Padronização e Manutenção de Culturas Hepáticas Caninas 3D e Organoides Intestinais para Uso em Pesquisa Biomédica

Resumo

Métodos experimentais para colher células-tronco adultas de tecidos intestinais e hepáticos caninos para estabelecer culturas organoides 3D são descritos. Além disso, são discutidas as técnicas laboratoriais para garantir um crescimento consistente e fornecer procedimentos operacionais padrão para a colheita, biobanco e reviver culturas organoides caninas e hepáticas.

Resumo

Os cães desenvolvem doenças multifatoriais complexas análogas aos seres humanos, incluindo doenças inflamatórias, doenças metabólicas e câncer. Portanto, representam modelos animais de grande porte relevantes com potencial translacional para a medicina humana. Organoides são estruturas tridimensionais (3D), auto-montadas derivadas de células-tronco que imitam a micronatomia e a fisiologia de seu órgão de origem. Esses modelos in vitro translacionais podem ser usados para aplicações de permeabilidade e descoberta de medicamentos, avaliação toxicológica e para fornecer uma compreensão mecanicista da fisiopatologia de doenças crônicas multifatoriais. Além disso, os organoides caninos podem melhorar a vida dos cães companheiros, fornecendo insumos em diversas áreas de pesquisa veterinária e facilitando aplicações de tratamento personalizadas na medicina veterinária. Um pequeno grupo de doadores pode criar um biobanco de amostras organoides, reduzindo a necessidade de colheita contínua de tecidos, já que as linhas celulares organoides podem ser subculturadas indefinidamente. Aqui, são apresentados três protocolos que se concentram na cultura de organoides caninos intestinais e hepáticos derivados de células-tronco adultas. O Protocolo de Isolamento Organoide Canino descreve métodos para processar tecido e incorporar o isolado celular em uma matriz de suporte (matriz de membrana extracelular solubilizada). O Protocolo de Manutenção Organoide Canina descreve o crescimento e a manutenção organoides, incluindo limpeza e passagem, juntamente com o tempo adequado para expansão. O Protocolo de Colheita e Biobanco Organoide descreve maneiras de extrair, congelar e preservar organoides para análise posterior.

Introdução

Os roedores são o modelo animal mais utilizado para pesquisas biomédicas e ^{translacionais1}. São excepcionalmente úteis para investigar a patogênese molecular básica das doenças, embora sua relevância clínica para doenças multifatoriais crônicas tenha sido recentemente ^questionada2. O modelo canino apresenta diversas vantagens em relação aos ^roedores3,4. Cães e humanos compartilham semelhanças em metabolômica e microbioma intestinal que se desenvolveram devido ao consumo da dieta humana ao longo de vários períodos de sua domesticação5,6,7. Semelhanças entre anatomia gastrointestinal canina e humana e a fisiologia é outro dos ^exemplos8.

Além disso, os cães geralmente compartilham ambientes e estilos de vida semelhantes com seus ^donos9. A vida útil mais longa dos cães em comparação com os roedores permite o desenvolvimento natural de inúmeras condições ^crônicas10. Doença inflamatória intestinal ou síndrome metabólica são exemplos de doenças crônicas multifatoriais que compartilham semelhanças importantes entre humanos e ^cães11,12. Ensaios pré-clínicos caninos que envolvem cães com doenças de ocorrência natural podem gerar dados mais confiáveis do que os obtidos com modelos de ^roedores13. No entanto, para minimizar o uso de pesquisas em animais vivos e cumprir os princípios dos 3Rs (Reduzir, Refinar, Substituir)¹⁴, surgiram alternativas aos testes in vivo utilizando organoides caninos in vitro 3D em ^3D.

Organoides são estruturas auto-montadas derivadas de células-tronco 3D que recapitulam a fisiologia e a microanato de seus órgãos ^{originais16,17}. Esta tecnologia foi descrita pela primeira vez por Sato et al. em 200917 e permitiu estudos in vitro mais traduzíveis em linhas de células epiteliais do que antes eram possíveis usando culturas de células cancerígenas 2D18,19,20. Organoides são modelos in vitro úteis em muitas disciplinas biomédicas, como em toxicológicos pré-clínicos21,22,23, estudos de absorção ou metabolismo24,25,26,27,28, bem como em abordagens médicas personalizadas29,30,31 . A cultura bem sucedida dos organoides intestinais caninos foi descrita pela primeira vez em ²⁰¹⁹¹², enquanto organoides hepáticos derivados de um cão foram relatados pela primeira vez por Nantasanti et al. em 201532. Desde então, os organoides caninos têm sido usados com sucesso em estudos que investigam enteropatias crônicas caninas, tumores estromal gastrointestinais, adenocarcinoma ^colorretal12 e Doença de ^Wilson33,34.

Embora as células-tronco adultas possam ser colhidas através de necropsias, a tecnologia organoide nem sempre requer sacrifício dos animais. Biópsias endoscópicas e laparoscópicas, ou mesmo aspiradores de agulha fina de ^órgãos35, são uma fonte viável de células-tronco adultas para isolamento organoide ^epitelial12. O uso generalizado dessas técnicas não invasivas na prática veterinária facilita opções de pesquisa translacional reversa (tradução de informações da prática clínica veterinária à prática clínica humana e vice-versa)¹⁵. Um avanço adicional da tecnologia organoide pode ser assegurado pela padronização da cultura organoide e métodos de manutenção. O protocolo organoide aqui apresentado é parcialmente baseado em trabalhos publicados anteriormente de Saxena et al. de ²⁰¹⁵³⁶, e os métodos foram adaptados para se adequarem a especificidades da cultura organoide intestinal canina e hepática. O fluxo de trabalho global dos protocolos organoides caninos é retratado na Figura 1.

O Protocolo de Isolamento Organoide Canino introduz métodos de obtenção de amostras de biópsias endoscópicas, laparoscópicas e cirúrgicas, além de necropsias. Descreve o pré-tratamento inicial de amostras de tecido e metodologias utilizadas para o transporte para o laboratório. Materiais e reagentes necessários para o isolamento organoide são resumidos na seção "Preparação para o Isolamento". O processo de isolamento de células-tronco adultas a partir de amostras de tecido é descrito em detalhes. Finalmente, discute-se o processo de emplacamento de organoides em estruturas semelhantes a cúpulas usando uma matriz de membrana extracelular solubilizada.

O segundo protocolo, Protocolo de Manutenção Organoide Canina, descreve métodos de documentação e cultivo de organoides. Mudanças na mídia e sua frequência são discutidas nesta seção. Além disso, são descritos os procedimentos laboratoriais como a passagem e limpeza das culturas celulares, essenciais para garantir a manutenção bem sucedida dos organoides caninos 3D. A aprovação adequada é uma etapa crítica do protocolo, e possíveis ajustes e solução de problemas desta etapa são discutidos mais adiante no manuscrito.

O último protocolo é o Protocolo de Colheita organoide canina e biobanco contendo métodos para preparar organoides adultos para incorporação de parafina e preservação do RNA. Métodos de biobancos amostras organoides no armazenamento de nitrogênio líquido também são descritos aqui. Finalmente, são discutidas as formas de descongelar amostras congeladas e apoiar seu crescimento.

