Extração e Visualização de Agregados proteicos após tratamento de Escherichia coli com um Estressor Proteotóxico

Resumo

Este protocolo descreve a extração e visualização de proteínas agregadas e solúveis de Escherichia coli após o tratamento com um antimicrobiano proteotóxico. Após este procedimento permite uma comparação qualitativa da formação de agregado de proteínas in vivo em diferentes cepas bacterianas e/ou entre os tratamentos.

Resumo

A exposição de organismos vivos a estresses ambientais e celulares muitas vezes causa interrupções na homeostase proteica e pode resultar em agregação de proteínas. O acúmulo de agregados proteicos em células bacterianas pode levar a alterações significativas no comportamento fenotípico celular, incluindo uma redução nas taxas de crescimento, resistência ao estresse e virulência. Existem vários procedimentos experimentais para o exame desses fenótipos mediados pelo estressor. Este artigo descreve um ensaio otimizado para a extração e visualização de proteínas agregadas e solúveis de diferentes cepas de Escherichia coli após o tratamento com um antimicrobiano contendo prata-rutênio. Este composto é conhecido por gerar espécies reativas de oxigênio e causa agregação generalizada de proteínas.

O método combina uma separação baseada em centrifugação de agregados proteicos e proteínas solúveis de células tratadas e não tratadas com posterior separação e visualização por eletroforese de gel de sulfato-poliacrilamida de sódio (SDS-PAGE) e coloração coomassie. Esta abordagem é simples, rápida e permite uma comparação qualitativa da formação de proteína agregada em diferentes cepas de E. coli. A metodologia possui uma ampla gama de aplicações, incluindo a possibilidade de investigar o impacto de outros antimicrobianos proteotóicos na agregação de proteínas in vivo em uma ampla gama de bactérias. Além disso, o protocolo pode ser usado para identificar genes que contribuem para o aumento da resistência às substâncias proteotoxias. Bandas de gel podem ser usadas para a identificação subsequente de proteínas particularmente propensas à agregação.

Introdução

As bactérias são inevitavelmente expostas a uma miríade de estresses ambientais, incluindo pH baixo (por exemplo, no estômago dos mamíferos)^1,2, oxigênio reativo e espécies de cloro (ROS/RCS) (por exemplo, durante a explosão oxidativa em fagocitos)^3,4,5, temperaturas elevadas (por exemplo, em fontes termais ou durante o choque térmico)^6,7, e vários antimicrobianos potentes (por exemplo, AGXX usados neste protocolo)⁸. As proteínas são particularmente vulneráveis a qualquer um desses estressores, e a exposição pode provocar a não-/misfolding de proteínas que, em seguida, a agregação de sementes. Todos os organismos empregam sistemas de proteção que lhes permitem lidar com o erro de proteína⁹. No entanto, o estresse severo pode sobrecarregar o maquinário de controle de qualidade proteica e interromper a estrutura secundária e/ou terciária das proteínas, o que acaba inativando proteínas. Como consequência, os agregados proteicos podem prejudicar severamente as funções celulares críticas necessárias para o crescimento e sobrevivência bacteriana, resistência ao estresse e virulência¹⁰. Portanto, pesquisas com foco na agregação de proteínas e suas consequências nas bactérias são um tema relevante devido ao seu potencial impacto no controle de doenças infecciosas.

O desdobramento e a agregação de proteínas induzidas pelo calor são muitas vezes reversíveis⁷. Em contraste, outras tensões proteotoxiais, como o estresse oxidativo, podem causar modificações proteicas irreversíveis através da oxidação de cadeias laterais específicas de aminoácidos resultando em proteínas não-/misfolding e, eventualmente, agregação de^{proteínas 4}. A formação induzida pelo estresse de agregados proteicos insolúveis tem sido extensivamente estudada no contexto de acompanhantes moleculares e suas funções protetoras na levedura e bactérias^11,12,13. Vários protocolos foram publicados que utilizam uma variedade de técnicas bioquímicas para o isolamento e análise dos agregados de proteínas insolúveis^14,15,16,17. Os protocolos existentes têm sido usados principalmente para estudar a agregação de proteínas bacterianas mediante choque térmico e/ou identificação de acompanhantes moleculares. Embora esses protocolos tenham sido certamente um avanço para o campo, há alguns grandes inconvenientes nos procedimentos experimentais porque exigem (i) um grande volume de cultura bacteriana de até 10 L^14,17, (ii) complicados processos de interrupção física, incluindo o uso de disruptores celulares, imprensa francesa e/ou sonicação^14,15,17, ou (iii) demorado repetidos lalavís e incubação etapas^15,16,17.

