Um modelo eficaz de rato de isquemia renal unilateral-reperfusão lesão

Resumo

A lesão por isquemia renal está associada à alta morbidade e mortalidade em pacientes hospitalizados. Aqui, apresentamos um modelo de camundongo simples e eficaz de lesão unilateral de isquemia renal-reperfusão e fornecemos uma visão geral sequencial das alterações patológicas representativas observadas no rim.

Resumo

A lesão por reperfusão de isquemia (IRI) é a principal causa de insuficiência renal aguda e é um contribuinte significativo para a função de enxerto retardada. Os modelos animais são os únicos recursos disponíveis que imitam as complexidades dos danos associados ao IRI encontrados in vivo. Este artigo descreve um modelo eficaz de mouse de IRI renal unilateral que fornece dados altamente reprodutíveis. Isquemia é induzida por ocluir o pediculo renal direito por 30 minutos seguido de reperfusão. Além do procedimento cirúrgico, será fornecida uma visão geral sequencial das alterações fisiológicas e histopatológicas esperadas após o IRI renal, comparando dados de sete diferentes tempos de reperfusão (4h, 8h, 16h, 1 dia, 2 dias, 4 dias e 7 dias). Serão compartilhados dados críticos para o planejamento de experimentos à frente, como tempo cirúrgico médio, consumo médio de anestésicos e mudanças de peso corporal ao longo do tempo. Este trabalho ajudará os pesquisadores a implementar um modelo IRI renal confiável e selecionar o tempo de reperfusão adequado que se alinha com seus objetivos investigativos pretendidos.

Introdução

Os rins estão entre os órgãos mais perfusados do corpo e são extremamente suscetíveis a alterações na perfusão^{sanguínea 1}. A lesão por isquemia renal -reperfusão (IRI) continua sendo a principal causa de insuficiência renal aguda ^2,3 e está associada à alta morbidade e alta mortalidade em pacientes hospitalizados⁴. Com opções terapêuticas limitadas ^{disponíveis,4,5} IRI renal é atualmente o foco de diversos esforços de pesquisa em biomedicina ^6,7 visando o desenvolvimento de novos alvos terapêuticos e a caracterização de marcadores precoces e sensíveis de lesão renal ^8,9,10 . Identificar um modelo animal confiável, de tempo e econômico é considerado essencial para atender a essas necessidades. Este artigo apresenta um modelo de rato simples e eficaz de IRI renal unilateral. Isquemia é induzida pela fixação do pedículo renal direito por 30 min^11,12. Uma parte crucial deste modelo é escolher o tempo de reperfusão mais adequado que reproduzirá os eventos patológicos de interesse, como necrose tubular, infiltração de células inflamatórias polimorfonucleares ou fibrose. Portanto, os pesquisadores recebem esse panorama sequencial das mudanças patológicas representativas esperadas no rim IRI.

Protocolo

O protocolo a seguir descreve uma cirurgia de sobrevivência. Portanto, aplica-se a maior prática asséptica e cirúrgica. Todos os experimentos em animais foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais. Para eliminar as diferenças de gênero e de tensão nos efeitos IRI, apenas os camundongos C57BL6 masculinos foram utilizados no estudo. Todos os animais foram combinados em idade e peso para produzir resultados comparáveis.

1. Preparação

NOTA: Uma linha do tempo das diferentes fases experimentais e intervenções é mostrada na Figura 1A.

