Экстракция и визуализация белковых агрегатов после лечения кишечной палочки протеотоксическим стрессором

Резюме

Этот протокол описывает экстракцию и визуализацию агрегированных и растворимых белков из кишечной палочки после лечения протеотоксическим противомикробным средством. Следование этой процедуре позволяет качественно сравнивать образование белковой агрегированности in vivo в различных бактериальных штаммах и/или между обработками.

Аннотация

Воздействие на живые организмы экологических и клеточных стрессов часто вызывает нарушения гомеостаза белка и может привести к агрегации белка. Накопление белковых агрегатов в бактериальных клетках может привести к значительным изменениям в клеточном фенотипической поведения, включая снижение темпов роста, стрессоустойчивости и вирулентности. Существует несколько экспериментальных процедур для изучения этих фенотипов, опосредованных стрессорами. В данной работе описан оптимизированный анализ для экстракции и визуализации агрегированных и растворимых белков из различных штаммов кишечной палочки после обработки серебристо-рутениемсодержащим антимикробным средством. Известно, что это соединение генерирует активные формы кислорода и вызывает широко распространенную агрегацию белка.

Метод сочетает в себе центрифугирование на основе разделения белковых агрегатов и растворимых белков из обработанных и необработанных клеток с последующим разделением и визуализацией путем электрофореза додецилсульфат-полиакриламидного геля натрия (SDS-PAGE) и окрашивания Coomassie. Такой подход прост, быстр и позволяет качественно сравнить образование белкового агрегата у разных штаммов E. coli. Методика имеет широкий спектр применения, включая возможность исследования влияния других протеотоксических противомикробных препаратов на агрегацию белка in vivo в широком спектре бактерий. Более того, протокол может быть использован для выявления генов, способствующих повышению устойчивости к протеотоксическим веществам. Гелевые полосы могут быть использованы для последующей идентификации белков, которые особенно склонны к агрегации.

Введение

Бактерии неизбежно подвергаются воздействию множества экологических стрессов, включая низкий рН (например, в желудке млекопитающих)^1,2,активные формы кислорода и хлора (ROS / RCS) (например, во время окислительного всплеска в фагоцитах)^3,4,5, повышенные температуры (например, в горячих источниках или во время теплового шока)^6,7и несколько мощных противомикробных препаратов (например, AGXX, используемый в этом протоколе)^8. Белки особенно уязвимы к любому из этих стрессоров, и воздействие может спровоцировать несложение белка, которое затем сеет агрегацию. Все организмы используют защитные системы, которые позволяют им справляться с неправильным свораскиванием белка^9. Однако сильный стресс может перегрузить механизм контроля качества белка и нарушить вторичную и /или третичную структуру белков, что в конечном итоге инактивирует белки. Как следствие, белковые агрегаты могут серьезно ухудшить критические клеточные функции, необходимые для роста и выживания бактерий, стрессоустойчивости и вирулентности^10. Поэтому исследования, посвященные агрегации белка и ее последствиям у бактерий, является актуальной темой из-за ее потенциального влияния на борьбу с инфекционными заболеваниями.

Тепловое развертывание и агрегация белка часто обратимы⁷. Напротив, другие протеотоксические стрессы, такие как окислительный стресс, могут вызывать необратимые модификации белка путем окисления определенных аминокислотных боковых цепей, что приводит к разложению белка и, в конечном итоге, агрегации белка^4. Стресс-индуцированное образование нерастворимых белковых агрегатов широко изучено в контексте молекулярных шаперонов и их защитных функций у дрожжей и бактерий^11,12,13. Было опубликовано несколько протоколов, которые используют различные биохимические методы для выделения и анализа нерастворимых белковых агрегатов^14,15,16,17. Существующие протоколы в основном использовались для изучения агрегации бактериального белка при тепловом шоке и/или идентификации молекулярных шаперонов. Хотя эти протоколы, безусловно, были продвижением в этой области, в экспериментальных процедурах есть некоторые серьезные неудобства, поскольку они требуют (i) большого объема бактериальной культуры до 10 л^14,17, (ii) сложных процессов физического разрушения, включая использование разрушителей клеток, френч-пресса и / или ультразвуковой^{обработка 14,15,17}или (iii) трудоемкие повторяющиеся этапы промывки и инкубации^15,16,17.