Em conclusão, este artigo tem como objetivo fornecer procedimentos consistentes de cultura organoide canina através da padronização de protocolos intersetórios. Ao fazê-lo, o manuscrito visa facilitar a reprodutibilidade de dados derivados de modelos organoides caninos para aumentar sua relevância na pesquisa biomédica translacional.

Figura 1: Fluxo de trabalho de protocolos organoides caninos. O Protocolo de Isolamento Organoide Canino descreve a preparação dos materiais necessários para o isolamento organoide, a colheita de uma amostra de tecido (por meio de necropsias, biópsias endoscópicas, laparoscópicas e cirúrgicas) e orientação sobre dissociação celular e revestimento da população celular. O Protocolo canino de Manutenção Organoide discute a limpeza e a passagem da cultura organoide. O Protocolo de Colheita e Biobanco Organoide discute a elaboração de amostras organoides para incorporação de parafina e caracterização organoide. Métodos para biobancar culturas organoides e revivê-las do armazenamento em nitrogênio líquido também são discutidos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

A pesquisa foi aprovada e realizada em conformidade com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Estadual de Iowa (IACUC-19-337; IACUC-18-065; IACUC-19-017).

NOTA: A seguinte seção (etapas 1-3) descreve o Protocolo de Isolamento Organoide Canino.

1. Preparação para o isolamento

1. Tubos de transporte: Antes do isolamento organoide (tipicamente 24 h antes), encha um tubo cônico de 50 mL com 10 mL de Mistura Desmoda de Dulbecco De Biodésola/Nutriente f-12 (DMEM/F12 Avançado) enriquecido com 0,2 mL de Estreptococo da Caneta.
2. Para biópsias laparoscópicas, incisionais ou excisionais, prepare três tubos cônicos adicionais de 50 mL. Encha estes tubos com 10 mL de solução completa de quelação (1x CCS; consulte Tabela 1).
   NOTA: Para a etapa 1.2, 2 mM N-Acetylcysteine (NAC) em Salina Tampão de Fosfato (PBS) também pode ser usada como uma solução tradicional usada para a colheita de células-tronco. Não foram observadas diferenças ao utilizar 1x CCS ou NAC em PBS. Ambas as soluções são adicionadas para liberar células na solução.
3. Mantenha os tubos a 4 °C durante a noite e transporte os tubos no gelo pelo restante do protocolo.
4. Prepare cinco tubos de centrífugas de 15 mL com 5 mL de CCS 1x, um tubo de centrífuga de 15 mL com 3 mL de 1x CCS, um tubo vazio de centrífugas de 15 mL (tubo supernanatante) e um tubo centrífuga de 15 mL com 5 mL de CCS 1x e 2 mL de soro bovino fetal (FBS).
   NOTA: O acima pode ser preparado antes do dia do isolamento se várias amostras forem processadas. Para ilustração, consulte o layout do tubo de isolamento na Figura 2.
5. No dia do isolamento, prepare uma placa de Petri, bisturi, balde de gelo e DMEM/F12 avançado frio no armário de biossegurança. Coloque o número necessário de placas de cultura celular de 24 poços na incubadora (37 °C; 5% atmosfera de _CO2 ) para pré-aquecer.
6. Coloque a matriz de membrana extracelular solubilizada (ECM; veja Tabela de Materiais) no gelo para começar a descongelar.
   NOTA: A submersão no gelo protege contra o degelo rápido e ajuda a evitar a solidificação. Uma caixa de pontas de pipeta pode ser colocada no congelador para auxiliar no revestimento do ECM solubilizado.
7. Prechill uma centrífuga a 4 °C.
8. Mova a mídia completa com fatores de crescimento "CMGF+" ou "mídia organoide" (ver Tabela 1 para composição) do congelador/geladeira para um banho de água de 37 °C. Evite exposição direta à luz quando possível.

Figura 2: Layout do tubo de isolamento. A configuração recomendada para a colheita de tecidos inclui 10 mL de DMEM/F12 avançado e 0,2 mL de Pen Strep em um tubo de centrífuga de 50 mL. Além disso, são necessários três tubos de 50 mL preenchidos com 10 mL de CCS 1x para biópsias cirúrgicas ou necropsias. O layout recomendado do tubo para etapas de isolamento inclui cinco tubos contendo 5 mL de 1x CCS para serem usados durante as etapas de lavagem do CCS. O primeiro tubo é usado como um tubo amostral contendo o tecido picado, e os tubos restantes servem como reservatórios de 1x CCS a serem adicionados ao primeiro tubo. O sexto tubo contém 3 mL de 1x CCS para lavar o tecido restante do tubo de amostra ao transferir para uma placa de 6 poços. Estes seis tubos serão utilizados antes da etapa de incubação edta. Um tubo com 5 mL de CCS 1x e 2 mL de FBS serve como tubo de amostra após a incubação de EDTA, e o supernascido deste tubo é transferido com células-tronco em um tubo vazio para o resto do isolamento. Mantenha os tubos a 4 °C antes de iniciar o isolamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Colheita de tecidos

1. Biópsias endoscópicas intestinais e laparoscópicas (diâmetro 2,8 mm) podem ser adquiridas usando biópsias grandes. Colher pelo menos oito amostras endoscópicas por sítio intestinal.
2. Colete amostras diretamente em tubos de transporte e coloque-as no gelo.
3. Para biópsias cirúrgicas e necropsias, colhe peças de tecido com tamanho de 0,5 cm x 0,5 cm e coloque-as no primeiro tubo 1x CCS.
   NOTA: Para biópsias intestinais, remova qualquer conteúdo intestinal restante e raspe a camada mucosa com um bisturi para remover villi. Se as amostras forem abundantes, biópsias adicionais podem ser coletadas em criovias contendo reagente de armazenamento de RNA (1 mL) ou parafina incorporada para comparação futura entre organoides e seu tecido de origem. No caso de fazer biópsias para análise tem, não raspe o villi e armazene a amostra em conservante (3% paraformaldeído e 3% glutaraldeído em soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS)) e armazene a 4 °C.
4. Agite o tubo 1x CCS vigorosamente para ~30 s e, em seguida, transfira a amostra para um novo tubo CCS 1x usando fórceps. Repita este processo duas vezes.
5. Transfira a amostra do último tubo 1x CCS para o tubo de transporte (Advanced DMEM/F12 + Pen Strep) e leve a amostra de volta ao laboratório.
   NOTA: Amostras pré-tratadas dessa forma também podem ser enviadas durante a noite no gelo (não envie em gelo seco).

3. Isolamento organoide

NOTA: Realize o isolamento utilizando técnicas assépticas em um armário de biossegurança. Consulte a Figura 3 para o fluxo de trabalho de isolamento organoide canino.