Este artigo descreve um protocolo modificado que visa abordar as limitações das abordagens anteriores e permite a análise da quantidade de agregados proteicos formados em duas cepas diferentes de Escherichia coli após o tratamento com um revestimento de superfície antimicrobiana proteotoxic. O revestimento é composto de metal-prata (Ag) e rutênio (Ru)-condicionado com ácido ascórbico, e sua atividade antimicrobiana é alcançada pela geração de espécies reativas de oxigênio^8,18. Aqui está uma descrição detalhada da preparação da cultura bacteriana após o tratamento com o composto antimicrobiano e uma comparação do estado de agregação de proteínas após a exposição de duas cepas de E. coli com perfis distintos de suscetibilidade ao aumento da concentração do antimicrobiano. O método descrito é barato, rápido e reprodutível e pode ser usado para estudar a agregação de proteínas na presença de outros compostos proteotóxicos. Além disso, o protocolo pode ser modificado para analisar o impacto que exclusões genéticas específicas têm na agregação de proteínas em uma variedade de bactérias diferentes.

Protocolo

1. Tratamento de estresse de E. coli cepas MG1655 e CFT073

1. Inocula 5 mL de caldo de lisogenia (LB) médio com uma única colônia de cepa E. coli commensal MG1655 e uropatogenic E. coli (UPEC) cepa CFT073, respectivamente, e incubar por 14-16 h (durante a noite) a 37 °C e 300 rpm.
   NOTA: Escherichia coli CFT073 é um patógeno humano. O manuseio do CFT073 deve ser realizado com medidas de biossegurança adequadas em um laboratório certificado de Biossegurança Nível-2.
2. Diluir cada cepa em um frasco de 500 mL contendo70 mL de ácido propanossulfônico (MOPS)-glicose (MOPS-g)(Tabela 1)médio a uma densidade óptica de 600 nm (OD₆₀₀) valor de 0,1. Incubar a 37 °C e 300 rpm até a fase de registro médio (OD₆₀₀ = 0,5-0,55).
3. Transfira 20 mL de cada cultura em três frascos pré-armados de 125 mL e incubar a 37 °C e 300 rpm por 2 min.
   NOTA: Como o processamento oportuno das amostras é necessário, manuseie não mais do que 6 culturas por vez.
4. Prepare uma solução composta antimicrobiana em meio MOPS-g a uma concentração de 2 mg/mL. Adicione o antimicrobiano a cada cultura para alcançar as concentrações indicadas. Para o controle não tratado, adicione o volume necessário de meio MOPS-g.
   NOTA: Vortex a solução antimicrobiana de 2 mg/mL para permitir uma distribuição uniforme das partículas compostas e evitar a sedimentação.
5. Incubar as culturas por 45 min a 37 °C e 300 rpm.

Figura 1: Tratamento de estresse Escherichia coli. As culturas bacterianas são cultivadas em MOPS-g e tratadas com as concentrações indicadas do antimicrobiano contendo rutênio prateado quando a fase de registro médio é atingida. Abreviaturas: LB = caldo de lysogeny; Ag-Ru = prata-rutênio; MOPS-g = 3-(N-morpholino)ácido propanesulfônico (MOPS)-glicose. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Coleta de amostras de células bacterianas

1. Após 45 minutos de tratamento de estresse, determine o OD₆₀₀ de cada cultura. Para cada amostra, as células de colheita equivalem a 4 mL de OD₆₀₀ = 1 em tubos de centrífugas de 15 mL por centrifugação por centrifugação por 15 min a 3.000 × g e 4 °C.
2. Remova completamente o supernasciente e resuspense as pelotas de célula em 50 μL de tampão de lise gelada(Tabela 1). Incubar as amostras por 30 minutos no gelo.
   NOTA: Este passo de lise degrada a camada peptidoglycan. Use sempre o tampão de lise recém-preparado.
3. Transfira as amostras para tubos de microcentrifuuge de 1,7 mL. Congele a -80 °C até que seja mais útil.

Figura 2: Coleta de amostras bacterianas. As amostras de células são colhidas por centrifugação e resuspensadas no tampão de lise seguido de armazenamento a -80 °C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Extrair os agregados proteicos insolúveis