1. Limpe e desinfete a mesa cirúrgica antes de cada procedimento. Prepare e coloque todos os materiais necessários (instrumentos esterilizados e cotonetes de algodão, gaze e cortinas estéreis, anestésicos pré-diluídos, almofada de aquecimento, grampo vascular esterilizado, solução salina estéril e antissépticos e sutura da pele) na mesa cirúrgica (ver a Tabela dos Materiais).
2. Anesthetize camundongos C57BL6 machos (faixa etária de 11 a 13 semanas) por injeção intraperitoneal de cetamina/xilazina (100 mg/kg e 20 mg/kg de peso corporal, respectivamente, previamente diluído em soro fisiológico estéril).
   NOTA: O manejo qualificado de animais é essencial para minimizar o estresse para o animal, pois as respostas ao estresse podem afetar negativamente a ação dos anestésicos.
3. Após a administração da cetamina/xilazina, raspe a área cirúrgica no flanco direito usando uma lâmina de barbear e sabão.
   NOTA: Raspar a pele melhora a cicatrização de feridas, bem como os resultados gerais das cirurgias de sobrevivência.
4. Desinfete a pele na área cirúrgica com 70% de álcool primeiro e depois com solução de iodo povidone usando um cotonete.
5. Após a preparação da pele, coloque o mouse sobre uma mesa de aquecimento em uma posição de decúbito ventral e estabilize a temperatura corporal a 37 °C (monitorada através de sondas retal e sensor de almofada).
   NOTA: Os rins são mais facilmente acessados e expostos cirurgicamente quando colocados em decúbito ventral em vez de laterais.
6. Enquanto a temperatura do corpo estiver estabilizada, aplique pomada nos olhos do rato.
   NOTA: Anestésicos dissociativos, como a cetamina, fazem com que os olhos do animal permaneçam abertos enquanto anestesiados.

2. Cirurgia

1. Uma vez que os reflexos da dor estejam ausentes (pinças do pé), realize uma incisão cirúrgica dorso-lateral de aproximadamente 1 cm no flanco direito usando uma lâmina de bisturi. Inicie a incisão atrás da última costela e continue caudally aproximadamente 1 cm paralelo à linha média lombar.
2. Transecte a musculatura abdominal usando uma tesoura para visualizar o espaço retroperitoneal. Remova as pequenas quantidades de sangue produzidas durante a secção dos músculos usando cotonetes estéreis.
   NOTA: Como a abordagem dorso-lateral é usada, o retroperitônio, e não a cavidade peritônica, é acessado com este procedimento.
3. Empurre o rim direito para fora da cavidade abdominal. Use fórceps graefe para expor o rim cuidadosamente.
   NOTA: Mantenha sempre os fórceps fechados para evitar lesões traumáticas no rim quando colocados no abdômen e use-o apenas para empurrar cuidadosamente e guiar o rim em direção à incisão cirúrgica e fora dele.
4. Exponha lentamente o rim direito e identifique o pedículo renal. Remova cuidadosamente o tecido adiposo ao redor do pedículo.
5. Para induzir a isquemia, coloque o grampo vascular sobre a artéria renal e a veia presentes no pedículo renal, evitando a fixação do ureter adjacente. Use um hemostato halsted-mosquito para manipular o grampo vascular.
   NOTA: A isquemia é confirmada pela visualização de uma mudança na cor do rim de vermelho-rosa para roxo escuro (Figura 1B).
6. Cubra o rim preso com gaze estéril encharcada em soro fisiológico para evitar a dessacação e deixe-o por 30 minutos.
7. Monitore a profundidade e a umidade da gaze periodicamente durante este período.
   NOTA: A dose de indução da anestesia é suficiente para fornecer analgesia até o final do evento isquêmico; portanto, não são necessárias injeções anestésicos adicionais.
8. Pouco antes do fim do período de isquemia, remova a gaze e descubra o rim. Segure o hemostato Halsted-Mosquito, pronto para a remoção do grampo.
9. No minuto 30, abra o grampo vascular com o hemostato e remova-o do pedículo renal para permitir a reperfusão do rim.
   NOTA: A reperfusão é confirmada pela visualização de uma mudança na cor do rim do roxo escuro para o vermelho-rosa (Figura 1C).
10. Realizar os mesmos procedimentos descritos acima para animais falsos sem fixação do pedículo renal.
11. Após a verificação da mudança de cor renal, devolva o rim à cavidade abdominal. Feche os músculos abdominais com sutura absorvível 5-0 usando um padrão cruzado.
    NOTA: Uma segunda injeção de anestésicos pode ser necessária para manter a analgesia durante a sutura dos músculos e da pele. Metade da dose inicial mostrou-se eficaz no fornecimento de analgesia até a conclusão da cirurgia.
12. Feche a pele com sutura absorvível 5-0 usando um padrão de colchão horizontal. Limpe a ferida com uma solução de iodo povidone usando um cotonete.