1. Agite a amostra de tecido no tubo de transporte por ~30 s e remova o excesso de sobrenanante até que haja 0,5 mL deixado no tubo por tubulação lenta perto da superfície do fluido. Certifique-se de não descartar nenhum tecido.
2. Transfira tecido e remanescente de supernante para uma placa de Petri estéril. Usando um bisturi descartável (ou fórceps esterilizados e tesouras), corte e pique o tecido em pedaços menores (tamanho de 1 ^mm2) assemelhando-se a uma consistência de purê por aproximadamente 5 minutos.
3. Pipe o tecido picado com líquido da placa de Petri para o primeiro tubo CCS. Adicione 2 mL de DMEM/F12 avançados à placa de Petri, lave o tecido restante e transfira para o primeiro tubo CCS.
4. Vórtice o tubo 1x CCS por 5 s aproximadamente cinco vezes. Permita que as biópsias se instalem na parte inferior do tubo de 15 mL (aproximadamente 1 min) e remova o supernatante até que haja 5 mL no tubo. Transfira o CCS 1x do novo tubo para o tubo de amostra.
5. Repita a etapa anterior para os próximos dois tubos. Nas duas últimas lavagens, remova o sobrenatante até 3 mL restante no tubo.
6. Transfira as biópsias e 1x CCS do tubo de amostra para um poço de uma placa de 6 poços. Em seguida, adicione 3 mL de 1x CCS ao tubo de amostra, gire suavemente para coletar qualquer tecido restante e transfira para o mesmo poço da placa.
7. Adicione 150 μL de 0,5 M EDTA (para alcançar um volume total de 6,15 mL em um poço). Coloque a placa de 6 poços em um misturador/roqueiro de 20°, 24 rpm a 4 °C. Incubar as amostras de fígado por 10 minutos e as amostras intestinais por 1h no roqueiro em movimento.
8. Transporte a placa de 6 poços de volta para o armário de biossegurança. Transfira tecido picado e líquido para um tubo CCS/FBS 1x e deixe os tecidos se instalarem. Transporte o supernante (esta porção agora inclui células-tronco livres) e aproximadamente 0,2 mL da porção superior do tecido para o tubo vazio.
9. Gire o tubo contendo a amostra (700 x g por 5 min a 4 °C). As células-tronco são agora pelotas junto com o tecido picado. Retire e descarte o supernatante cuidadosamente para não perturbar a pelota.
10. Resuspenda a pelota em DMEM/F12 avançado e gire o tubo novamente (700 x g por 5 min a 4 °C). Aspire o supernatante e não perturbe a pelota.
11. Calcule o volume de ECM solubilizado necessário para semear as células e tecidos dissociados. Use 30 μL de ECM solubilizado por poço de uma placa de 24 poços para alcançar a densidade adequada de semeadura.
    NOTA: Incorpore um pós-isolamento amostral em 4 a 6 poços de uma placa de 24 poços (ou seja, com base na quantidade de tecido picado na amostra).
12. Adicione o volume calculado de ECM solubilizado ao tubo de amostra e lentamente pipeta para cima e para baixo para evitar a formação de bolhas. Semeou a suspensão no meio dos poços para que o ECM solubilizado possa formar uma estrutura semelhante a uma cúpula.
    NOTA: O uso de pontas de pipeta a partir de um congelador de -20 °C auxilia no revestimento de ECM solubilizado. Se os pedaços de tecido forem maiores que a ponta da pipeta P200, use pontas frias largas ou corte as pontas P1000 frias para ajudar no revestimento. Mantenha a amostra com o ECM solubilizado no gelo sempre que possível.
13. Transporte a placa para uma incubadora (37 °C; 5% de atmosfera de _CO2 ) e permita que o ECM solubilizado se solidifique por ~30 min.
14. Misture o inibidor rock e o GSK3β em CMGF+ (concentrações na Tabela 1). Adicione 500 μL desta solução (CMGF+ R/G) a cada poço. Coloque a placa na incubadora (37 °C; 5% de _co2 atmosfera).

Figura 3: Fluxo de trabalho de isolamento organoide canino. A amostra de tecido colhido é transferida para uma placa de Petri e picada corretamente. A amostra é então transferida para um tubo CCS 1x, e são realizadas etapas de lavagem. Para a incubação edta em uma placa de 6 poços, a amostra é então transferida para um tubo contendo 1x CCS e FBS. Depois que o tecido se instala, o supernasal com uma pequena quantidade de tecido é transferido para um tubo vazio. A amostra é, consequentemente, girada, o supernante é removido, e a pelota é resuspended em DMEM/F12 Avançado. O tubo é girado novamente, e o supernascido é aspirado e descartado. O ECM solubilizado é adicionado ao tubo, misturado, e a amostra é banhada em uma placa de 24 poços. A placa é, consequentemente, incubada (37 °C; 5% atmosfera de _CO2 ) por 30 min, e a mídia é então adicionada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

NOTA: A seção a seguir (etapas 4 e 5) descreve o Protocolo de Manutenção Organoide Canina. Mude a mídia de acordo com a Tabela 2 e verifique diariamente os organoides quanto a sinais de apoptose, contaminação, superlotação e descolamento do ECM solubilizado. As notas diárias devem ser tomadas de acordo com a Figura 4 para monitorar com precisão as condições e os efeitos experimentais sobre as culturas. Consulte a Tabela Suplementar 1 para obter um modelo que permita a coleta de notas precisas e reprodutíveis relacionadas à cultura organoide. Para organoides hepáticos, use CMGF+ aprimorado com inibidor de ROCHA e GSK3β.

Figura 4: Organoid dimensionamento e guia de densidade. (A) Gráfico de tamanho organoide para rastreamento preciso do crescimento organoide. O Guia de Dimensionamento inclui categorias extra-pequeno (XS), pequeno (S), médio (M), grande (L) e extra-grande (XL). (B) O Guia de Densidade consiste em densidade muito baixa (VLD), baixa densidade (LD), densidade média (MD), alta densidade (HD) e categorias de densidade muito alta (VHD). (C) Imagens representativas da contaminação bacteriana e fúngica da amostra organoide. (D) Imagens representativas da superlotação organoide e da apoptose. A ampliação objetiva é indicada em todos os painéis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Recomendação de mudança de mídia
Segunda-feira	Terça-feira	Quarta-feira	Quinta-feira	Sexta-feira	Sábado	Domingo
500 μL	N/A	500 μL	N/A	750 μL	N/A	N/A

Tabela 2: Recomendação de alteração de mídia. Uma linha do tempo recomendada de mudança semanal de mídia. Recomenda-se que a mídia (500 μL de CMGF+ para organoides intestinais, ou 500 μL de CMGF+ R/G para organoides hepáticos) seja alterada a cada dois dias. Para explicar as horas extras em um fim de semana, 750 μL de mídia é adicionado nas tardes de sexta-feira, com a mídia sendo atualizada nas manhãs de segunda-feira.

4. Limpeza organoide

NOTA: A limpeza ou a passagem organoides devem ser realizadas regularmente para manter a saúde da cultura organoide. Realizar o procedimento de limpeza sempre que apoptose na cultura, presença de detritos, superlotação dos organoides ou desprendimento de ECM solubilizado é notado. Consulte a Figura 4D.

