Oprode Array para modulação optogenética simultânea e gravação neural elétrica

Resumo

Aqui, apresentamos o método de fabricação de um sistema optrode com fibras ópticas para entrega de luz e uma matriz de eletrodos para gravação neural. Experimentos in vivo com camundongos transgênicos expressando channelrhodopsin-2 mostram a viabilidade do sistema para estimulação optogenética simultânea e gravação eletrofisiológica.

Resumo

Durante a última década, a optogenética tornou-se uma ferramenta essencial para a investigação da sinalização neural devido à sua capacidade única de modulação ou monitoramento neural seletivo. Como tipos específicos de células neuronais podem ser geneticamente modificados para expressar proteínas de opsina, a optogenética permite estimulação óptica ou inibição dos neurônios selecionados. Houve vários avanços tecnológicos no sistema óptico para optogenética. Recentemente, foi proposto combinar o guia óptico de ondas para entrega de luz com gravação eletrofisiológica para monitorar simultaneamente as respostas neurais à estimulação ou inibição optogenética. Neste estudo, foi desenvolvido um conjunto de optrode implantável (fibras ópticas 2x2) com eletrodos multicanais incorporados.

Um diodo emissor de luz (LED) foi empregado como fonte de luz, e uma matriz de microluvas microfrágico foi integrada para fornecer energia de luz suficiente na ponta das fibras ópticas. O sistema de matriz optrode compreende a parte descartável e a parte reutilizável. A peça descartável possui fibras ópticas e eletrodos, enquanto a parte reutilizável possui o LED e circuitos eletrônicos para controle de luz e processamento de sinal neural. O novo desenho do sistema de matriz optrode implantável é introduzido no vídeo que acompanha, além do procedimento da cirurgia de implantação de optrode, estimulação de luz optogenética e gravação neural eletrofisiológica. Os resultados de experimentos in vivo mostraram com sucesso picos neurais bloqueados pelo tempo evocados pelos estímulos de luz dos neurônios excitatórios hipocampais de camundongos.

Introdução

Gravar e controlar a atividade neural é essencial para entender como o cérebro funciona em uma rede neural e em níveis celulares. Os métodos convencionais de gravação eletrofisiológica incluem o grampo^de remendo 1,2,3,4 utilizando um micropipette e gravação extracelular usando eletrodos microneurais 5,6,7,8. Como método de neuromodulação, a estimulação elétrica tem sido frequentemente usada para estimular diretamente uma região cerebral focal através da despolarização direta ou indireta das células neuronais. No entanto, o método elétrico não pode distinguir tipos de células neuronais para gravação ou estimulação porque as correntes elétricas se espalham em todas as direções.

Como tecnologia emergente, a optogenética iniciou uma nova era na compreensão de como funciona o sistema nervoso 9,10,11,12,13,14,15,16. A essência das técnicas optogenéticas é usar a luz para controlar a atividade de proteínas de opsina sensíveis à luz expressas por células geneticamente modificadas. Assim, a optogenética permite a modulação ou monitoramento sofisticado de células geneticamente selecionadas em circuitos neurais complicados^14,17. O uso mais amplo da abordagem optogenética exigiu registro neural simultâneo para confirmar diretamente a neuromodulação óptica. Portanto, um dispositivo integrado com funções de controle de luz e gravação seria extremamente valioso 16,18,19,20,21,22,23,24,25.

Há limitações da estimulação optogenética convencional baseada em laser, que requer um sistema de entrega de luz volumoso e caro 26,27,28,29,30. Portanto, alguns grupos de pesquisa utilizaram sondas de silício baseadas em μLED para minimizar o tamanho do sistema de entrega de luz 31,32,33,34. No entanto, há risco de danos cerebrais térmicos causados pelo contato direto com μLEDs devido à baixa eficiência de conversão de energia dos LEDs. Guias de ondas leves, como fibras ópticas, SU-8 e oxírio de silício (SiON), foram aplicados para evitar danos térmicos 30,35,36,37,38,39. No entanto, essa estratégia também tem uma desvantagem devido à sua baixa eficiência de acoplamento entre fontes de luz e os guias de onda.