3. Recuperação e pós-cirurgia

NOTA: Como o tempo pós-cirúrgico é o tempo real de reperfusão, o cuidado pós-cirúrgico adequado é eticamente obrigatório e cientificamente relevante. Os tempos de reperfusão podem ser selecionados conforme o exigido pelo pesquisador. Os tempos de reperfusão de 4h, 8h, 16h, 1 dia, 2 dias, 4 dias e 7 dias são comparados para obter uma visão geral sequencial das alterações patológicas induzidas pelo IRI renal.

1. Mantenha o mouse na almofada de aquecimento até que ele comece a se recuperar da anestesia.
   NOTA: Recomenda-se esperar até que o mouse comece a mover as pernas e tente se mover. Nos casos em que injeções anestésicos adicionais são necessárias durante a cirurgia, o tempo de recuperação é maior. Atipamezole, um antagonista do receptor alfa-2, pode ser administrado a uma dose de 0,5 mg/kg de peso corporal intraperitoneal para reverter os efeitos da xilazina e encurtar a fase de recuperação. Para o tratamento da dor, a buprenorfina (0,1 mg/kg de peso corporal, intraperitoneally) é administrada pré-operatória e a cada 6 horas durante a fase de recuperação e pós-cirúrgica. O uso de anti-inflamatórios não esteroides é desencorajado, pois várias drogas nesta família induzem a nefrotoxicidade e podem, portanto, alterar os resultados.
2. Após a recuperação da anestesia, coloque o rato de volta em sua gaiola com livre acesso à água e à comida.
   NOTA: Os alimentos purê podem ser fornecidos em uma placa de Petri, bem como material para se esconder e jogar (por exemplo, folhas de papel, tubos de papel toalha).
3. Monitore o camundongo diariamente para avaliar a cicatrização da ferida, a ingestão de alimentos e água, o peso corporal e o comportamento.
   NOTA: O estado de cicatrização da ferida foi avaliado utilizando a seguinte escala: 1, seco; 2, molhado; 3, parcialmente aberto; 4, aberto. A cicatrização rápida de feridas foi documentada neste estudo, com mais de 90% das feridas secas após o 2º dia.

4. Eutanásia e coleta de amostras

1. Eutanize os camundongos com pentobarbital de sódio administrados intraperitoneal em uma dose que é o dobro da dose anestésica para camundongos (100 mg/kg).
2. Coletar amostras de fluido e tecido conforme necessário.
   NOTA: Foram coletados os rins, sangue inteiro (para contagem de células sanguíneas), soro (para bioquímica sanguínea), urina, coração e pulmões. Alguns microliters de soro são necessários para análise bioquímica sanguínea (nitrogênio de ureia sanguínea (BUN), creatinina, eletrólitos). Se necessário, 24 horas antes da eutanásia, os camundongos podem ser colocados em gaiolas metabólicas para coletar um maior volume de urina que permite a determinação dos parâmetros da função renal.