1. Remova a mídia dos poços enquanto inclina a placa para evitar a destruição do ECM solubilizado.
   NOTA: Se o desprendimento solubilizado do ECM for considerável, é aconselhável transferir a mídia para o tubo de 15 mL para evitar a perda de fragmentos de ECM solubilizado contendo a amostra.
2. Adicione 0,5 mL de DMEM/F12 avançado pré-moído a cada poço para dissolver as cúpulas de matriz por pipetação repetida usando uma ponta P1000 (evite criar bolhas excessivas). Transfira a matriz dissolvida contendo organoides para um tubo de centrífuga de 15 mL. Mantenha o tubo no gelo e se o volume for inferior a 6 mL, encha lentamente o tubo com DMEM/F12 avançado para atingir um volume total de 6 mL.
3. Gire o tubo (700 x g por 5 min a 4 °C) e remova todo o supernante, certificando-se de não perturbar a pelota.
4. Adicione o volume necessário de ECM solubilizado (30 μL por poço para alcançar a densidade adequada de semeadura) e lentamente resuspense a pelota por mistura de pipeta. Aplaque a suspensão no meio da placa de 24 poços para formar uma cúpula.
5. Coloque a placa em uma incubadora (37 °C; 5% de atmosfera de _CO2 ) por ~30 min e, em seguida, adicione o volume adequado de mídia (Tabela 2).

5. Passagem organoide

NOTA: A passagem é normalmente realizada 5-7 dias após a cultura inicial para expandir a linha celular organoide. Culturas organoides podem normalmente ser expandidas em uma proporção de 1:3. Imagens de culturas saudáveis prontas para a passagem podem ser vistas na Figura 4. Organoides têm que ser pelo menos médios em tamanho.

1. Realizar etapas 4.1 a 4.3.
2. Remova o supernatante deixando 0,5 mL no tubo. Certifique-se de não perturbar a pelota.
3. Adicione 0,5 mL de protease semelhante à trippsina (ver Tabela de Materiais), misture corretamente aspirando com uma pipeta e incubar no banho de água de 37 °C (incubar organoides intestinais por 8 min ou organoides hepáticos por 10 min). Continue a misturar a solução apertando o tubo várias vezes no ponto de intervalo da incubação.
4. Mova o tubo contendo a amostra de volta para um armário de biossegurança e adicione lentamente 6 mL de DMEM/F12 avançado prechilled para inativar protease semelhante à trippsina e parar a dissociação das células.
5. Gire o tubo (700 x g por 5 min a 4 °C) e remova o sobrenante. Certifique-se de não perturbar a pelota.
6. Realize as etapas 4.4. e 4,5.
   NOTA: A seção a seguir (etapas 6-9) descreve o Protocolo de Colheita e Biobanco Organoide. As culturas organoides devem estar livres de tecidos que foram removidos durante passagens anteriores. As culturas também devem ser saudáveis, pelo menos grandes em tamanho, e de médio a alto em densidade. Imagens de culturas saudáveis prontas para aplicações a jusante podem ser vistas na Figura 4. Mover-se rio abaixo com preservação e colheita de culturas organoides sub-ideais pode impactar negativamente os resultados de caracterização e a viabilidade do biobanco. Revise o layout recomendado da placa de 24 poços na Figura 5.

Figura 5: Layout recomendado de placa de 24 poços. O layout recomendado da placa de 24 poços para caracterização básica após a expansão da cultura organoide. A incorporação de seis poços (organoides médios a grandes de média a alta densidade) normalmente permitirá uma alta concentração de organoides em um bloco de histologia. Quatro poços de organoides podem ser agrupados a um criovial com reagente de armazenamento RNA para aplicações a jusante. Catorze poços são usados para biobancar as amostras organoides e fornecem material para até sete frascos criopreservados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. Fixação de organoides

1. Remova a mídia do poço e certifique-se de não perturbar a cúpula ECM solubilizada.
2. Adicione 500 μL de solução de ácido formal-acético-álcool servindo como fixação (FAA; composição na Tabela 1).
3. Armazene organoides à temperatura ambiente. Depois das 24h, aspire a FAA e encha o poço com 70% de etanol. Enrole as placas com uma fita de filme flexível de laboratório (ver Tabela de Materiais) para evitar a evaporação rápida. Os organoides estão prontos para incorporar parafina. A incorporação da cultura organoide é realizada em moldes tradicionais de base metálica.

7. Preservação do RNA

1. Remova a mídia dos poços e certifique-se de não perturbar a cúpula ECM solubilizada.
2. Use 0,5 mL de DMEM/F12 avançado prechilled por poço para dissolver cúpulas ECM solubilizadas, tubondo repetidamente para cima e para baixo (evite criar bolhas excessivas). Transfira os organoides para um tubo de centrífuga de 15 mL. Mantenha o tubo no gelo e se o volume for inferior a 6 mL, encha lentamente o tubo com DMEM/F12 avançado para atingir 6 mL de volume total.
3. Gire o tubo (700 x g por 5 min a 4 °C) e remova todo o supernatante. Certifique-se de não perturbar a pelota.
4. Adicione 100 μL de PBS ao tubo de amostra e resuspense a pelota por tubulação suave. Transfira o conteúdo do tubo de amostra para um criovial.
5. Adicione 900 μL de reagente de armazenamento de RNA (ver Tabela de Materiais) ao tubo de amostra e misture para coletar quaisquer organoides restantes. Transfira esses organoides residuais para o criovial e armazene-os a -80 °C (normalmente quatro poços agrupados a um criovial serão suficientes para aplicações a jusante, incluindo qPCR e sequenciamento de RNA).
   NOTA: Um criovial normalmente produz um total de 4.000 ng de RNA (medido via análise espectrômetro).

8. Biobanco organoide

NOTA: O biobanco geralmente ocorre de 3 a 4 dias após a passagem. Os sinais de apoptose não devem estar presentes na cultura para realizar esse método. Consulte a Figura 4 para saber o tamanho e a densidade de referência apropriados para o congelamento. Organoides médios a extra-grandes de biobancos em densidades médias a muito altas. Uma etapa de congelamento de emergência pode ser seguida se uma linha celular organoide for especialmente rara ou mais viabilidade não é garantida. Siga os mesmos passos para biobanco organoide normal (passos 8.1 a 8.4). O congelamento emergencial é feito com culturas menores e menos densas. Acumule tantos poços de organoides em um criovial seguindo passos 8.1 a 8.4. Tenha em mente que um número suficiente de organoides deve ser mantido vivo na tentativa de expandir a cultura (o congelamento de emergência é simplesmente um procedimento de backup para proteger contra possíveis perdas de cultura através de contaminação ou outras ocorrências inesperadas).

1. Siga os passos 7.1 a 7.3.
2. Adicione 1 mL de mídia congelante por criovial (composição na Tabela 1) ao tubo de amostra e resuspenque suavemente a pelota por tubos para cima e para baixo.
3. Transfira 1 mL da solução para um criovial (razão de dois poços/criovial) e mantenha os criovials no gelo.
4. Transfira os criovials do gelo para um recipiente de congelamento (reabastecer regularmente o reservatório com isopropanol) e transfira imediatamente para -80 °C. Mova as amostras para nitrogênio líquido (-196 °C) para armazenamento a longo prazo após 24 h.
   NOTA: Um recipiente de congelamento de células sem álcool também pode ser usado em vez de um recipiente tradicional. Certifique-se de que as amostras não descongelam durante o transporte do -80 °C até o armazenamento de nitrogênio líquido a longo prazo. O degelo repetido diminui a viabilidade da cultura celular.