1. Descongelar amostras no gelo.
   NOTA: O ciclo de congelamento contribui para a lise celular.
2. Adicione 360 μL de tampão gelado A(Tabela 1) e misture delicadamente por pipetação.
   NOTA: O choque osmótico também contribuirá para a lise celular.
3. Transfira a amostra para um tubo de microcentrifuuge de 2 mL contendo ~200 μL de contas de vidro de 0,5 mm. Incubar por 30 min a 8 °C em um termomixer com agitação a 1.400 rpm.
   NOTA: Esta etapa resulta na ruptura física da célula. Um inibidor de protease pode ser usado para minimizar a degradação da proteína. A interrupção pode ser realizada a 4 °C. Note-se que o uso de contas de vidro foi relatado para induzir a agregação de um pequeno subconjunto de proteínas na levedura¹⁹.
4. Incubar por 5 minutos no gelo sem tremer para assar as contas de vidro. Transfira 200 μL do lysato celular em tubos de microcentrifuuge de 1,7 mL.
   NOTA: Evite a transferência das contas de vidro.
5. Centrifugar a 16.000 × g e 4 °C por 20 min. Recolher o supernante, que contém proteínas solúveis, e seguir para a seção 4.
6. Resuspenda a pelota em 200 μL de tampão gelado A (Tabela 1) usando a pipeta. Centrifugar a 16.000 × g e 4 °C por 20 min. Remova cuidadosamente o sobrenante completamente.
7. Adicione 200 μL de tampão gelado B (ver Tabela 1 e a Tabela de Materiais) e resuspense cuidadosamente a pelota por pipetação.
   NOTA: O detergente não iônico solubiliza a proteína da membrana.
8. Repita a centrifugação a 16.000 × g e 4 °C por 20 min. Remova cuidadosamente o supernatante.
9. Resuspenda a pelota em 200 μL de tampão frio A (Tabela 1) por pipetação. Centrifugar a 16.000 × g e 4 °C por 20 min. Remova completamente o supernatante.
10. Resuspenda a pelota em 100 μL de 1x reduzindo o tampão de amostra SDS(Tabela 1) e ferva por 5 min a 95 °C em um termomixer.
11. Armazene a amostra a -20 °C para prosseguir mais tarde ou carregar imediatamente em um gel de poliacrilamida SDS para separação.

Figura 3: Extração de agregados proteicos insolúveis. A extração de agregados proteicos envolve uma série de etapas, incluindo a ruptura celular, a separação de agregados proteicos de proteínas solúveis, a solubilização de proteínas de membrana e a lavagem. Abreviação: SDS = sulfato de dodecyl de sódio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Preparação da amostra de proteína solúvel

1. Misture 1 volume de ácido 100% tricloroacético (TCA) com 4 volumes de amostra de proteína solúvel a partir do passo 3.6.
   NOTA: O manuseio do TCA requer um capô de fumaça e equipamentos de proteção individual e um procedimento aprovado de descarte de resíduos.
2. Incubar por 10 min a 4 °C para permitir a precipitação da proteína.
   NOTA: O precipitado branco aparecerá muito em breve.
3. Centrífuga para precipitar a 21.000 × g e 4 °C por 5 min e remover o sobrenante. Lave a pelota com 200 μL de acetona gelada para remover detritos celulares. Centrifugar a 21.000 × g e 4 °C por 5 min e remover o supernatante. Repita essas ações na etapa 4.3 um total de três vezes.
4. Coloque os tubos de microcentrifuuge com tampas abertas em um termomixer a 37 °C para remover a acetona restante da pelota.
   NOTA: A incubação de mais de 5 min pode reduzir a solubilidade da pelota de proteína.
5. Adicione 100 μL de 1x reduzindo o buffer SDS(Tabela 1) e dissolva completamente a pelota. Ferva a amostra por 5 min a 95 °C.
6. Armazene a amostra a -20 °C para prosseguir mais tarde ou carregar imediatamente em um gel de poliacrilamida SDS para separação.

Figura 4: Preparação de proteínas solúveis. A preparação da proteína solúvel envolve um passo de precipitação com ácido tricloroacético e lavagem repetida com acetona gelada. Abreviaturas: TCA = ácido tricloroacético; SDS = sulfato de dodecyl de sódio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Separação e visualização de agregados de proteínas extraídas utilizando SDS-PAGE

1. Prepare um gel de poliacrilamida SDS de 12%.
   1. Para dois géis separados, pipeta 5,1 mL de água dupla destilada (ddH₂O), 3,75 mL de Tris-HCl (pH 8,8), 7,5 mL de 20% (w/v) SDS, 6 mL de solução de acrilamida/bisacrilamida (29:1), 75 mL de persulgo de amônio de 10% w/v e 10 mL de tetrametetilenodiamina (TEMED) em um tubo de centrífugo de 15 mL e misture suavemente sem introduzir bolhas de ar. Despeje o gel usando uma tubulação de 1 mL dentro das placas de vidro, deixando a parte superior 2 cm livre da mistura. Adicione 70% de etanol na parte superior do gel de separação e permita uma interface uniforme entre as duas camadas.
   2. Após a polimerização do gel de separação, prepare o gel de empilhamento por pipetação de 1,535 mL de ddH₂O, 625 mL de Tris-HCl (pH 6.8), 12,5 mL de 20% (w/v) SDS, 335 mL de solução de acrilamida/bisacrilamida (29:1), 12,5 mL de persulgênio de 10% w/v de amônio e 2,5 mL de TEMED. Retire o etanol dos géis de separação e adicione a solução de gel de empilhamento. Insira um pente com o número desejado de bolsos sem introduzir bolhas de ar. Deixe a polimerização por 20-30 min.
2. Carregue 4 μL de cada amostra e escada proteica em poços separados e execute o gel(s) em tampão de corrida Tris-Glycine(Tabela 1) a 144 V por 45 min a temperatura ambiente.
   NOTA: Pare o gel quando a banda bromofenol estiver prestes a migrar para fora do gel.
3. Manche o gel(s) em uma solução de Fairbanks pré-enfracaada A (Tabela 1) por 30 min em um roqueiro.
4. Decolor o gel(s) em uma solução de Fairbanks pré-enloucou D(Tabela 1) até o fundo desejado (por exemplo, durante a noite) em um roqueiro.

