Эффективная мышиная модель односторонней почечной ишемии-реперфузионной травмы

Резюме

Почечная ишемия-реперфузионная травма связана с высокой заболеваемостью и смертностью у госпитализированных пациентов. Здесь мы представляем простую и эффективную мышиную модель односторонней почечной ишемии-реперфузионного повреждения и предоставляем последовательный обзор репрезентативных патологических изменений, наблюдаемых в почках.

Аннотация

Ишемия-реперфузионное повреждение (IRI) является основной причиной острой почечной недостаточности и является значительным фактором задержки функции трансплантата. Животные модели являются единственными доступными ресурсами, которые имитируют сложности повреждений, связанных с IRI, встречающихся in vivo. В этой статье описывается эффективная мышиная модель одностороннего почечного IRI, которая предоставляет высоковоспроизводимые данные. Ишемия индуцируется путем закупорки правой почечной ножки в течение 30 мин с последующей реперфузией. В дополнение к хирургической процедуре будет предоставлен последовательный обзор ожидаемых физиологических и гистопатологических изменений после почечной ИРИ путем сравнения данных семи различных периодов реперфузии (4 ч, 8 ч, 16 ч, 1 день, 2 дня, 4 дня и 7 дней). Будут предоставлены критически важные данные для планирования предстоящих экспериментов, такие как среднее время операции, среднее потребление анестетика и изменения массы тела с течением времени. Эта работа поможет исследователям реализовать надежную почечную модель IRI и выбрать подходящее время реперфузии, которое соответствует их предполагаемым целям исследования.

Введение

Почки являются одними из самых высоких перфузированных органов в организме и чрезвычайно восприимчивы к изменениям перфузии крови¹. Почечная ишемия-реперфузионная травма (ИРИ) остается ведущей причиной острой почечной недостаточности ^2,3 и связана с высокой заболеваемостью и высокой смертностью у госпитализированных пациентов⁴. При ограниченных доступных терапевтических ^{возможностях,4,5} почечный ИРИ в настоящее время находится в центре внимания нескольких исследовательских усилий в области биомедицины ^6,7, направленных на разработку новых терапевтических мишеней и характеристику ранних и чувствительных маркеров повреждения почек ^8,9,10 . Определение надежной, своевременной и экономически эффективной модели животных считается необходимым для удовлетворения этих потребностей. В данной работе представлена простая и эффективная мышиная модель одностороннего почечного ИРИ. Ишемия индуцируется пережатием правой почечной ножки в течение 30 мин^11,12. Важной частью этой модели является выбор наиболее подходящего времени реперфузии, которое будет воспроизводить патологические события, представляющие интерес, такие как трубчатый некроз, полиморфноядерная воспалительная инфильтрация клеток или фиброз. Поэтому исследователям предоставляется этот последовательный обзор репрезентативных патологических изменений, ожидаемых в почках IRI.

протокол

Следующий протокол описывает операцию по выживанию. Поэтому применяется высшая асептическая и хирургическая практика. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с институциональными руководящими принципами и были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию. Чтобы устранить гендерные и штаммовые различия в эффектах IRI, в исследовании использовались только самцы мышей C57BL6. Все животные были сопоставлены по возрасту и весу для получения сопоставимых результатов.

1. Подготовка

ПРИМЕЧАНИЕ: Временная шкала различных экспериментальных фаз и вмешательств показана на рисунке 1А.

1. Очищайте и дезинфицируйте хирургический стол перед каждой процедурой. Подготовьте и поместите на хирургический стол все необходимые материалы (стерилизованные инструменты и ватные тампоны, стерильную марлю и шторы, предварительно разбавленные анестетики, грелку, стерилизованный сосудистый зажим, стерильный физиологический раствор, кожные антисептики и шов) (см. Таблицу материалов).
2. Обезболить самцов мышей C57BL6 (возрастной диапазон 11-13 недель) внутрибрюшинной инъекцией кетамина/ксилазина (100 мг/кг и 20 мг/кг массы тела соответственно, ранее разбавленных в стерильном физиологическом растворе).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Квалифицированное обращение с животными имеет важное значение для минимизации стресса для животного, так как стрессовые реакции могут негативно повлиять на действие анестетиков.
3. После введения кетамина/ксилазина сбрызните хирургическую область на правом боку с помощью бритвенного лезвия и мыла.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Бритье кожи улучшает заживление ран, а также общие результаты операций по выживанию.
4. Продезинфицируйте кожу в хирургической области сначала 70% спиртом, а затем раствором повидона йода с помощью ватный тампон.
5. После подготовки кожи поместите мышь на нагревательный стол в вентральное пролежневое положение и стабилизируйте температуру тела на уровне 37 °C (контролируется с помощью ректальных и прокладочных датчиков).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Почки легче доступны и подвергаются хирургическому воздействию при помещении в вентральный пролежни, а не в боковой.
6. Пока температура тела стабилизируется, нанесите глазную мазь на глаза мыши.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Диссоциативные анестетики, такие как кетамин, заставляют глаза животного оставаться открытыми во время анестезии.