9. Reavivamento do armazenamento de nitrogênio líquido

NOTA: Ao optar por descongelar uma linha organoide, um subconjunto dos organoides revividos deve ser refrazenado e substituído no biobanco o mais rápido possível por pelo menos um (de preferência mais) criovials.

1. Coloque o ECM solubilizado no gelo para descongelar lentamente, coloque uma placa de 24 poços na incubadora (37 °C; 5% de atmosfera de _CO2 ) e prepare os reagentes necessários, como um tubo de 15 mL e DMEM/F12 Avançado.
2. Recupere um criovial contendo uma amostra organoide do armazenamento de nitrogênio líquido e transfira-a imediatamente para um banho de calor (37 °C) por 2 minutos.
3. Transfira o conteúdo do criovial para um tubo de centrífuga de 15 mL em um armário de biossegurança. Adicione lentamente dMEM/F12 avançado prechilled para atingir um volume total de 6 mL.
4. Gire o tubo (700 x g por 5 min a 4 °C). Remova o supernatante e certifique-se de não perturbar a pelota.
5. Adicione 180 μL (30 μL por poço) de ECM solubilizado à pelota e emplaque esta suspensão na placa pré-aquecida de 24 poços. Um criovial pode ser banhado a seis poços de uma placa de 24 poços.
6. Coloque a placa de 24 poços na incubadora (37 °C; 5% de atmosfera de _CO2 ) por ~30 min e adicione CMGF+ R/G (para organoides intestinais, mude para CMGF+ em 24 a 48 h).
   NOTA: Quando uma amostra é banhada e crescendo na placa de 24 poços, deve ser permitido recuperar por pelo menos 2 dias antes da passagem para aumentar a viabilidade.

Resultados

O protocolo organoide canino normalmente gera ~50.000 a ~150.000 células intestinais ou hepáticas por poço de uma placa de 24 poços. Organoides representativos podem ser vistos na Figura 6.

Figura 6: Imagens representativas de organoides caninos. Imagens de organoides isolados usando este protocolo são retratadas. (A,B) Organoides intestinais derivados do duodeno (tomados em 10x e 5x de ampliação objetiva). Note a presença de organoides mais antigos e esferoides mais jovens. (C,D) Enteróides caninos da porção inferior do jejunum (tomadas em 10x e 20x de ampliação objetiva). (E,F) Enteróides ileais (tomados em 20x e 5x de ampliação objetiva) e (G,H) colonos (tomados em 10x de ampliação objetiva). (I) Uma imagem representativa de organoides hepáticos tiradas em ampliação objetiva de 20x. A maioria dos organoides estão em sua forma brotante. Esferoides hepáticos mais jovens também podem ser vistos na imagem. (J) Imagem representativa mostrando um organoide rarepático que forma uma estrutura semelhante a um duto (tomada em ampliação objetiva de 10x). A barra de escala (500 μm) está presente no canto superior esquerdo de cada imagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Enteroids e colonóides derivados usando este protocolo foram caracterizados anteriormente por Chandra et al. em ²⁰¹⁹¹². Os organoides intestinais caninos são compostos por uma população celular regular do epitélio intestinal. Usando RNA in situ hibridização , a expressão de biomarcadores de células-tronco (Repetição rica em leucina contendo receptor acoplado à proteína G 5 - LGR5 e Fator de Transcrição SRY-Box 9 - SOX9), Biomarcador de Células paneth (receptor Ephrin tipo B 2 - EPHB2), marcadores de células epiteliais absortivas (fosfattase alcalina - ALP) e marcador enteroendócrino (Neurogenin-3 - Neuro G3)¹² foi confirmado. A coloração azul alciana foi realizada em slides embutidos para parafina para confirmar a presença de células de Cálice. Além disso, ensaios funcionais como imagem metabólica óptica (OMI) ou regulador de condução transmembrana de fibrose cística (CFTR) foram realizados para confirmar a atividade metabólica dos organoides. Organoides caninos de cães diagnosticados com doença inflamatória intestinal, tumores estromaminais gastrointestinais (GIST) ou adenocarcinoma colorretal também foram isolados usando este ^protocolo12.

Após o isolamento das células-tronco, organoides caninos hepáticos iniciam seu ciclo de vida como esferoides em expansão, e após ~7 dias, eles se transformam em organoides brotantes e diferenciadores. Esferoides hepáticos caninos isolados e cultivados de acordo com este protocolo foram medidos para quantificar seu crescimento e determinar o tempo ideal para a passagem. Esferoides derivados de biópsias hepáticas laparoscópicas de cães adultos saudáveis (n = 7) foram medidos durante seus primeiros 7 dias de cultura. Foram tiradas imagens representativas, e o raio longitudinal (a) e diagonal (b) dos esferoides (n = 845) foi medido em toda a cultura. Foram calculados o volume (V), a área de superfície (P), a área de elipse 2D (A) e a circunferência (C) dos esferoides. Os cálculos e resultados do experimento estão resumidos na Figura 7. Área de elipse 2D e circunferência foram utilizadas para avaliar a saúde da cultura organoide por meio de microscopia leve. Esses valores podem servir de guia para decisões de manutenção da cultura.

Resumidamente, os esferoides expandiram-se rapidamente em volume, área de superfície, área de elipse 2D e circunferência. Os dados de medição dos sete beagles foram mediados para os seguintes cálculos. O volume aumentou 479% (±6%) do dia 2 para 3. Ao mesmo tempo, a área de superfície esferoide e a área de elipse 2D aumentaram 211% (±208%) e 209% (±198%), respectivamente. A circunferência de elipse 2D aumentou do dia 2 para 3 em 73% (±57%). O aumento no volume total de organoides hepáticos dos dias 2-7 foi mais de 365 vezes, a área de superfície e elipse 2D aumentou 49 vezes, e a circunferência 2D ellipse aumentou seis vezes.

Em seguida, os spheróides derivados de duas amostras caninas adultas foram ainda mais cultivados após a passagem e coletados todos os dias (dia 2-7) para RNA in situ hibridização (RNA ISH). Sondas caninas foram projetadas (lista de sondas é fornecida como Tabela Suplementar 2), e a expressão mRNA foi avaliada para marcadores de células-tronco (LGR5), marcadores específicos para cholangiocitos (citokeratin 7 - KRT-7, e aquaporina 1 - AQP1), bem como marcadores de hepatocitte (proteína de caixa de garfo A1 - FOXA1; e citocromo P450 3A12 - CYP3A12). A expressão dos marcadores foi avaliada de forma semi-quantitativa (imagens representativas na Figura 8). Os sferóides expressaram preferencialmente o marcador de colangiocito KRT-7 variando de 1% a 26% na área de sinal/área total das células. O AQP1 não foi expresso nas amostras organoides, indiscutivelmente porque sua presença em amostras hepáticas caninas é escassa. A expressão do marcador de células-tronco (LGR5) variou entre 0,17% a 0,78%, enquanto os marcadores de hepatócitos foram expressos em menor medida em 0,05%-0,34% para FOXA1 e 0,03%-0,28% para CYP3A12.

