda della sensibilità del fluoroforo. Prestare attenzione ad ogni passo di questo protocollo per proteggere i campioni dalla luce ambiente e memorizzarli correttamente¹⁶. Per le immagini future, si consiglia di conservare le diapositive a 4 gradi centigradi, protette dalla luce.

Esistono diversi metodi disponibili per misurare la biodistribuzione di un CPP candidato che richiedono attrezzature specializzate e possono produrre risultati comparabili, anche se possono richiedere un'etichettatura CPP più complessa. Il protocollo descritto in questo documento utilizza due metodi compatibili per produrre in modo efficiente i dati di biodistribuzione nel contesto di un sistema vivente, consentendo al contempo l'acquisizione di maggiori informazioni approfondite sull'internalizzazione dei peptidi all'interno delle cellule dello stesso campione, dimezzando così il numero di animali necessari per uno studio. Questi metodi sono stati utilizzati per generare i dati di cui sopra, che dimostrano che entrambi i metodi possono essere utilizzati in sequenza nello stesso animale, e la qualità dei dati generati da ciascuno. I nostri risultati evidenziano anche l'incapacità di correlare direttamente i risultati tra le due tecniche in modo quantitativo.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Buffered Formalin Phosphate	ThermoFisher	SF100-4
10x Tris Buffered Saline (TBS)	ThermoFisher	BP2471-1
12-well Cell Culture Plate	ThermoFisher	353043
1x TBS Solution			10x TBS is diluted 1:10 with deionized water. This solution can be stored at room temperature.
20 mL Scintillation Vials	Wheaton	334173
26G Needles	Becton Dickinson	305110
28G 0.5ml Insulin syringes	Becton Dickinson	329461
3mL Syringe	Becton Dickinson	309657
CD1 Mice	Charles River	022	6 to 12 week old albino, female mice
Cover Glass	ThermoFisher	12-544-14
Cy5.5-CTP-amide			Prepared by peptide synthesis, conjugated with Cy5.5 fluorophore, and purified using HPLC. Lyophilized powder is reconstituted in DMSO at 10mM concentration. After reconstituting, store at -80 °C.
Dapi Fluoromount G	SouthernBiotech	0100-20
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	99150-20
Ethanol
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08
Ketamine HCl 100mg/mL	KetaVed	NDC 50989-161-06
Ketamine/Xylazine Solution			Ketamine HCl is mixed with Xylazine 1:1 to produce a stock solution containing 50mg/mL ketamine and 10mg/mL Xylazine. This solution is made fresh before each use.
Leica RM2235 Rotary Microtome	Leica	RM2235
Microscope Slides	ThermoFisher	B9992000TN
Paraplast X-TRA	Sigma	P3808-1KG
Perkin Elmer Lumina S5 IVIS	Perkin Elmer	CLS148588
Sparkle Optical Lens Cleaner	ThermoFisher	NC0090079
Tissue-Tek Processing/Embedding Cassettes	ThermoFisher	NC9499605
Tissue-Tek VIP Processing machine	Tissue-Tek	VIP 5A-F1
Xylazine 20 mg/mL	AnaSed	NDC 59399-110-20
Xylenes	ThermoFisher	X5-4