O conjunto de microlens foi introduzido anteriormente para aumentar a eficiência de acoplamento de luz entre LEDs e fibras ópticas⁴⁰. Um sistema optrode foi desenvolvido com base em tecnologias de sistemas microeletromecânicos (MEMS) para estimulação óptica e gravação elétrica em uma microescala⁴⁰. O conjunto de microlens entre um LED e fibras ópticas aumentou a eficiência da luz em 3,13 dB. Como mostrado na Figura 1, uma matriz de fibra óptica 2x2 está alinhada na matriz de microlens 4x4, e o LED está posicionado abaixo da matriz de microlens. As fibras ópticas 2x2 são montadas em vez de 4x4 para reduzir os danos cerebrais. Uma matriz de eletrodo de tungstênio é posicionada adjacente à matriz optrode usando silício através de orifícios para gravação eletrofisiológica (Figura 1B).

O sistema consiste em uma peça descartável superior e partes inferiores destacáveis. A parte descartável superior, que inclui o conjunto de fibra óptica, a matriz de microlens e a matriz de eletrodo de tungstênio, foi projetada para ser permanentemente implantada no cérebro para experimentos in vivo . A parte inferior inclui uma fonte de luz LED e uma linha de alimentação externa, que é facilmente removível e reutilizável para outro experimento animal. Uma tampa de plástico anexável protege a parte descartável quando a parte destacável é removida.

A viabilidade do sistema é verificada pela implantação nos cérebros de camundongos transgênicos que expressam channelrhodopsin-2 (ChR2) em Neurônios kinase II-positivos de proteína dependente de Ca²⁺/calmodulin (CaMKIIα::ChR2 mouse). Os eletrodos de gravação foram utilizados para registrar as atividades neurais de neurônios individuais durante a estimulação óptica dos neurônios.

Protocolo

Os procedimentos cirúrgicos e de cuidados com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Mulher de Ewha (nº 20-029).

1. Preparação de uma matriz optrode (Figura 1 e Figura 2)

1. Conecte fibras ópticas com a matriz de microlens.
   1. Remova o revestimento de passivação da fibra óptica e corte-a em pedaços de 5 mm de comprimento usando um cutelo de fibra óptica de precisão.
   2. Mergulhe a fibra óptica na resina UV clara e coloque as fibras ópticas na matriz de microlens.
   3. Cure a resina usando uma lâmpada UV.
   4. Conecte a matriz de microlens à carcaça impressa 3D usando epóxi.
2. Alinhe os fios de tungstênio revestidos de perfluoroalkoxy (PFA).
   1. Soldar as 4 peças de fios de tungstênio PFA de 30 mm de comprimento e 1 fio de prata para o conector feminino de 5 pinos e 1,27 mm de arremesso. Use fio prateado como um eletrodo de referência.
   2. Conecte o conector feminino de 1,27 mm ao pré-amplificador do palco.
   3. Coloque cuidadosamente fios de tungstênio através do silício através dos orifícios (Figura 1B) para ajudar o alinhamento fino dos eletrodos de tungstênio.
   4. Corte os fios de tungstênio alinhados 1 mm mais curto que o comprimento da fibra óptica.
   5. Conecte o conector à carcaça impressa 3D usando epóxi.
3. Colocação de LED
   1. Coloque o LED na carcaça impressa 3D.
   2. Conecte o LED ao circuito de condução que gera modulação da largura de pulso (PWM).
      NOTA: O pulso PWM é gerado pelo microcontrolador.
   3. Dado o ruído induzido pelo circuito de condução led, certifique-se de que os eletrodos de gravação estão a 50 mm de distância do circuito de condução led.
   4. Meça a intensidade da luz no final da ponta de fibra óptica usando um fotodiodo.
4. Mergulhe os eletrodos de tungstênio e fibras ópticas em álcool por 15 minutos. Em seguida, mergulhe o sistema em água d.I estéril e esterilize com gás óxido de etileno.