В данной работе описывается модифицированный протокол, направленный на устранение ограничений предыдущих подходов и позволяющий анализировать количество белковых агрегатов, образующихся в двух различных штаммах кишечной палочки после обработки протеотоксичным антимикробным поверхностным покрытием. Покрытие состоит из металл-серебра (Ag) и рутения (Ru)-кондиционированного аскорбиновой кислотой, а его антимикробная активность достигается за счет генерации активных форм кислорода^8,18. Приведено подробное описание получения бактериальной культуры после обработки антимикробным соединением и сравнение состояния агрегации белка при воздействии двух штаммов E. coli с различными профилями восприимчивости к повышению концентрации противомикробного препарата. Описанный способ является недорогим, быстрым и воспроизводимым и может быть использован для изучения агрегации белка в присутствии других протеотоксических соединений. Кроме того, протокол может быть модифицирован для анализа влияния, которое конкретные делеции генов оказывают на агрегацию белка у множества различных бактерий.

протокол

1. Стресс-лечение штаммов E. coli MG1655 и CFT073

1. Инокулируют 5 мл среды лизогенезного бульона (ЛБ) одной колонией комменсального штамма E. coli MG1655 и уропатогенного штамма E. coli (УПЭК) CFT073 соответственно и инкубируют в течение 14-16 ч (ночью) при 37 °C и 300 об/мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Escherichia coli CFT073 является патогеном человека. Обработка CFT073 должна осуществляться с соответствующими мерами биобезопасности в лаборатории, сертифицированной уровнем биобезопасности 2.
2. Разбавляют каждый штамм в колбу 500 мл, содержащую70 мл 3-(N-морфолино)пропансульфоновой кислоты (MOPS)-глюкозы (MOPS-g)(таблица 1)среды до оптической плотности при значении 600 нм (OD₆₀₀₎0,1. Инкубировать при 37 °C и 300 об/мин до достижения средней фазы (OD₆₀₀ = 0,5-0,55).
3. Переложить 20 мл каждой культуры в три предварительно высушенные колбы по 125 мл и инкубировать при 37 °C и 300 об/мин в течение 2 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку требуется своевременная обработка образцов, обрабатывайте не более 6 культур одновременно.
4. Готовят раствор антимикробного соединения в среде MOPS-g в концентрации 2 мг/мл. Добавляют противомикробное противомикробное средстве в каждую культуру для достижения указанных концентраций. Для необработанных элементов управления добавьте необходимый объем среды MOPS-g.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вихрь антимикробного раствора 2 мг/мл, чтобы обеспечить равномерное распределение частиц соединения и избежать осаждения.
5. Инкубировать культуры в течение 45 мин при 37 °C и 300 об/мин.

Рисунок 1:Лечение стресса Escherichia coli. Бактериальные культуры выращивают в МОПС-г и обрабатывают указанными концентрациями серебро-рутений-содержащего противомикробного препарата при достижении средней фазы. Сокращения: LB = лизогенный бульон; Ag-Ru = серебро-рутениевый; MOPS-g = 3-(N-морфолино)пропансульфоновая кислота (MOPS)-глюкоза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

2. Сбор образцов бактериальных клеток

1. После 45 мин лечения стрессом определяют ОД₆₀₀ каждой культуры. Для каждого образца собирают клетки, эквивалентные 4 мл ОД₆₀₀ = 1 в 15 мл центрифужных трубок путем центрифугирования в течение 15 мин при 3000 × г и 4 °C.
2. Полностью удалить супернатант и повторно суспендируют клеточные гранулы в 50 мкл ледяного лизисного буфера(таблица 1). Инкубировать образцы в течение 30 мин на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап лизиса ухудшает слой пептидо сликана. Всегда используйте свежеприготовленный буфер лизиса.
3. Перенесите образцы в микроцентрифужные трубки по 1,7 мл. Заморозить при -80 °C до дальнейшего использования.

Рисунок 2:Забор образцов бактерий. Образцы клеток собираются путем центрифугирования и повторно суспендируются в буфере лизиса с последующим хранением при -80 °C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