Figura 7: Medições esferoides hepáticas. (A) Observou-se crescimento esferoide hepático todos os dias de culturas entre os dias 2 e 7. Os spheróides se formaram pela primeira vez no dia 2, e os últimos esferoides iniciaram o processo de brotação no dia 7. Um experimento subsequente usou duas linhas organoides caninas após a passagem para colher esferoides todos os dias para incorporação de parafina para realizar RNA ISH (imagem do dia 2 foi tirada em 40x, dia 6 imagem em 10x, e o resto das imagens foram tiradas em 20x de ampliação). (B) Um aglomerado esferoide hepático é mostrado ligado a um pedaço de tecido embutido no ECM solubilizado 4 dias após o isolamento. Raios longitudinais e diagonais dos esferoides foram medidos (imagem tirada em 10x). O painel (C) retrata a fórmula usada para cálculos para derivar volume (V), área de superfície (P), área de elipse 2D (A) e circunferência (C). Para esses cálculos, presumiu-se que os esferoides hepáticos caninos são esferoides ideais. Os resultados das medições do volume hepático dos spheróides, área de superfície, área de elipse 2D e circunferência de elipse 2D para dias individuais de crescimento são retratados no painel (D). As barras de erro representam o erro padrão da média (SEM). (E) a expressão mRNA de KRT-7, LGR5, FOXA1 e CYP3A12 foram medidas em amostras de esferoides hepáticos caninos após a passagem do dia 2 ao dia 7. O AQP1 não foi expresso nestas amostras. Uma barra de escala (5x: 500 μm; 10x: 200 μm; 20x: 100 μm; 40x: 50 μm) está presente no canto superior esquerdo de cada imagem. Ampliação objetiva anotada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os organoides raramente não se separariam durante o processo de passagem após essa técnica padronizada. Se a dissociação não ocorrer, os tempos de passagem podem ser ajustados para alcançar a desintegração ideal do cluster celular. No entanto, a exposição prolongada à protease semelhante à trippsina pode impactar negativamente o crescimento dos organoides. Organoides hepáticos foram usados em um experimento subsequente para investigar o tempo ideal de dissociação e estabelecer um método adequado de passagem. Resumidamente, organoides hepáticos de dois cães saudáveis (6 bem-replicados cada) foram passagemdos com protease semelhante à trippsina por 12 minutos e 24 min. As amostras eram agitadas a cada 6 minutos. No final do ponto de tempo de dissociação, 6 mL de DMEM/F12 avançados gelados foram adicionados à solução, e as amostras foram giradas (700 x g por 5 min a 4 °C). O supernatante (DMEM/F12 avançado com protease diluída semelhante à trippsina) foi removido, e as pelotas foram embutidas em ECM solubilizado conforme descrito acima (etapas 4.4-4.5). Após 12 h de cultura em ECM solubilizado e CMGF+ R/G, foram observadas diferenças em ambas as amostras. Uma incubação de 12 min com protease semelhante à trippsina não inibiu o crescimento organoide. No entanto, o crescimento dos organoides foi impactado negativamente (ver Figura 9) utilizando uma incubação de 24 min.

Figura 9: Experimento de passagem organoide hepática canina. Imagens representativas de organoides derivados de dois cães (D_1 e D_2) foram passagemdas usando o método de incubação de protease semelhante à trippsina por 12 min ou 24 min. As amostras de controle foram passagemdas com protease semelhante à trippsina por 10 minutos. Uma barra de escala (μm) está presente no canto superior esquerdo de cada imagem e representa 500 μm (ampliação objetiva de 5x). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Em seguida, foi realizada a investigação sobre a sobrevivência de organoides hepáticos caninos derivados deste protocolo em um ambiente desfavorável (privação de apoio estrutural e nutrição). A investigação se concentrou em determinar o volume de mídia organoide e matriz de porão necessária para o crescimento e sobrevivência do organoide hepático e também estabelecer a influência dessas condições na cultura organoide. A sobrevivência foi medida em uma placa de 96 poços com um número limitado de organoides. Organoides de dois cães foram passagemdos como descrito acima e incorporados (12 réplicas) em diferentes volumes de ECM solubilizado (10 μL ou 15 μL). As células foram banhadas em uma concentração de 400 células/10 μL bem e 600 células/15 μL bem correspondentes a 40.000 células/mL. Dois tipos de mídia (CMGF+, ou CMGF+ R/G) foram adicionados em volumes diferentes (25 μL, 30 μL ou 35 μL). A mídia nunca foi alterada, e nenhum procedimento de manutenção foi realizado. A sobrevivência dos organoides era monitorada todos os dias. A morte organoide foi definida como a dissolução de mais de 50% das estruturas organoides. A taxa de sobrevivência dos organoides nessas condições variou de 12,9 (±2,3) dias a 18 (±1,5) dias, e os resultados são resumidos na Tabela 3. As duas amostras que sobreviveram mais tempo foram organoides derivados de cães embutidos em 15 μL de ECM solubilizado e 30 μL de mídia CMGF+. Ambas as amostras foram incorporadas em ECM solubilizado (30 μL) e mídia fresca (500 μL) em uma placa padrão de 24 poços após 18 dias de privação para garantir que a expansão organoide ainda fosse possível (Figura 10).

	Tipo de mídia	Média (dias sobreviveram)	Mediana	CV%	Média (dias sobreviveram)	Mediana	CV%	Média (dias sobreviveram)	Mediana	CV%	Média (dias sobreviveram)	Mediana	CV%
Mídia (μL)		30			25			35			30
ECM (μL)		10			10			10			15
D_1	CMGF+ R/G	12.50	13	11.57	12.83	13	4.50	11.83	11.5	12.91	12.08	13	12.46
	CMGF+	17.08	17	16.26	18.50	19	4.89	18.42	19	14.54	17.82	19	8.99
D_2	CMGF+ R/G	13.67	14	13.36	13.00	13	12.70	14.00	14.5	17.23	13.08	13	8.90
	CMGF+	15.50	15	18.56	17.50	18	10.48	17.50	19	20.89	17.00	17	14.41
TOTAL	CMGF+ R/G	13.08	13	13.13	12.92	13	9.39	12.92	13	17.52	12.58	13	11.22
	CMGF+	16.29	16.5	17.69	18.00	18.5	8.35	17.96	19	17.65	17.43	17	11.70
	morte= mais de 50% da massa organoide são inviáveis

Tabela 3: Resultados do experimento de sobrevivência. O experimento foi baseado na privação de apoio estrutural ou nutrição de duas culturas organoides. Os resultados incluem o desvio médio, mediano e padrão (CV%) das concentrações individuais de ECM solubilizado e mídia em cães individuais.

