Стандартизация и поддержание 3D-культур печеночных и кишечных органоидов собак для использования в биомедицинских исследованиях

Резюме

Описаны экспериментальные методы извлечения взрослых стволовых клеток из тканей кишечника и печени собак для создания 3D органоидных культур. Кроме того, обсуждаются лабораторные методы для обеспечения последовательного роста и обеспечения стандартных операционных процедур для сбора, биобанка и возрождения кишечных и печеночных органоидных культур.

Аннотация

У собак развиваются сложные многофакторные заболевания, аналогичные человеческим, включая воспалительные заболевания, метаболические заболевания и рак. Поэтому они представляют собой актуальные модели крупных животных с трансляционным потенциалом для медицины человека. Органоиды представляют собой 3-мерные (3D), самосборные структуры, полученные из стволовых клеток, которые имитируют микроанатомию и физиологию их органа происхождения. Эти трансляционные модели in vitro могут быть использованы для применения проницаемости лекарств и обнаружения, токсикологической оценки, а также для обеспечения механистического понимания патофизиологии многофакторных хронических заболеваний. Кроме того, собачьи органоиды могут улучшить жизнь собак-компаньонов, обеспечивая вклад в различные области ветеринарных исследований и облегчая персонализированное применение лечения в ветеринарии. Небольшая группа доноров может создать биобанк образцов органоидов, уменьшая потребность в непрерывном извлечении тканей, поскольку линии органоидных клеток могут быть субкультурированы бесконечно. Здесь представлены три протокола, которые фокусируются на культуре кишечных и печеночных собачьих органоидов, полученных из взрослых стволовых клеток. Протокол изоляции органоидов собак описывает методы обработки ткани и встраивания клеточного изолята в поддерживающий матрикс (солюбилизированный внеклеточный мембранный матрикс). Протокол поддержания органоидов собак описывает рост и поддержание органоидов, включая очистку и пассаж, а также соответствующее время для расширения. Протокол извлечения органоидов и биобанкинга описывает способы извлечения, замораживания и сохранения органоидов для дальнейшего анализа.

Введение

Грызуны являются наиболее часто используемой животной моделью для биомедицинских и трансляционных ^{исследований1}. Они исключительно полезны для исследования основного молекулярного патогенеза заболеваний, хотя их клиническая значимость для хронических многофакторных заболеваний недавно была поставлена под ^{сомнение2}. Собачья модель демонстрирует ряд преимуществ по сравнению с грызунами3,4. Собаки и люди имеют сходство в метаболомике и кишечном микробиоме, которые развивались из-за потребления рациона человека в течение различных периодов их одомашнивания5,6,7. Сходство между анатомией и физиологией желудочно-кишечного тракта собак и человека является еще одним из ^{примеров8}.

Кроме того, собаки часто разделяют схожую среду и образ жизни со своими ^{владельцами9}. Более длительная продолжительность жизни собак по сравнению с грызунами позволяет естественным образом развивать многочисленные хронические ^{состояния10}. Воспалительные заболевания кишечника или метаболический синдром являются примерами многофакторных хронических заболеваний, которые имеют важное сходство между людьми и ^{собаками11,12}. Доклинические испытания собак, в которых участвуют собаки с естественными заболеваниями, могут генерировать более надежные данные, чем те, которые получены от моделей грызунов13. Однако, чтобы свести к минимуму использование исследований на живых животных и соответствовать принципам 3R (Reduce, Refine, Replace)¹⁴, появились альтернативы тестированию in vivo с использованием 3D-органоидов собак in vitro15.