2. Хирургия

1. Как только болевые рефлексы отсутствуют (защемление пальца ноги пинцетом), выполните примерно 1 см дорсолатеральный хирургический разрез на правом фланге с помощью лезвия скальпеля. Начните разрез за последним ребром и продолжайте каудально примерно на 1 см параллельно поясничной средней линии.
2. Трансекция мускулатуры живота с помощью ножниц для визуализации забрюшинного пространства. Удалите небольшое количество крови, образующейся во время разрезания мышц, используя стерильные ватные тампоны.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку используется дорсолатеральный подход, с помощью этой процедуры осуществляется доступ к забрюшинному мозгу, а не к брюшной полости.
3. Вытолкните правую почку из брюшной полости. Используйте щипцы Graefe, чтобы осторожно обнажить почку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда держите щипцы закрытыми, чтобы избежать травматического повреждения почки при размещении на животе, и используйте его только для того, чтобы осторожно толкать и направлять почку к хирургическому разрезу и из него.
4. Медленно обнажите правую почку и определите почечную ножку. Осторожно удалите жировую ткань вокруг ножки.
5. Чтобы вызвать ишемию, поместите сосудистый зажим над почечной артерией и веной, присутствующими в почечной ножке, избегая зажима соседнего мочеточника. Используйте гемостат Halsted-Mosquito для манипулирования сосудистым зажимом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ишемия подтверждается визуализацией изменения цвета почек с красно-розового на темно-фиолетовый (рисунок 1В).
6. Накройте зажатую почку стерильной марлей, смоченной в физиологическом растворе, чтобы избежать высыхания, и оставьте ее на 30 минут.
7. Контролируйте глубину анестезии и влажность марли периодически в течение этого времени.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Индукционная доза анестезии достаточна для обеспечения анальгезии до конца ишемического события; следовательно, никаких дополнительных анестезирующих инъекций не требуется.
8. Незадолго до окончания периода ишемии удаляют марлю и вскрывают почку. Держите гемостат Halsted-Mosquito, готовый к снятию зажима.
9. На 30-й минуте откройте сосудистый зажим гемостатом и удалите его из почечной ножки, чтобы обеспечить реперфузию почки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Реперфузия подтверждается визуализацией изменения цвета почки с темно-фиолетового на красно-розовый (рисунок 1С).
10. Выполняйте те же процедуры, описанные выше для фиктивных животных без пережатия почечной ножки.
11. После проверки изменения цвета почки возвращают почку в брюшную полость. Закройте мышцы живота рассасывающимся швом 5-0 с помощью крестообразного рисунка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вторая инъекция анестетиков может потребоваться для поддержания анальгезии во время наложения швов на мышцы и кожу. Половина начальной дозы доказала свою эффективность в обеспечении анальгезии до завершения операции.
12. Закройте кожу рассасывающимся швом 5-0 с помощью горизонтального матраса. Очистите рану раствором повидона йода ватным тампоном.

3. Восстановление и послеоперационный период

ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку послеоперационное время является фактическим временем реперфузии, надлежащий послеоперационный уход является этически обязательным и научно значимым. Время реперфузии может быть выбрано в соответствии с требованиями исследователя. Время реперфузии 4 ч, 8 ч, 16 ч, 1 день, 2 дня, 4 дня и 7 дней сравнивают для получения последовательного обзора патологических изменений, вызванных почечной ИРИ.