3. Извлечение нерастворимых белковых агрегатов

1. Оттаивать образцы на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Цикл замораживания-оттаивания способствует лизису клеток.
2. Добавьте 360 мкл ледяного буфера А(таблица 1)и аккуратно перемешайте путем пипетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Осмотический шок также будет способствовать лизису клеток.
3. Перенесите образец в микроцентрифужную трубку размером 2 мл, содержащую ~200 мкл стеклянных шариков толщиной 0,5 мм. Инкубировать в течение 30 мин при 8 °C в термомиксаторе с встряхиванием при 1 400 об/мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг приводит к физическому нарушению работы клетки. Ингибитор протеазы может быть использован для минимизации деградации белка. Разрушение может быть выполнено при 4 °C. Обратите внимание, что использование стеклянных шариков, как сообщается, вызывает агрегацию небольшого подмножества белков в дрожжах^19.
4. Инкубировать в течение 5 мин на льду без встряхивания, чтобы осесть стеклянные шарики. Перенесите 200 мкл клеточного лизата в микроцентрифужные трубки 1,7 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте переноса стеклянных бусин.
5. Центрифуга при 16 000 × г и 4 °C в течение 20 мин. Соберите супернатант, который содержит растворимые белки, и переходите к разделу 4.
6. Повторно суспендируют гранулу в 200 мкл ледяного буфера А(таблица 1)с помощью пипетки. Центрифуга при 16 000 × г и 4 °C в течение 20 мин. Осторожно удалите супернатант вообще.
7. Добавьте 200 мкл ледяного буфера B (см. Таблицу 1 и Таблицу материалов)и осторожно повторно суспендирование гранул путем пипетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Неионное моющее средство солюбилизирует мембранный белок.
8. Центрифугирование повторяют при 16 000 × г и 4 °C в течение 20 мин. Осторожно удалите супернатант.
9. Повторно суспендируют гранулу в 200 мкл холодного буфера А(таблица 1)путем пипетирования. Центрифуга при 16 000 × г и 4 °C в течение 20 мин. Полностью удалить супернатант.
10. Повторно суспендируют гранулу в 100 мкл 1x восстанавливающего буфера образца SDS(таблица 1)и кипятят в течение 5 мин при 95 °C в термомиксаторе.
11. Храните образец при -20 °C, чтобы продолжить позже или немедленно загрузить полиакриламидный гель SDS для разделения.

Рисунок 3:Экстракция нерастворимых белковых агрегатов. Экстракция белковых агрегатов включает в себя ряд этапов, включая разрушение клеток, отделение белковых агрегатов от растворимых белков, солюбилизацию мембранных белков и промывку. Аббревиатура: SDS = додецилсульфат натрия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

4. Пробоподготовка растворимого белка

1. Смешайте 1 объем 100% трихлоруксусной кислоты (ТЦА) с 4 объемами образца растворимого белка из шага 3.6.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для обработки TCA требуется вытяжной капюшон и средства индивидуальной защиты, а также утвержденная процедура удаления отходов.
2. Инкубировать в течение 10 мин при 4 °C, чтобы обеспечить осаждение белка.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Белый осадок появится очень скоро.
3. Центрифуга выпадает в осадок при 21 000 × г и 4 °C в течение 5 мин и удаляет супернатант. Промыть гранулу 200 мкл ледяного ацетона для удаления клеточного мусора. Центрифуга при 21 000 × г и 4 °C в течение 5 мин и удаление супернатанта. Повторите эти действия на шаге 4.3 в общей сложности три раза.
4. Поместите микроцентрифужные трубки с открытыми крышками в термомикшер при 37 °C, чтобы удалить оставшийся ацетон из гранулы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация более 5 мин может снизить растворимость белковой гранулы.
5. Добавьте 100 мкл 1x восстанавливающего буфера SDS(таблица 1)и полностью растворите гранулу. Вскипятите образец в течение 5 мин при 95 °C.
6. Храните образец при -20 °C, чтобы продолжить позже или немедленно загрузить полиакриламидный гель SDS для разделения.

Рисунок 4:Получение растворимых белков. Приготовление растворимого белка включает стадию осаждения трихлоруксусной кислотой и многократное промывание ледяным ацетоном. Сокращения: TCA = трихлоруксусная кислота; SDS = додецилсульфат натрия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

5. Разделение и визуализация экстрагированных белковых агрегатов с помощью SDS-PAGE

1. Приготовьте 12% SDS-полиакриламидный гель.
   1. Для двух разделяющих гелей пипетка 5,1 мл двойной дистиллированной воды (ddH₂O), 3,75 мл Tris-HCl (рН 8,8), 7,5 мл 20% (мас./об.) SDS, 6 мл 30% раствора акриламида/бисакриламида (29:1), 75 мл 10% мас./v персульфата аммония и 10 мл тетраметилэтилендиамина (TEMED) в 15 мл центрифужной трубки и аккуратно перемешайте без введения пузырьков воздуха. Залейте гель, используя пипетку 1 мл, в стеклянные пластины, оставив верхние 2 см свободными от смеси. Добавьте 70% этанола в верхнюю часть разделяющего геля и обеспечьте равномерное сопряжение между двумя слоями.
   2. После полимеризации сепарационного геля готовят укладочный гель путем пипетирования 1,535 мл ddH₂O, 625 мл Tris-HCl (pH 6,8), 12,5 мл 20% (мас./об.) SDS, 335 мл 30% раствора акриламида/бисакриламида (29:1), 12,5 мл 10% мас./об.персульфата аммония и 2,5 мл TEMED. Удалите этанол из разделительных гелей и добавьте раствор геля для укладки. Вставьте расческу с нужным количеством карманов без введения пузырьков воздуха. Опустить полимеризацию в течение 20-30 мин.
2. Загрузите 4 мкл каждого образца и белковую лестницу в отдельные скважины и запустите гель (гели) в буфере работы Трис-Глицина(Таблица 1)при 144 В в течение 45 мин при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Остановите гель, когда бромфенольный бандаж собирается мигрировать из геля.
3. Окрашивают гель(ы) в предварительно выплавленный раствор Фэрбенкса А(таблица 1)в течение 30 мин на коромысле.
4. Отклейте гель(ы) в предварительно распаленном растворе Фэрбенкса D(таблица 1)до желаемого фона (например, на ночь) на коромысле.