Resultados

Parâmetros fisiológicos
Camundongos recuperados desta cirurgia renal unilateral IRI sem intercorrências; apareceu ativo e alerta; e mostrou alimentação normal, bebida e comportamento até o dia seguinte. Alguns camundongos podem ter perda de peso corporal pós-IRI, embora geralmente seja menos de 10% do peso corporal inicial (Figura 2). Maiores perdas de peso corporal (˃10%) podem ser prejudiciais, e esses animais devem ser removidos do estudo. Camundongos operados por sham não apresentaram alterações de peso corporal após a cirurgia (medidos 24 horas após a cirurgia). A maioria dos camundongos recuperou seu peso corporal inicial entre os dias 4 e 7 pós-cirurgia (ver grupo de 7 dias IRI, Figura 2). A função renal pode ser avaliada usando marcadores tradicionais como nitrogênio de ureia sanguínea (BUN) e creatinina. Além disso, foram incluídos na análise os níveis de eletrólitos (sódio, potássio e cloreto) e uma contagem de sangue diferencial automatizada.

Mudanças histopatológicas
A avaliação dos achados histopatológicos foi feita utilizando-se de 4% de seções integrais integrais do rim manchadas com hematoxilina/eosina (HE), ácido periódico Schiff e manchas tricráticas de Masson. As mudanças mais evidentes produzidas por este modelo iri renal unilateral podem ser vistas na junção cortico-medular, especificamente nos túbulos proximais, membros ascendentes espessos do laço de Henle, e túbulos distais convoludos, bem como no interstício tubular (ver a legenda da Figura 3). Imagens microscópicas que mostram as lesões mais características após o IRI no rim podem ser vistas na Figura 3. Uma lista dos achados histopatológicos sequenciais está prevista na Tabela 1.

Um sistema de pontuação de lesão tubular foi desenvolvido para categorizar o dano ao longo do tempo (Figura 4). Neste, cinco alterações definidas foram avaliadas por três avaliadores diferentes: 1) atenuação epitelial tubular; 2) perda de borda de escova; 3) necrose tubular; 4) obstrução luminal; e 5) presença de elenco proteináceo. Uma atribuição de "1" indica que a alteração está presente, "0" que está ausente.

Figura 1: Modelo iri renal experimental no camundongo. (A) Fases de experimentos e intervenções (indução de anestesia, isquemia e reperfusão) são mostradas. Observe as alterações na cor do rim direito para vermelho escuro durante a isquemia (B) para rosa durante a reperfusão (C). (D) Aparência macroscópica do rim direito IRI (seta vermelha) em comparação com o rim não-IRI contralateral do mesmo animal 24 h após a cirurgia. A seta vermelha em (B) mostra a posição do grampo hemostático. Abreviação: IRI = Lesão isquemia-reperfusão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Peso corporal de camundongos antes e depois do IRI renal. Dados individuais são mostrados. Abreviaturas: IRI = Lesão de isquemia-reperfusão; h = horas; d = dias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Lesões microscópicas típicas observadas no córtex e na junção cortico-medular de camundongos operados pelo IR. Sham e diferentes tempos de reperfusão são mostrados (indicado acima de cada imagem). (A) Estruturas intactas são mostradas em farsa (ampliação 40x; barra de escala = 20 μm). Setas em IRI 4 h indicam a presença de protécnicos lançados no lúmen tubular (ampliação 40x; barra de escala = 20 μm). Setas em IRI 8 h mostram dilatação tubular (ampliação 40x; barra de escala = 50 μm). Seta preta no IRI 16 h mostra elenco tubular em segmentos medulares; setas brancas mostram áreas de necrose celular (ampliação 40x; barra de escala = 50 μm). As setas pretas no IRI 1 d indicam dilatação tubular (ampliação 10x; barra de escala = 100 μm). A seta preta no IRI 2 d mostra núcleos celulares ampliados; pontas de flechabrabrabrais mostram áreas de linfócito e infiltração de macrófago (ampliação 40x; barra de escala = 50 μm). Pontas de flecha branca em IRI 4 d indicam células tubulares mitóticas (ampliação 40x; barra de escala = 50 μm). A seta preta no IRI 7 d mostra uma área de fibrose focal; a ponta da seta branca mostra uma área de regeneração (ampliação 20x; barra de escala = 100 μm). (B) Coloração PAS mostrando o córtex renal de camundongos durante a reperfusão precoce (4h, 8 h e 16 h). Observe a atenuação progressiva da borda do pincel (setas). Ampliações 40x; barras de escala = 50 μm (C) Mancha tricrática masson de sham e IRI 7 d ratos mostrando áreas de fibrose intersticial (setas brancas). Ampliação 40x; barras de escala = 50 μm. Abreviaturas: IRI = Lesão de isquemia-reperfusão; Glo = glomerulus; PCT = túbulo convolucido proximal; DCT = túbulo distal convolutado; CD = coletor de duto; PAS = ácido periódico Schiff; d = dia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Pontuação de lesão tubular de ratos falsos e operados por IRI. Dimensionação do sistema de pontuação 1 a 5 para atenuação epitelial tubular; perda da fronteira de escova; necrose tubular; obstrução luminal; e presença de elenco proteináceo. Uma atribuição de "1" indica que a alteração está presente, "0" que está ausente. Valores individuais são mostrados. As barras representam ± média SD (n = 4). Abreviação: IRI = Lesão isquemia-reperfusão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tempo depois do IRI	Mudanças patológicas mais significativas
4h	Obstrução tubular
	Proteína lançada em lúmen
8 h	Dilatação tubular
	Necrose incipiente
	Atenuação do epitélio
16 h	Necrose celular
	Elenco tubular
	Infiltração de neutrófilo
1 dia	Necrose
	Dilatação tubular
	Infiltração de neutrófilo
2 dias	Dilatação tubular
	Infiltração de linfócitos e macrófagos
	Núcleos celulares ampliados
4 dias	Atividade mitótica proeminente em células túbulos
7 dias	Fibrose focal
	Áreas de regeneração