1. Держите мышь на грелке, пока она не начнет восстанавливаться после анестезии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется подождать, пока мышь не начнет двигать ногами и не попытается передвигаться. В случаях, когда во время операции требуются дополнительные инъекции анестетика, время восстановления дольше. Атипамезол, антагонист альфа-2-рецепторов, можно вводить в дозе 0,5 мг/кг массы тела внутрибрюшинно, чтобы обратить вспять эффекты ксилазина и сократить фазу восстановления. Для лечения боли бупренорфин (0,1 мг/кг массы тела, внутрибрюшинно) вводят до операции и каждые 6 часов во время восстановительной и послеоперационной фазы. Использование нестероидных противовоспалительных препаратов не рекомендуется, так как несколько препаратов в этом семействе вызывают нефротоксичность и, следовательно, могут изменить результаты.
2. После восстановления после анестезии поместите мышь обратно в клетку со свободным доступом к воде и пище.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пюре может быть предоставлено в чашке Петри, а также в качестве материала для укрытия и игры (например, бумажные листы, бумажные трубки для полотенец).
3. Ежедневно контролируйте мышь, чтобы оценить заживление ран, потребление пищи и воды, массу тела и поведение.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Состояние заживления ран оценивали по следующей шкале: 1, сухой; 2, мокрый; 3, частично открыт; 4, открыт. Быстрое заживление ран было задокументировано в этом исследовании, причем более 90% сухих ран после 2-го дня.

4. Эвтаназия и отбор проб

1. Усыпляют мышей пентобарбиталом натрия, вводимым внутрибрюшинно в дозе, которая в два раза превышает дозу анестетика для мышей (100 мг/кг).
2. При необходимости соберите образцы жидкости и тканей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Были собраны обе почки, цельная кровь (для подсчета клеток крови), сыворотка (для биохимии крови), моча, сердце и легкие. Для биохимического анализа крови необходимо несколько микролитров сыворотки (азот мочевины крови (BUN), креатинин, электролиты). При необходимости за 24 ч до эвтаназии мышей можно поместить в метаболические клетки для сбора большего объема мочи, что позволяет определить параметры функции почек.

Результаты

Физиологические параметры
Мыши восстановились после этой односторонней почечной операции IRI без осложнений; оказался активным и бдительным; и показал нормальное питание, питье и поведение на следующий день. У некоторых мышей может быть потеря массы тела после IRI, хотя обычно она составляет менее 10% от первоначальной массы тела (рисунок 2). Большие потери массы тела (˃10%) могут быть вредными, и эти животные должны быть удалены из исследования. Мыши с фиктивной операцией не показали изменений массы тела после операции (измеренных через 24 ч после операции). Большинство мышей восстановили свою первоначальную массу тела между 4 и 7 днями после операции (см. 7-дневную группу IRI, рисунок 2). Функцию почек можно оценить с помощью традиционных маркеров, таких как азот мочевины крови (BUN) и креатинин. Кроме того, в анализ были включены уровни электролитов в сыворотке крови (натрий, калий и хлорид) и автоматический дифференциальный анализ крови.

Гистопатологические изменения
Оценка гистопатологических результатов проводилась с использованием 4% параформальдегид-фиксированных, парафиновых встроенных целых средних сагиттальных участков почки, окрашенных гематоксилином / эозином (HE), периодической кислотой Шиффа и трихромными пятнами Массона. Наиболее очевидные изменения, вызванные этой односторонней почечной моделью IRI, можно увидеть в кортико-медуллярном соединении, особенно в проксимальных канальцах, толстых восходящих конечностях петли Генле и дистальных извитых канальцах, а также в трубчатом интерстиции (см. легенду для рисунка 3). Микроскопические изображения, показывающие наиболее характерные поражения после IRI в почках, можно увидеть на рисунке 3. Список последовательных гистопатологических результатов приведен в таблице 1.

Была разработана трубчатая система оценки травм для классификации повреждений с течением времени (рисунок 4). При этом пять определенных изменений были оценены тремя различными оценщиками: 1) затухание канальцевого эпителия; 2) потеря каймы щетки; 3) канальцевый некроз; 4) обструкция просвета; и 5) наличие белкового гипса. Присвоение "1" указывает, что изменение присутствует, "0" - что оно отсутствует.