Органоиды представляют собой самосборные 3D-структуры, полученные из стволовых клеток, которые повторяют физиологию и микроанатомию своих исходных ^{органов16,17}. Эта технология была впервые описана Sato et al. в ²⁰⁰⁹¹⁷ году и позволила проводить более транслируемые исследования in vitro в эпителиальных клеточных линиях, чем это было ранее возможно с использованием 2D-культур раковых клеток18,19,20. Органоиды являются полезными моделями in vitro во многих биомедицинских дисциплинах, таких как доклинические токсикологические21,22,23, исследования абсорбции или метаболизма24,25,26,27,28, а также в персонализированных медицинских подходах29,30,31 . Успешная культура органоидов кишечника собак была впервые описана в 201912 году, в то время как печеночные органоиды, полученные от собаки, были впервые зарегистрированы Nantasanti et al. в 201532 ^году. С тех пор органоиды собак успешно используются в исследованиях, изучающих хронические энтеропатии собак, стромальные опухоли желудочно-кишечного тракта, колоректальную аденокарциному12 и болезнь Вильсона33,34.

В то время как взрослые стволовые клетки могут быть собраны с помощью некропсии, органоидная технология не всегда требует жертвоприношения животных. Эндоскопические и лапароскопические биопсии или даже тонкоигольные аспираты ^{органов35} являются жизнеспособным источником взрослых стволовых клеток для выделения эпителиальных ^{органоидов12}. Широкое использование таких неинвазивных методов в ветеринарной практике облегчает варианты обратных трансляционных исследований (перевод информации из ветеринарной клинической практики в клиническую практику человека и наоборот)¹⁵. Дальнейшее развитие органоидной технологии может быть обеспечено стандартизацией органоидной культуры и методов поддержания. Представленный здесь органоидный протокол частично основан на ранее опубликованной работе Saxena et al. от ²⁰¹⁵³⁶ года, и методы были адаптированы к специфике кишечной и печеночной органоидной культуры. Общий рабочий процесс протоколов органоидов собак показан на рисунке 1.

Протокол изоляции органоидов собак вводит методы получения образцов из эндоскопических, лапароскопических и хирургических биопсий, а также некропсий. В нем описывается первоначальная предварительная обработка образцов тканей и методологии, используемые для транспортировки в лабораторию. Материалы и реагенты, необходимые для выделения органоидов, обобщены в разделе «Подготовка к изоляции». Далее подробно описан процесс выделения взрослых стволовых клеток из образцов тканей. Наконец, обсуждается процесс обшивки органоидов в куполообразные структуры с использованием солюбилизированного внеклеточного мембранного матрикса.

Второй протокол, Протокол поддержания органоидов собак, описывает методы документирования и культивирования органоидов. Изменения в СМИ и их частота обсуждаются в этом разделе. Кроме того, описаны лабораторные процедуры, такие как прохождение и очистка клеточных культур, которые необходимы для обеспечения успешного поддержания 3D-органоидов собак. Соответствующая проходка является критическим этапом протокола, и возможные корректировки и устранение неполадок этого шага обсуждаются далее в рукописи.

Последний протокол - это протокол извлечения органоидов собак и протокол биобанкинга, содержащий методы подготовки полноценных органоидов для встраивания парафина и сохранения РНК. Здесь также описаны способы биобанковских органоидных образцов в хранилище жидкого азота. Наконец, обсуждаются способы размораживания замороженных образцов и поддержки их роста.

В заключение, эта статья направлена на обеспечение последовательных процедур культивирования органоидов собак путем стандартизации межлабораторных протоколов. При этом рукопись направлена на облегчение воспроизводимости данных, полученных из собачьих органоидных моделей, чтобы повысить их актуальность в трансляционных биомедицинских исследованиях.

Рисунок 1: Рабочий процесс протоколов органоидов собак. Протокол изоляции органоидов собак описывает подготовку материалов, необходимых для выделения органоидов, извлечение образца ткани (с помощью некропсии, эндоскопической, лапароскопической и хирургической биопсии) и руководство по диссоциации клеток и покрытию клеточной популяции. Протокол поддержания органоидов собак обсуждает очистку и прохождение культуры органоидов. В Протоколе извлечения органоидов и биобанкинга обсуждается подготовка образцов органоидов для встраивания парафина и дальнейшая характеристика органоидов. Также обсуждаются способы биобанка органоидных культур и восстановления их из хранения в жидком азоте. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

протокол

Исследование было одобрено и выполнено в соответствии с Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Университета штата Айова (IACUC-19-337; МАКУК-18-065; МАКУК-19-017).