Рисунок 5:Разделение и визуализация белков. Образцы разделены SDS-PAGE и визуализируются окрашиванием Coomassie. Аббревиатура: SDS-PAGE = электрофорез додецилсульфат-полиакриламидного геля натрия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Результаты

Рисунок 6:Репрезентативные результаты антимикробной агрегации белка в комменсальном штамме Escherichia coli MG1655 и штамме UPEC CFT073. Штаммы E. coli MG1655 и CFT073 выращивали при 37 °C и 300 об/мин до OD₆₀₀= 0,5-...

Обсуждение

Данный протокол описывает оптимизированную методологию анализа образования белковых агрегатов после обработки различных штаммов E. coli протеотоксическим противомикробным средством. Протокол допускает одновременную экстракцию нерастворимых и растворимых белковых фракций из об...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals/Reagents
Acetone	Fisher Scientific	67-64-1
30% Acrylamide/Bisacrylamide solution 29:1	Bio-Rad	1610156
Ammonium persulfate	Millipore Sigma	A3678-100G
Benzonase nuclease	Sigma	E1014-5KU
Bluestain 2 Protein ladder, 5-245 kDa	GoldBio	P008-500
β-mercaptoethanol	Millipore Sigma	M6250-100ML
Bromophenol blue	GoldBio	B-092-25
Coomassie Brilliant Blue R-250	MP Biomedicals LLC	821616
D-Glucose	Millipore Sigma	G8270-1KG
D-Sucrose	Acros Organics	57-50-1
Ethylenediamine tetra acetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	SLBT9686
Glacial Acetic acid	Millipore Sigma	ARK2183-1L
Glycerol, 99%	Sigma-Aldrich	G5516-1L
Glycine	GoldBio	G-630-1
Hydrochloric acid, ACS reagent	Sigma-Aldrich	320331-2.5L
Isopropanol (2-Propanol)	Sigma	402893-2.5L
LB broth (Miller)	Millipore Sigma	L3522-1KG
LB broth with agar (Miller)	Millipore Sigma	L2897-1KG
Lysozyme	GoldBio	L-040-25
10x MOPS Buffer	Teknova	M2101
Nonidet P-40	Thomas Scientific	9036-19-5
Potassium phosphate, dibasic	Sigma-Aldrich	P3786-1KG
Potassium phosphate, monobasic	Acros Organics	7778-77-0
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771-500G
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Millipore Sigma	T9281-50ML
Thiamine	Sigma-Aldrich	T4625-100G
100% Trichloroacetic acid	Millipore Sigma	T6399-100G
Tris base	GoldBio	T-400-1
Material/Equipment
Centrifuge tubes (15 mL)	Alkali Scientific	JABG-1019
Erlenmeyer flask (125 mL)	Carolina	726686
Erlenmeyer flask (500 mL)	Carolina	726694
Freezer: -80 °C	Fisher Scientific
Glass beads (0.5 mm)	BioSpec Products	1107-9105
Microcentrifuge	Hermle	Z216MK
Microcentriguge tubes (1.7 mL)	VWR International	87003-294
Microcentriguge tubes (2.0 mL)	Axygen Maxiclear Microtubes	MCT-200-C
Plastic cuvettes	Fischer Scientific	14-377-012
Power supply	ThermoFisher Scientific	EC105
Rocker	Alkali Scientific	RS7235
Shaking incubator (37 °C)	Benchmark Scientific
Small glass plate	Bio-Rad	1653311
Spacer plates (1 mm)	Bio-Rad	1653308
Spectrophotometer	Thermoscientific	3339053
Tabletop centrifuge for 15 mL centrifuge tubes	Beckman-Coulter
Vertical gel electrophoresis chamber	Bio-Rad	1658004
Vortexer	Fisher Vortex Genie 2	12-812
Thermomixer	Benchmark Scientific	H5000-HC
10 well comb	Bio-Rad	1653359