Рисунок 1: Экспериментальная почечная модель IRI у мышей. (A) Показаны фазы экспериментов и вмешательств (индукция анестезии, ишемия и реперфузия). Обратите внимание на изменение цвета правой почки на темно-красный во время ишемии (В) на розовый во время реперфузии (С). (D) Макроскопический вид правой почки IRI (красная стрелка) по сравнению с контралатеральной не-IRI почкой того же животного через 24 ч после операции. Красная стрелка в (B) показывает положение гемостатического зажима. Аббревиатура: IRI = Ишемия-реперфузионная травма. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Масса тела мышей до и после почечной ИРИ. Показаны отдельные данные. Сокращения: IRI = Ишемия-реперфузионная травма; h = часы; d = дни. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Типичные микроскопические поражения, наблюдаемые в коре головного мозга и кортико-медуллярном соединении мышей, оперированных ИК- Показано фиктивное и различное время реперфузии (указано над каждым рисунком). (A) Неповрежденные структуры показаны в виде фикции (увеличение 40x; шкала = 20 мкм). Стрелки в ИРИ 4 ч указывают на наличие белкового отливка в трубчатом просвете (увеличение 40х; шкала бар = 20 мкм). Стрелки в IRI 8 ч показывают трубчатую дилатацию (увеличение 40x; шкала бар = 50 мкм). Черная стрелка в IRI 16 ч показывает трубчатый слепок в медуллярных сегментах; белыми стрелками показаны области клеточного некроза (увеличение 40x; шкала = 50 мкм). Черные стрелки в IRI 1 d указывают на трубчатую дилатацию (увеличение 10x; шкала = 100 мкм). Черная стрелка в IRI 2 d показывает увеличенные ядра клеток; белые наконечники стрел показывают области инфильтрации лимфоцитов и макрофагов (увеличение 40x; шкала бар = 50 мкм). Белые наконечники стрелок в IRI 4 d указывают на митотические трубчатые ячейки (увеличение 40x; шкала = 50 мкм). Черная стрелка в IRI 7 d показывает область очагового фиброза; белый наконечник стрелки показывает область регенерации (увеличение 20x; шкала = 100 мкм). (B) Окрашивание PAS, показывающее почечную кору мышей во время ранней реперфузии (4 ч, 8 ч и 16 ч). Обратите внимание на прогрессивное затухание границы кисти (стрелки). Увеличение 40x; шкала баров = 50 мкм (C) Массон трихромное окрашивание фиктивных и IRI 7 d мышей, показывающих области интерстициального фиброза (белые стрелки). Увеличение 40x; шкала стержней = 50 мкм. Сокращения: IRI = Ишемия-реперфузионная травма; Glo = клубочек; PCT = проксимальный извитый каналец; DCT = дистальный извитый каналец; CD = сборный воздуховод; PAS = периодическая кислота Schiff; d = день. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Оценка трубчатых повреждений мышей, управляемых sham- и IRI. Шкала системы подсчета баллов от 1 до 5 для затухания канальцевого эпителия; потеря границы щетки; канальцевый некроз; люминальная обструкция; и наличие белкового гипса. Присвоение "1" указывает, что изменение присутствует, "0" - что оно отсутствует. Показаны отдельные значения. Столбцы обозначают среднее ± SD (n = 4). Аббревиатура: IRI = Ишемия-реперфузионная травма. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Время после IRI	Наиболее значимые патологические изменения
4 ч	Трубчатая обструкция
	Белок, отлитый в просвете
8 ч	Трубчатая дилатация
	Начинающийся некроз
	Затухание эпителия
16 ч	Клеточный некроз
	Трубчатое литье
	Нейтрофильная инфильтрация
1 день	Некроз
	Трубчатая дилатация
	Нейтрофильная инфильтрация
2 дня	Трубчатая дилатация
	Инфильтрация лимфоцитов и макрофагов
	Увеличенные ядра клеток
4 дня	Заметная митотическая активность в клетках канальцев
7 дней	Очаговый фиброз
	Зоны регенерации

Таблица 1: Наиболее значительные патологические изменения с течением времени. Диагностируется на основании микроскопического исследования 4-6 животных в группе.

Обсуждение

Мышиные почечные модели IRI популярны в биомедицинских исследованиях из-за их относительно низких эксплуатационных расходов и наличия разнообразных трансгенных моделей¹². Представленная здесь односторонняя почечная модель IRI имитирует характерные патологические изменения, наблюдаемые в почечной ИРИ человека, такие как канальцевая дилатация, некроз и фиброз¹³. Эти результаты основаны на различном времени реперфузии.

Критические этапы этого протокола включают поддержание постоянной температуры тела и правильное размещение сосудистого зажима в почечной ножке. Температура тела влияет на метаболизм животного¹⁴, изменяя экспериментальные результаты как на физиологическом, так и на клеточном уровнях¹⁵. В этой модели температура тела стабилизировалась перед операцией с помощью ректальных и прокладочных датчиков. Кроме того, настоятельно рекомендуется постоянный мониторинг температуры тела в течение всей хирургической процедуры, особенно перед установкой сосудистого зажима, чтобы вызвать ишемию.