ПРИМЕЧАНИЕ: В следующем разделе (этапы 1-3) описывается Протокол изоляции органоидов собак.

1. Подготовка к изоляции

1. Транспортные трубки: Перед выделением органоидов (обычно за 24 ч до этого) заполните коническую трубку объемом 50 мл 10 мл модифицированной смеси Dulbecco Eagle Medium/Nutrient Mix F-12 (Advanced DMEM/F12), обогащенной 0,2 мл стрептококка.
2. Для лапароскопической, инцизионной или эксцизионной биопсии подготовьте три дополнительные конические трубки по 50 мл. Заполните эти пробирки 10 мл полного хелатирующего раствора (1x CCS; см. таблицу 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для стадии 1.2 2 мМ N-ацетилцистеин (NAC) в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) также может быть использован в качестве традиционного раствора, используемого для сбора стволовых клеток. Не наблюдалось различий при использовании 1x CCS или NAC в PBS. Оба раствора добавляют для высвобождения клеток в растворе.
3. Держите трубки при температуре 4 °C в течение ночи и транспортируйте трубки на льду в течение оставшейся части протокола.
4. Подготовьте пять 15 мл центрифужных трубок с 5 мл 1x CCS, одну центрифужную трубку 15 мл с 3 мл 1x CCS, одну пустую 15 мл центрифужной трубки (надводная трубка) и одну центрифужную трубку 15 мл с 5 мл 1x CCS и 2 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вышесказанное может быть подготовлено до дня изоляции, если будет обработано несколько образцов. Для иллюстрации см. компоновку изоляционной трубки на рисунке 2.
5. В день изоляции приготовьте чашку Петри, скальпель, ведро со льдом и холодный Advanced DMEM/F12 в шкафу биобезопасности. Поместите необходимое количество 24-луночных пластин для культивирования клеток в инкубатор (37 °C; 5% атмосферы _CO2 ) для предварительного нагрева.
6. Поместите солюбилизированный внеклеточный мембранный матрикс (ECM; см. Таблицу материалов) на лед, чтобы начать таяние.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Погружение в лед защищает от быстрого оттаивания и помогает избежать затвердевания. Коробка наконечников пипеток может быть помещена в морозильную камеру, чтобы помочь в покрытии солюбилизированного ECM.
7. Предварить центрифугу до 4 °C.
8. Переместите полную среду с факторами роста «CMGF+» или «органоидные среды» (см. Таблицу 1 для состава) из морозильной камеры/холодильника на водяную баню с температурой 37 °C. Избегайте прямого воздействия света, когда это возможно.

Рисунок 2: Компоновка изоляционной трубы. Рекомендуемая установка для сбора тканей включает 10 мл Advanced DMEM/F12 и 0,2 мл стрептококка Pen в 50 мл центрифужной трубки. Кроме того, три трубки по 50 мл, заполненные 10 мл 1x CCS, необходимы для хирургических биопсий или некропсий. Рекомендуемая компоновка труб для этапов изоляции включает пять трубок, содержащих 5 мл из 1x CCS, которые будут использоваться на этапах промывки CCS. Первая трубка используется в качестве пробоотборника, содержащего измельченную ткань, а остальные трубки служат резервуарами 1x CCS для добавления в первую трубку. Шестая пробирка содержит 3 мл 1x CCS для промывки оставшейся ткани из пробирки при переносе на 6-луночную пластину. Эти шесть трубок будут использоваться до стадии инкубации ЭДТА. Пробирка с 5 мл 1x CCS и 2 мл FBS служит пробиркой для образца после инкубации ЭДТА, а супернатант из этой трубки переносится со стволовыми клетками в пустую трубку для остальной части изоляции. Держите трубки при температуре 4 °C до начала изоляции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