2. Cirurgia de implantação (Figura 3 e Figura 4)

NOTA: A técnica estéril deve ser seguida durante a cirurgia.

1. Prepare os animais transgênicos, que são geneticamente modificados para expressar proteínas de opsina sensíveis à luz no tipo específico de células neuronais.
   NOTA: Um camundongo macho, de 2 meses, que expressa canalrhodopsin-2 (ChR2) em Ca²⁺/calmodulin-dependent protein kinase II-positive neurônios (CaMKIIα::ChR2 mouse) foi utilizado neste estudo⁴¹.
2. Anestesiar o rato com um coquetel de cetamina-xylazine- uma mistura de cetamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg)-por administração intraperitoneal.
   1. Verifique o animal anestesiado a cada 30 minutos monitorando o movimento do bigode e a reação ao aperto da pata.
   2. Injete o coquetel de cetamina-xilazina em metade da dose inicial se for necessária anestesia adicional.
3. Raspe a pele da cabeça e coloque o rato anestesiado na moldura estereotática.
   NOTA: Realize a preparação cirúrgica da pele e o animal de cortina. A preparação da pele envolve depilação seguida de limpeza da pele com agentes antimicrobianos.
   1. Posicione a cabeça dentro do quadro estereotático e insira barras de ouvido no meatus.
   2. Centralizar a cabeça do mouse no quadro estereotático afrouxando e apertando repetidamente as barras de ouvido para posicionamento exato.
   3. Coloque a barra incisivo para que os incisivos superiores engancharem sobre a borda interna dianteira.
   4. Ajuste a barra incisora para definir a altura da barra incisora e aperte o grampo do nariz contra o focinho.
   5. Ligue a almofada de aquecimento térmico embutida no quadro estereotático com antecedência para manter a temperatura corporal a 37 °C durante os procedimentos cirúrgicos.
   6. Coloque a sonda térmica no reto do mouse para regulação homeotérmica.
      NOTA: A colocação da barra de ouvido deve ser verificada agarrando suavemente e balançando o focinho. A barra de ouvido deve ser reajustada se o focinho puder ser movido mais de ~4 mm lateralmente.
4. Cubra os olhos com geleia de petróleo (veja a Tabela de Materiais) para evitar o ressecamento.
5. Injete 1% de lidocaína no couro cabeludo. Levante a pele da cabeça com fórceps, proteja um espaço de injeção e injete a lidocaína sob o couro cabeludo.
6. Realize uma incisão sagital usando um bisturi e uma tesoura fina. Segure a pele incisada com um microclamp para ampliar a visibilidade da área cirúrgica.
   NOTA: O comprimento da incisão é de <1 cm acima da borda bregma e caudal do osso interparietal.
7. Remova o periosteum usando cotonetes de algodão. Se houver sangramento, cauterize o crânio usando um bovie para selar os vasos sanguíneos.
8. Limpe o crânio com soro fisiológico e marque os sítios de craniotomia usando um braço manipulador: hipocampo Anterior-Posterior (AP) −1,8 a −2,8 mm, Medial-Lateral (ML) 0,5-2,5 mm e Dorsal-Ventral (DV) −1 a −2 mm.
   NOTA: Considerando a espessura do crânio do rato, insira a matriz optrode -1,2 a -2,2 mm da área cerebral exposta. Dada a via hipocampal, células piramidas de CA3 enviam seus axônios para CA1. Portanto, as fibras ópticas são 1 mm mais longas que a gravação de eletrodos, de modo que as fibras ópticas são colocadas em CA3 e os eletrodos de gravação em CA1.
9. Faça um furo acima do cerebelo e insira um parafuso para o chão. Coloque o parafuso moído 0,5 mm de profundidade com um parafuso de precisão até atingir a parte superior do cerebelo.
   NOTA: Certifique-se de uma inserção apertada do parafuso, que será usado como um eletrodo moído e uma estrutura de suporte para maximizar a estabilidade a longo prazo da implantação, pois aumenta a superfície tridimensional para a adesão do cimento dental.
10. Perfurar a área marcada e remover um pedaço do crânio com fórceps.
11. Dobre uma ponta de agulha de 26 G no sentido horário 120°, e exponha a área cerebral inserindo o lado bevel da agulha virada para cima. Tenha cuidado para não danificar o cérebro e os vasos sanguíneos.
12. Limpe o cérebro exposto com soro fisiológico para lavar o pó ósseo e matéria íntenua.
13. Fixar a matriz optrode no braço manipulador e mover-se perto da área exposta.
    NOTA: Ao colocar o dispositivo, recalcular novamente a área alvo do bregma pode aumentar a precisão da colocação.
14. Insira lentamente a matriz optrode e conecte o parafuso moído ao fio de prata ligado ao sistema⁴².
    NOTA: Neste processo, a matriz deve ser firmemente fixada ao braço manipulador para minimizar a oscilação para evitar danos cerebrais de microsoção durante a inserção. A inserção deve ser realizada lentamente, com descanso de 10 minutos para explicar o inchaço do cérebro que pode ter sido pressionado após a inserção. A velocidade de inserção abaixo de 1 μm/s no tecido cerebral é recomendada para a alta qualidade da relação sinal-ruído e o número de unidades únicas separáveis⁴².
15. Se houver sangramento, aplique pressão direta aos sangradores com um cotonete seco ou use cautery. Não passe para os próximos passos até que o sangramento esteja completamente parado.
16. Insira espuma de gel entre o cérebro exposto e o dispositivo para proteger os produtos químicos do contato direto com o cérebro.
    NOTA: A espuma de gel também ajuda a hemostasia e mantém o cérebro úmido.
17. Limpe o crânio com cotonetes para remover a umidade o máximo possível, e prossiga para a próxima etapa de fixação.
18. Aplique cuidadosamente cimento dentário no crânio para fixar o dispositivo e cobrir a espuma de gel. Antes que o cimento dentário seja completamente endurecido, separe o couro cabeludo se estiver preso ao cimento dental. Puxe a pele incisada com fórceps para cobrir o cimento dentário endurecido e suturar o couro cabeludo. Em seguida, solte o dispositivo do braço manipulador.
    NOTA: Certifique-se de que o cimento dental não gruda na pele e cobre apenas a região do crânio. Quando a pele cresce, pode afastar o cimento e, eventualmente, o dispositivo cairá. Isso causará um problema crítico para experimentos in vivo de longo prazo.