Figura 10: Organoides privação nutricional e estrutural. Organoides foram replatados em placas de 24 poços para confirmar a capacidade de expansão pós-privação (A). Imagens representativas do dia 4 e do dia 7 após a replaca mostram a expansão dos organoides, confirmando a capacidade de identificar organoides viáveis visualmente (as imagens são tiradas em 5x de ampliação objetiva). Imagens representativas de organoides considerados vivos ou mortos são vistas em (B). As imagens são tiradas em 5x de ampliação objetiva. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Esferoides hepáticos RNA in situ imagens representativas da hibridização. Imagens representativas dos marcadores LGR5, KRT7, FOXA1 e CYP3A12 foram tiradas em 60x de ampliação objetiva de amostras do dia 2-7 pós passagem. Moléculas positivas de mRNA mancham vermelho. O AQP1 não foi expresso nas amostras. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Composição incompleta da solução de quelação (ICS)	Concentração final
500 mL H2O	NA
2.49 g Na2HPO4-2H2O	4,98 mg/mL
2,7 g KH2PO4	5,4 mg/mL
14 g NaCl	28 mg/mL
0,3 g KCl	0,6 mg/mL
37,5 g de sacarose	75 mg/mL
25 g D-Sorbitol	50 mg/mL
Composição completa da solução de quenteização (CCS)	V/V % ou concentração final
Solução de quelação incompleta	20%
H2O estéril	80%
DTT	520 μM
Estreptococos de caneta	Caneta: 196 U/mL; Estreptocos 196 ug/mL
Composição da mídia organoide	Concentração final
DMEM avançado/F12	NA
FBS	8%
Glutamax	2 mM
HEPES	10 mM
Primocina	100 μg/mL
Suplemento B27	1x
Suplemento N2	1x
N-Acetyl-L-cisteína	1 mM
Murine EGF	50 ng/mL
Murine Noggin	100 ng/mL
R-Spondin-1 humano	500 ng/mL
Murine Wnt-3a	100 ng/mL
[Leu15]-Gastrin I humano	10 nM
Nicotinamida	10 mM
A-83-01	500 nM
SB202190 (inibidor P38)	10 μM
TMS (trimethoprim sulfametoxazol)	10 μg/mL
Componentes adicionais	Concentração final
Inibidor de ROCHA (Y-27632)	10 μM
Stemolecule CHIR99021 (GSK3β)	2,5 μM
Composição de mídia congelante	V/V por cento
Mídia organoide e inibidor de ROCK	50%
FBS	40%
Sulfoxida de dimetila (DMSO)	10%
Composição da FAA	V/V por cento
Etanol (100%)	50%
Ácido Acético, Glacial	5%
Formaldeído (37%)	10%
Água destilada	35%

Tabela 1: Composição de soluções e mídia. Uma lista de componentes e concentrações de soluções de quente incompleto e completa, CMGF+ (mídia organoide), mídia de congelamento e FAA.

Tabela suplementar 1: Modelo de cuidado organoide. Este modelo permite a responsabilidade de notas organoides precisas e reprodutíveis para cada dia. Clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela suplementar 2: RNA in situ hibridização. Lista de sondas especificamente projetadas para alvos caninos de mRNA por um fabricante da tecnologia para executar a técnica de hibridização RNA in situ . Informações sobre a significância de marcadores individuais, o nome de uma sonda, seu número de referência e região-alvo estão listadas. Clique aqui para baixar esta Tabela.

Discussão

Atualmente, há falta de protocolos padronizados disponíveis para o isolamento e manutenção de organoides hepáticos e intestinais caninos. O estabelecimento de procedimentos operacionais padrão para culturas organoides é garantido para que este modelo seja aplicável em diferentes ambientes laboratoriais. Especificamente, fornecer protocolos operacionais padronizados para a cultura desses modelos organoides caninos é fundamental para caracterizar o crescimento normal dos organoides durante a cultura e a passagem para obter pontos de tempo ideais para expansão e manutenção. Organoides intestinais caninos cultivados usando o protocolo foram previamente caracterizados por Chandra et ^al.12.

Um dos passos mais críticos do protocolo é a passagem de organoides. O tempo ideal para a primeira passagem de esferoides hepáticos foi determinado para ser no dia 7 após o isolamento com base nas medidas hepáticas de esferoide. O volume máximo de esferoides foi alcançado até o dia 7, e ao mesmo tempo, os esferoides começaram a brotar e formaram organoides hepáticos. O aumento do volume total organoide do dia 2-7 após o isolamento foi mais de 365 vezes, sugerindo que o tempo ideal de passagem é maior do que a cultura organoide intestinal canina. Após 7 dias na cultura, não foram observados sinais brutos de apoptose celular no esferoide hepático, mesmo sem limpeza ou passagem (Figura 7). A passagem dos organoides intestinais e hepáticos pode ser desafiadora, pois o procedimento pode levar à perda de células e à viabilidade alterada. Os resultados indicam que a incubação prolongada de organoides hepáticos com protease semelhante à trippsina (até 12 min) não influencia negativamente a subcultura. Incubar os organoides em protease semelhante à trippsina por mais de 24 min pode ser prejudicial à subcultura subsequente dos organoides.

Em caso de quebra subótimal nos aglomerados celulares com a passagem organoide, a dissociação mecânica em vez de incubação prolongada com protease semelhante à trippsina pode ser mais benéfica. Se forem encontrados problemas com a dissociação adequada dos organoides, um breve vórtice das amostras pode ser tentado para aumentar o rendimento da passagem. Por outro lado, o vórtice tem o potencial de arruinar uma cultura e danificar as células, por isso só deve ser usado quando outros procedimentos falharam repetidamente. Quebrar organoides hepáticos em células únicas reduz a taxa de crescimento dos organoides, enquanto que quebrá-los em aglomerados de células pode melhorar muito sua viabilidade. Dez minutos foram escolhidos como o tempo de incubação para o protocolo organoide. Um ponto de tempo de incubação de 12 minutos foi considerado não citotóxico em comparação com uma incubação de 24 minutos no experimento de protease semelhante à trippsina.

O experimento de sobrevivência confirmou que organoides hepáticos caninos poderiam sobreviver por até 19,5 dias em condições desfavoráveis (esgotamento estrutural e nutricional). Organoides que sobreviveram a essas condições por mais tempo foram cultivados com mídia CMGF+. Esta observação pode ter sido causada pelo crescimento mais lento de organoides hepáticos em mídia não suplementada com inibidor de rocha e GSK3β. As culturas organoides com CMGF+ R/G cresceram mais rápido e podem ter esgotado seus recursos mais rapidamente. Este experimento abre possibilidades de miniaturizar a cultura organoide canina para alcançar uma conversão de sistema de alto rendimento. Tal tecnologia mostra o potencial para facilitar a descoberta de medicamentos ou estudos toxicológicos a um custo substancialmente reduzido.

Alguns problemas comuns encontrados durante a manutenção da cultura organoide canina são a solidificação inadequada da amostra ao chapear, contaminação cultural e estabelecer a densidade e o tamanho adequados dos organoides. Se o ECM solubilizado solidificar prematuramente durante o revestimento, coloque-o imediatamente no gelo por 10 minutos. Se o ECM solubilizado não formar estruturas semelhantes a cúpulas, é provável que não tenha sido removida da amostra uma mídia suficiente. Se for esse o caso, dilui a amostra com um ECM mais solubilizado até formar cúpulas.