Figura 5: Separação e visualização de proteínas. As amostras são separadas por SDS-PAGE e visualizadas pela coloração coomassie. Abreviação: SDS-PAGE = sulfato de sulfato de sódio-poliacrilamida gel eletroforese. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

Figura 6: Resultados representativos da agregação de proteínas induzidas por antimicrobianos na cepa Escherichia coli commensal MG1655 e cepa UPEC CFT073. As cepas E. coli MG1655 e CFT073 foram cultivadas a 37 °C e 300 rpm a OD₆₀₀= 0,5-0,55 na mídia MOPS-g antes de serem tratadas com as concentrações indicadas (-, 0 mg/mL; ...

Discussão

Este protocolo descreve uma metodologia otimizada para a análise da formação de agregado de proteínas após o tratamento de diferentes cepas de E. coli com um antimicrobiano proteotóxico. O protocolo permite a extração simultânea de frações proteicas insolúveis e solúveis de células E. coli tratadas e não tratadas. Em comparação com os protocolos existentes para o isolamento agregado de proteínas das células^14,15,

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals/Reagents
Acetone	Fisher Scientific	67-64-1
30% Acrylamide/Bisacrylamide solution 29:1	Bio-Rad	1610156
Ammonium persulfate	Millipore Sigma	A3678-100G
Benzonase nuclease	Sigma	E1014-5KU
Bluestain 2 Protein ladder, 5-245 kDa	GoldBio	P008-500
β-mercaptoethanol	Millipore Sigma	M6250-100ML
Bromophenol blue	GoldBio	B-092-25
Coomassie Brilliant Blue R-250	MP Biomedicals LLC	821616
D-Glucose	Millipore Sigma	G8270-1KG
D-Sucrose	Acros Organics	57-50-1
Ethylenediamine tetra acetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	SLBT9686
Glacial Acetic acid	Millipore Sigma	ARK2183-1L
Glycerol, 99%	Sigma-Aldrich	G5516-1L
Glycine	GoldBio	G-630-1
Hydrochloric acid, ACS reagent	Sigma-Aldrich	320331-2.5L
Isopropanol (2-Propanol)	Sigma	402893-2.5L
LB broth (Miller)	Millipore Sigma	L3522-1KG
LB broth with agar (Miller)	Millipore Sigma	L2897-1KG
Lysozyme	GoldBio	L-040-25
10x MOPS Buffer	Teknova	M2101
Nonidet P-40	Thomas Scientific	9036-19-5
Potassium phosphate, dibasic	Sigma-Aldrich	P3786-1KG
Potassium phosphate, monobasic	Acros Organics	7778-77-0
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771-500G
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Millipore Sigma	T9281-50ML
Thiamine	Sigma-Aldrich	T4625-100G
100% Trichloroacetic acid	Millipore Sigma	T6399-100G
Tris base	GoldBio	T-400-1
Material/Equipment
Centrifuge tubes (15 mL)	Alkali Scientific	JABG-1019
Erlenmeyer flask (125 mL)	Carolina	726686
Erlenmeyer flask (500 mL)	Carolina	726694
Freezer: -80 °C	Fisher Scientific
Glass beads (0.5 mm)	BioSpec Products	1107-9105
Microcentrifuge	Hermle	Z216MK
Microcentriguge tubes (1.7 mL)	VWR International	87003-294
Microcentriguge tubes (2.0 mL)	Axygen Maxiclear Microtubes	MCT-200-C
Plastic cuvettes	Fischer Scientific	14-377-012
Power supply	ThermoFisher Scientific	EC105
Rocker	Alkali Scientific	RS7235
Shaking incubator (37 °C)	Benchmark Scientific
Small glass plate	Bio-Rad	1653311
Spacer plates (1 mm)	Bio-Rad	1653308
Spectrophotometer	Thermoscientific	3339053
Tabletop centrifuge for 15 mL centrifuge tubes	Beckman-Coulter
Vertical gel electrophoresis chamber	Bio-Rad	1658004
Vortexer	Fisher Vortex Genie 2	12-812
Thermomixer	Benchmark Scientific	H5000-HC
10 well comb	Bio-Rad	1653359