3. Cuidados com recuperação e implante

1. Tire o mouse do quadro estereotático.
2. Administre a solução Carprofen usando uma agulha de 26 G. Injete uma vez antes da cirurgia e 12h (na manhã seguinte em caso de cirurgia à tarde) e 24h após a cirurgia para reduzir a dor.
   NOTA: A concentração da droga na garrafa é de 50 mg/mL, e é armazenada a 4 °C. Carprofeno é viscoso e precisa ser diluído em água estéril 1:10. Se a esterilidade for mantida, a solução pode ser armazenada por até 4 semanas. Para manter a duração efetiva da droga, injete a solução Carprofen em intervalos de 12h.
3. Coloque o mouse na almofada de aquecimento e verifique se ele se recupera bem da anestesia.
   NOTA: O animal não fica sozinho até recuperar a consciência suficiente.
4. Remova os fios de sutura 7 a 10 dias após a cirurgia.
5. Deixe o animal se recuperar por 1 semana. Monitore a ingestão de alimentos e água durante o tempo de recuperação. Administre o analgésico e verifique os sinais de desconforto ou dor.
   NOTA: Os animais submetidos à cirurgia não podem ficar com os outros animais até que se recuperem totalmente.
   1. Durante o período de recuperação, pese o mouse todos os dias para verificar se há mudanças de peso. Sacrifique o camundongo (ver seção 6) se houver perda de peso de 20% em comparação com animais de controle de idade e sexo.