Quando a contaminação fúngica ou bacteriana é encontrada em uma placa inteira (ver Figura 4), a melhor solução é descartar a placa. O tratamento com antifúngicos ou antibióticos pode ser tentado, mas o sucesso de tal tentativa é extremamente baixo. Se um único poço estiver contaminado em uma placa, poços viáveis e não afetados podem ser limpos (siga os passos 4.1 a 4.5) em uma nova placa e monitorados de perto. Se a amostra já foi Emergencial Congelada, é aconselhável descartar toda a amostra, pois o descongelamento da amostra expõe a incubadora a um risco adicional de contaminação.

A cultura organoide saudável deve ser, pelo menos, na categoria de tamanho médio e médio ou maior. A densidade ideal é crucial para o crescimento da cultura organoide. A menor densidade deve ser corrigida limpando os organoides para a densidade média. Se ocorrer a situação de extrema densidade (superlotação), os organoides devem ser expandidos para mais poços. Sinais brutos de apoptose celular frequentemente acompanham tanto a superlotação quanto a baixa densidade da cultura organoide. Se essas questões não forem corrigidas a tempo, toda a cultura organoide se tornará apoptótica em questão de dias. Se os organoides alcançarem tamanho extra grande ou densidade muito alta, a cultura deve ser usada para um experimento, congelamento ou fixação.

A mídia organoide contém atualmente 17 componentes, e a adição de fatores de crescimento necessários para a manutenção e expansão organoides pode, portanto, ser cara. Esse problema pode ser resolvido pelo crescimento de culturas celulares 2D que sintetizam os fatores de crescimento para produzir CMGF+condicionados. A cultura celular L-WRN produz fatores de crescimento Wnt-3a, R-Spondin-3 e ^Noggin37. A colônia celular usa 90% de mídia cultural DMEM/F12 e 10% FBS. Quando a cultura atinge 90% de confluência, a mídia é colhida todos os dias por 1 semana. A mídia colhida é então misturada com 2x CMGF+ (sem esses fatores de crescimento). Embora as culturas 2D possam produzir os fatores de crescimento necessários a uma fração do custo, o tempo adicional e a preparação para produzir a mídia devem ser esperados. As concentrações de fatores de crescimento entre lotes de mídia condicionadas também podem ^diferir37,38.

Culturas organoides derivadas de células-tronco caninas são um modelo biomédico único que pode ajudar a alcançar os objetivos da One Health ^Initiative39. A tecnologia organoide pode ser usada em muitas áreas de pesquisa básica e biomédica, abrangendo desde biologia do desenvolvimento, fisiopatologia, descoberta e testes de medicamentos, toxicologia até o estudo de doenças infecciosas e medicina ^{regenerativa40}. A pesquisa translacional e translacional reversa são áreas onde os organoides caninos são ^{aplicáveis15}. Cães têm sido usados por séculos em ambientes experimentais translacionais, e seu status animal companheiro também facilitou sua posição como uma das espécies mais exploradas na medicina veterinária.

Em conclusão, este manuscrito fornece protocolos operacionais padronizados para isolamento, manutenção, colheita e biobanco de organoides hepáticos e intestinais caninos para facilitar a aplicação desse modelo em diversos campos biomédicos. Este modelo é exclusivamente adequado para promover a pesquisa translacional reversa como ferramenta da Iniciativa One Health para promover o compartilhamento inter e intradisciplinar do conhecimento.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chelating solution
D-Sorbitol	Fisher Chemical	BP439-500
DTT	Promega	V3151
KCl	Fisher Chemical	P217-500
KH2PO4	Sigma	P5655-100G
Na2HPO4-2H2O	Sigma	S5136-100G
NaCl	Fisher Chemical	S271-500
Pen Strep	Gibco	15140-122
Sucrose	Fisher Chemical	S5-500
Organoid media
[Leu15]-Gastrin I human	Sigma	G9145-.5MG
A-83-01	PeproTech	9094360
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634-010
B27 supplement	Gibco	17504-044
FBS	Corning	35-010-CV
Glutamax	Gibco	35050-061
HEPES	VWR Life Science	J848-500ML
Human R-Spondin-1	PeproTech	120-38-500UG
Murine EGF	PeproTech	315-09-1MG
Murine Noggin	PeproTech	250-38-250UG
Murine Wnt-3a	PeproTech	315-20-10UG
N2 supplement	Gibco	17502-048
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma	A9165-25G
Nicotinamide	Sigma	N0636-100G
Primocin	InvivoGen	ant-pm-1
ROCK inhibitor (Y-27632)	EMD Millipore Corp.	SCM 075
SB202190 (P38 inhibitor)	Sigma	S7067-25MG
Stemolecule CHIR99021 (GSK3β)	Reprocell	04-0004-base
Trimethoprim	Sigma	T7883-5G
Sulfamethoxazole	Sigma-Aldrich	S7507-10G
Reagents
Acetic Acid, Glacial	Fisher Chemical	A38-500
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Fisher Chemicals	D128-500
EDTA, pH 8.0, 0.5 M	Invitrogen	15575-038
Formaldehyde (37%)	Fisher Chemical	F79P-4
Glutaraldehyde solution	Sigma	G5882
Matrigel Matrix For Organoid Culture	Corning	356255	Extracellular Membrane Matrix
Paraformaldehyde, 97%	Alfa Aesar	A11313
PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline)	Corning	21-040-CM
PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline)	Corning	21-040-CM
RNAlater Soln.	Invitrogen	AM7021	RNA Storage Reagent
TrypLE Express	Gibco	12604-021	Trypsin-like Protease
Other
6 Well Cell Culture Plate	Corning	3516
ACD Hybez II Hybridization System	ACD a biotechne brand	321710
Centrifuge Tube, 15 mL	Corning	430766
CoolCell LX	Corning	BCS-405MC
Cryogenic Vials	Corning	430488
Disposable Centrifuge Tube (50 mL)	Fisherbrand	05-539-13
GyroMini Nutating mixer (Rocker)	Labnet	S0500-230V-EU
Heat Bath	Lab-Line Instruments	3000
Mr. Frosty Freezing Container	ThermoFisher Scientific	5100-0001
NanoDrop 2000	ThermoFisher Scientific	ND2000CLAPTOP	SpectrophotometerAnalysis
Panasonic incubator	Panasonic	MCO-170ML-PA
Parafilm M Wrapping Film	Bemis Company Inc	PM996/EMD	Laboratory Flexible Film Tape
Protected Disposable Scalpels	Bard-Parker	239844
RNAscope 2.5 HD Assay – RED	ACD a biotechne brand	322350
RNAscope H2O2 & Protease Plus Reagents	ACD a biotechne brand	322330
RNAscope Target Retrieval Reagents	ACD a biotechne brand	322000
RNAscope Wash Buffer Reagents	ACD a biotechne brand	310091
Tissue Culture Dish	Dot Scientific	6676621
Tissue Culture Plate 24 wells	Fisherbrand	FB012929