Tabela 1: Mudanças patológicas mais significativas ao longo do tempo. Diagnosticado com base no exame microscópico de 4-6 animais por grupo.

Discussão

Os modelos IRI renais do rato são populares em pesquisas biomédicas devido aos seus custos operacionais relativamente baixos e à disponibilidade de diversos modelos transgênicos¹². O modelo IRI renal unilateral apresentado aqui imita alterações patológicas características observadas no IRI renal humano, como dilatação tubular, necrose e fibrose¹³. Esses resultados são baseados em diferentes tempos de reperfusão.

As etapas críticas deste protocolo incluem a manutenção da temperatura constante do corpo e a correta colocação do grampo vascular no pedículo renal. A temperatura corporal influencia o metabolismo do animal¹⁴, alterando os resultados experimentais tanto nos níveis fisiológicos quanto celulares¹⁵. Neste modelo, a temperatura corporal foi estabilizada antes da cirurgia usando sondas retal e sensor de almofada. Além disso, o monitoramento contínuo da temperatura corporal durante todo o procedimento cirúrgico é altamente recomendado, especialmente antes de colocar o grampo vascular para induzir isquemia.

A exposição do rim e a colocação adequada do grampo vascular também são fundamentais para o sucesso do experimento. Danos na cápsula renal pelo manuseio inadequado dos fórceps durante a exposição do rim através da incisão cirúrgica resultarão em hemorragia perirenal e inflamação. O grampo vascular deve ser colocado no pedículo renal que oclui a artéria renal e a veia renal sem afetar o ureter e as artérias suprarenais. Crítico para esta etapa é a dissecação cuidadosa do tecido adiposo em torno do hilum renal^14,16.