4. Estimulação optogenética e gravação eletrofisiológica

1. Anestesiar o mouse e colocar o mouse anestesiado na moldura estereotática.
2. Configure os parâmetros de estimulação.
   1. Coloque a receita de pulso de luz em 4% de ciclo de imposto e frequência de 10 Hz⁴³. Configure a estimulação da luz para 2 s (20 pulsos) durante a gravação neural.
   2. Use uma corrente de 50 mA para conduzir 3 mW/mm² intensidade de luz na ponta da fibra óptica. Meça a energia da luz usando um fotodiodo e um medidor de energia e divida a energia da luz pela área de faceta de fibra óptica.
3. Tire a tampa plástica e conecte a parte superior contendo o sistema de entrega de luz com o LED reutilizável e circuitos.
4. Conecte o preamplificador do palco ao conector de 5 pinos implantado.
5. Abra o software para gravar sinais neurais.
6. Configure os filtros de software. Use um filtro bandpass a 0,1-20 kHz e um filtro de entalhe a 60 Hz. Defina a taxa de amostragem do amplificador para 20 kHz.
7. Antes da gravação, verifique se os sinais de espigão neural são detectados.
   NOTA: O cancelamento de ruído é importante porque os sinais neurais são muito pequenos. Se o nível de ruído for muito alto, sinais neurais podem ser obscurecidos pelo ruído e se tornar invisíveis. Use aterramento adequado e blindagem de ondas eletromagnéticas para reduzir o ruído.
8. Após a verificação do sinal, grave sinais neurais sem estimulação de luz para gravação da linha de base.
9. Fornecer luz LED e registrar simultaneamente respostas neuronais (Figura 5 e Figura 6).
   NOTA: Uma vez estimulado, o próximo experimento de estimulação deve ser realizado após um intervalo de pelo menos 5 minutos para que a atividade neuronal evocada pela estimulação anterior não afete o próximo experimento.

5. Análise de dados

1. Carregue os dados adquiridos usando o programa MATLAB.
2. Obtenha atividades neurais únicas usando um algoritmo de classificação de picos "Wave-Clus"^44,45. Detecte os picos em cada canal por um limiar de amplitude como em Eq (1)⁴⁵.
   Limiar = 5 × mediana (1)
   Onde x está o sinal filtrado do bandpass.
   1. Para instalar "Wave-Clus", consulte o link de download na Tabela de Materiais.
   2. Para abrir a interface gráfica do usuário (GUI), digite wave_clus no prompt de comando do MATLAB.
   3. Digite Get_spikes ('filename.ext') função para extensão de arquivo preparada para detecção de pico. Em seguida, execute Do_clustering ('filename_spikes.mat') para a classificação de picos.
3. Conte os picos classificados antes, durante e depois da estimulação da luz com caixas de tempo específicas. Use caixas de tempo de 0,2 s e 2 s para análise.
4. Plote o número de picos de cada canal de gravação.
   NOTA: Média com erro padrão dos meios (SEM) dos dados dos resultados de 8 experimentos repetidos foi calculada e plotada.