Воздействие на почку и правильное размещение сосудистого зажима также имеют решающее значение для успеха эксперимента. Повреждение почечной капсулы при неправильном обращении с щипцами во время воздействия на почку через хирургический разрез приведет к периренальному кровоизлиянию и воспалению. Сосудистый зажим должен быть размещен на почечной ножке, закупоривающей почечную артерию и почечную вену, не затрагивая мочеточник и надпочечниковые артерии. Критическим для этого этапа является тщательное рассечение жировой ткани, окружающей почечный хилум^14,16.

Эта модель экономична и эффективна по времени. Потребление анестетика на мышь составляло 156,47 ± 37,88 мкл (среднее ± SD, n = 17) предварительно разбавленного коктейля кетамин/ксилазин (1:10 кетамин, 1:50 ксилазин, в физиологическом растворе; концентрация исходного раствора, 100 мг/мл). Операция может быть выполнена за относительно короткий период. Общее время операции на мышь составило 53 ± 5,23 мин (среднее ± SD, n = 17). С обученным персоналом одновременно может быть выполнено несколько операций. В нашей группе один опытный исследователь выполнял операцию до тех пор, пока зажим не был освобожден от почечной ножки, в то время как второй взял на себя ответственность за закрытие раны до выздоровления мыши. При таком подходе мы смогли выполнить большое количество операций за один день. В этой модели мы использовали дорсолатеральный подход, который приводит к меньшей травматичности и снижению потерь жидкости и тепла из брюшной полости по сравнению со средним подходом¹⁶.

Ранее опубликованные протоколы описывали технику пережатия почечной ножки, чтобы вызвать острое повреждение почек у мышей 17,18,19. Однако в этих исследованиях контралатеральная нефрэктомия была выполнена в дополнение к односторонней ИРИ с ишемическим временем в диапазоне от 15 до 26 мин. В этом протоколе мы индуцировали одностороннюю ишемию в течение 30 мин при сохранении контралатеральной почки. Это привело к выживаемости 100%. Однако эта модель не подходит для индуцирования азотемического повреждения почек отчасти из-за компенсаторного эффекта, оказываемого нехирургически интерпретированной контралатеральной почкой. Тем не менее, сохранение одной почки незатронутой у одного и того же животного дает преимущество использования более длительного времени ишемии с более высокой выживаемостью. В дополнение к этому, контралатеральная почка может быть использована для оценки возможных побочных эффектов тестовых препаратов или методов лечения, применяемых во время экспериментальной процедуры, и для изучения эффектов перекрестных помех между почками и почками^20,21. Например, эта модель была полезна для демонстрации изменений, вызванных активными формами кислорода, на клеточном уровне как в IRI, так и в контралатеральной, нехирургической почке¹¹.

Эта модель имеет потенциальное применение в исследованиях, направленных на выявление и характеристику маркеров одностороннего повреждения почек, эффектов перекрестных контактов почек, пост-почечных гемодинамических изменений, индуцированных ИРИ, и потенциальных нефротоксических эффектов препаратов-кандидатов для использования в почечной ИРИ. Это подробное описание основных патологических изменений служит ценным инструментом для выбора наиболее подходящего времени для изучения конкретных клеточных процессов, от воспаления и некроза (от 4 ч до 2 дней) до регенерации (4 дня) и фиброза (7 дней и позже).

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Atipamezole hydrochloride	Penn Veterinary Supply, Inc., PA, USA	PVS8700	5 mg/mL
Buprenorphine	Penn Veterinary Supply, Inc., PA, USA	PRMBURPEN22	0.3 mg/mL
Commercial euthanasia solution	various suppliers	na	e.g., Euthasol Virbac (sodium pentobarbital 390 mg/mL + sodium phenytoin 50 mg/mL)
Eye ointment Puralube	Dechra Veterinary Products, KS, USA	na	3.5 g (1/8 oz)
Heating pad RightTempJr	Kent Scientific, CT, USA	RT-JR-20	Consider the one with two temperature probes
Ketamine hydrochloride	Penn Veterinary Supply, Inc., PA, USA	VED1220	100 mg/ml
S&T Vascular clamp	Fine Science Tools, Inc., Germany	00398-02	Jaw dimensions: 5.5 x 1.5 mm; length: 11 mm
Sterile Disposable Towel Drapes	Kent Scientific, CT, USA	SURGI-5023-3	Disposable, individualy packed
Surgical instruments (Graefe forceps, Halsted-Mosquito hemostat, scissors, etc)	Fine Science Tools, Inc., Germany	Various	Consider the extra fine straight scissor and the angled Graefe forceps
Vicryl suture	Ethicon US, LLC	J493G	Size 5-0
Xylazine hydrochloride	Penn Veterinary Supply, Inc., PA, USA	VAM4821	100 mg/mL