Este modelo é econômico e de tempo. O consumo anestésico por camundongo foi de 156,47 ± 37,88 μL (média ± SD, n = 17) de um coquetel de cetamina/xilazina prediluada (1:10 cetamina, 1:50 xilazina, em solução salina; concentração de solução de estoque, 100 mg/mL ambos). A cirurgia pode ser realizada em um período relativamente curto. O tempo total de cirurgia por camundongo foi de 53 ± 5,23 min (média ± SD, n = 17). Com pessoal treinado, várias cirurgias podem ser realizadas ao mesmo tempo. Em nosso grupo, um pesquisador experiente realizou a cirurgia até que o grampo foi liberado do pedículo renal, enquanto um segundo assumiu o lugar do fechamento da ferida até a recuperação do camundongo. Com essa abordagem, conseguimos realizar um alto número de cirurgias em um único dia. Neste modelo, utilizou-se a abordagem dorsolateral, que resulta em menos trauma e redução da perda de fluido e calor da cavidade abdominal em comparação com a abordagem média¹⁶.

Protocolos publicados anteriormente descreveram a técnica de fixação de pediculos renais para induzir lesão renal aguda em camundongos 17,18,19. Entretanto, nesses estudos, foi realizada nefréctomia contralateral, além do IRI unilateral com tempos isquêmicos que variavam de 15 a 26 min. Neste protocolo, induzímos isquemia unilateral por 30 minutos, preservando o rim contralateral. Isso resultou em uma taxa de sobrevivência de 100%. No entanto, este modelo não é adequado para induzir danos renais azotemicos devido em parte ao efeito compensatório exercido pelo rim contralateral não interventado cirurgicamente. No entanto, manter um rim não afetado no mesmo animal oferece a vantagem de usar tempos de isquemia mais longos com uma maior taxa de sobrevivência. Além disso, o rim contralateral pode ser utilizado para avaliar possíveis efeitos colaterais de medicamentos ou tratamentos de teste aplicados durante o procedimento experimental e para estudar os efeitos do crosstalk renal-renal ^20,21. Por exemplo, este modelo tem sido útil para mostrar alterações reativas induzidas por espécies de oxigênio no nível celular tanto no IRI quanto no rim interpuldido não cirúrgico¹¹.

Este modelo tem uma aplicação potencial em estudos com o objetivo de identificar e caracterizar marcadores de danos renais unilaterais, efeitos de crosstalk renal, alterações hemodinâmicas induzidas por IRI pós-renal e potenciais efeitos nefrotóxicos de candidatos a medicamentos a serem usados no IRI renal. Esta descrição detalhada das principais mudanças patológicas serve como uma ferramenta valiosa para selecionar o tempo mais adequado para estudar processos celulares específicos, desde inflamação e necrose (4h a 2 dias) até regeneração (4 dias) e fibrose (7 dias e depois).

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Atipamezole hydrochloride	Penn Veterinary Supply, Inc., PA, USA	PVS8700	5 mg/mL
Buprenorphine	Penn Veterinary Supply, Inc., PA, USA	PRMBURPEN22	0.3 mg/mL
Commercial euthanasia solution	various suppliers	na	e.g., Euthasol Virbac (sodium pentobarbital 390 mg/mL + sodium phenytoin 50 mg/mL)
Eye ointment Puralube	Dechra Veterinary Products, KS, USA	na	3.5 g (1/8 oz)
Heating pad RightTempJr	Kent Scientific, CT, USA	RT-JR-20	Consider the one with two temperature probes
Ketamine hydrochloride	Penn Veterinary Supply, Inc., PA, USA	VED1220	100 mg/ml
S&T Vascular clamp	Fine Science Tools, Inc., Germany	00398-02	Jaw dimensions: 5.5 x 1.5 mm; length: 11 mm
Sterile Disposable Towel Drapes	Kent Scientific, CT, USA	SURGI-5023-3	Disposable, individualy packed
Surgical instruments (Graefe forceps, Halsted-Mosquito hemostat, scissors, etc)	Fine Science Tools, Inc., Germany	Various	Consider the extra fine straight scissor and the angled Graefe forceps
Vicryl suture	Ethicon US, LLC	J493G	Size 5-0
Xylazine hydrochloride	Penn Veterinary Supply, Inc., PA, USA	VAM4821	100 mg/mL