6. Eutanásia

1. Depois de todos os experimentos, sacrifique o rato por inalação de dióxido de carbono (CO₂).
2. Sem precarregar a câmara, coloque o mouse na câmara transparente de eutanásia, sem fornecimento de CO₂ e/ou vazamentos.
3. Ligue o gás CO₂ e desloque o ar a uma taxa de 30 a 50% do volume de ar da câmara de eutanásia por minuto.
   NOTA: Um medidor de fluxo deve ser conectado ao cilindro de gás CO₂ para garantir que a taxa de deslocamento do ar seja de 30-50% do volume da câmara de eutanásia por minuto.
4. Monitore o rato sacrificado por falta de respiração e mude a cor dos olhos.
   NOTA: O tempo esperado para eutanásia é geralmente de 10 a 15 minutos.
5. Depois de observar os sinais de morte, remova o rato da câmara de eutanásia.
6. Para completar o procedimento de eutanásia, verifique a morte confirmando parada respiratória e cardíaca.

Resultados

O sistema optrode é fabricado com sucesso para fornecer energia de luz suficiente para ativar os neurônios alvo. O fino alinhamento dos eletrodos de tungstênio é alcançado através do silício microfrágico através dos orifícios. A intensidade da luz medida é de 3,6 mW/mm² na ponta da fibra óptica quando a corrente de 50 mA é aplicada. Os microlens aumentaram a eficiência da luz em 3,13 dB. Devido à matriz de microlens, que melhora o acoplamento de luz, a corrente aplicada é aproximadamente metade...

Discussão

Verificou-se a viabilidade do sistema para estimulação optogenética simultânea e registro eletrofisiológico (Figura 6). Os grandes picos durante a estimulação da luz são artefatos fotoelétricos que ocorrem ao mesmo tempo que a estimulação da luz (Figura 6A). Isso é claro na visão ampliada da forma de onda no retângulo tracejado vermelho (Figura 6A). Como mostrado na Figura 6A, os artefatos...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-pin Connector	NW3	HD127K	1.27 mm (.050") pitch
Bovie	Fine Science Tools(F.S.T)	18010-00	High Temperature Cautery Kit
Data Acquisition Software	Intan Technologies, LLC	USB Interface Board software	Work with the RHD USB Interface Board
Dental Cement	Lang Dental Manufacturing Company, Inc.	1223CLR	Use Jet Liquid and powder in jet denture repair package
Digital Manipulator Arm	Stoelting Co.	51904/51906	Left, Right each Digital Manipulator Arm, 3-Axes, Add-On
Gel Foam	Cutanplast	Standard (70*50*10 mm)	Sterile re-absorbable gelatin sponge with a haemostatic effect
Headstage Preamplifier	Intan Technologies, LLC	#C3314	RHD 16-Channel Recording Headstages
Heating Pad	Stoelting Co.	53800R	Stoelting Rodent Warmer X1 with Rat Heating Pad
LED	OSLON	GB CS8PM1.13	λ typ. 470 nm, Viewing angle 80 °, Forward voltage 2.85 V
MATLAB	MathWorks, Inc.	R2019a
Micro Clamp	SURGIWAY	12-1002-04	Straight type, Serre-fine DIEFFENBACH droite 3.5 cm
Optical Fiber	Thorlabs, Inc.	FT200UMT	0.39 NA, Ø 200 µm Core Multimode Optical Fiber, High OH for 300 - 1200 nm
PFA-Coated Tungsten Wire	A-M System	Custom ordered	Rod type, Ø 101.6 μm (.004")
Photodiode	Thorlabs	S121C
power meter	Thorlabs Inc.	PM100D
Precision cleaver	FITEL	S326	Fiber slicer tool
Prism	GraphPad	5.01 version
Scalpel	Feather™	#20	Scalpel blade with 100mm long Scalpel Handle
screw	Nasa Korea	stainless steel	diameter: 1.2 mm, length: 3 mm
Silver Wire	The Nilaco Corporation	AG-401265	Ø 200 µm
Stereotaxic Fxrame	Stoelting Co.	51500D	Digital new standard stereotaxic, rat and mouse
suture	ETHICON	W9106	suture size: 4-0, length:75 cm, wire diameter: 4-0
Vaseline	Unilever PLC	Original	100% pure petroleum jelly
Wave_Clus	N/A	N/A	https://github.com/csn-le/wave_clus