2. Сбор тканей

1. Кишечная эндоскопическая и лапароскопическая биопсии (диаметр 2,8 мм) может быть приобретена с помощью больших биопсийных щипцов. Соберите не менее восьми эндоскопических образцов на участок кишечника.
2. Соберите образцы непосредственно в транспортные трубы и поместите их на лед.
3. Для хирургических биопсий и некропсий собирают кусочки ткани размером 0,5 см х 0,5 см и помещают их в первую трубку 1x CCS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для биопсии кишечника удалите оставшееся кишечное содержимое и соскоблите слой слизистой скальпелем, чтобы удалить ворсинки. Если образцов много, дополнительные биопсии могут быть собраны в криовиалах, содержащих реагент для хранения РНК (1 мл) или парафиновый встроенный для будущего сравнения между органоидами и их тканью происхождения. В случае взятия биопсии для анализа ТЕА не соскребайте ворсинки и храните образец в консерванте (3% параформальдегида и 3% глутаральдегида в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS)) и храните при 4 °C.
4. Энергично встряхните трубку 1x CCS в течение ~ 30 с, а затем перенесите образец в новую трубку 1x CCS с помощью щипцов. Повторите этот процесс дважды.
5. Перенесите образец из последней 1-кратной трубки CCS в транспортную трубку (Advanced DMEM/F12 + Pen Strep) и верните образец в лабораторию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы, предварительно обработанные таким образом, также могут быть отправлены на ночь на льду (не отправляйте на сухом льду).

3. Изоляция органоидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните изоляцию с использованием асептических методов в шкафу биобезопасности. См. рисунок 3 для рабочего процесса изоляции органоидов собак.

1. Встряхните образец ткани в транспортной трубке в течение ~ 30 с и удалите избыток супернатанта до тех пор, пока в трубке не останется 0,5 мл, путем медленной пипетки вблизи поверхности жидкости. Убедитесь, что выбрасываются какие-либо ткани.
2. Перенесите ткань и оставшийся супернатант в стерильную чашку Петри. С помощью одноразового скальпеля (или стерилизованных щипцов и ножниц) разрежьте и измельчите ткань на более мелкие кусочки (размером 1 ^мм2), напоминающие консистенцию сусла, в течение примерно 5 минут.
3. Пипетка измельченной ткани жидкостью из чашки Петри в первую трубку CCS. Добавьте 2 мл Advanced DMEM/F12 в чашку Петри, промойте оставшуюся ткань и переложите в первую трубку CCS.
4. Вихрь 1x CCS трубки в течение 5 с примерно пять раз. Дайте биопсии осесть на дно пробирки объемом 15 мл (примерно 1 мин) и удалите супернатант до тех пор, пока в трубке не останется 5 мл. Перенесите 1x CCS из новой трубки в пробирку для образцов.
5. Повторите предыдущий шаг для следующих двух трубок. После двух последних промывок удалите супернатант до 3 мл, оставшихся в трубке.
6. Перенесите биопсию и 1x CCS из пробирки в одну лунку из 6-луночной пластины. Затем добавьте 3 мл 1x CCS в пробирку для образцов, аккуратно закрутите, чтобы собрать оставшуюся ткань, и переложите в тот же колодец пластины.
7. Добавьте 150 мкл 0,5 М ЭДТА (для достижения общего объема 6,15 мл в скважине). Поместите 6-луночную пластину на 20°, 24-об/мин нутирующий смеситель/коромысл при 4 °C. Инкубируют образцы печени в течение 10 мин и кишечные образцы в течение 1 ч на движущемся коромысле.
8. Транспортируйте 6-луночную пластину обратно в шкаф биобезопасности. Перенесите измельченную ткань и жидкость в 1x CCS /FBS пробирку и дайте тканям осесть. Транспортировать супернатант (эта часть теперь включает свободные стволовые клетки) и примерно 0,2 мл верхней части ткани в пустую трубку.
9. Открутите вниз трубку, содержащую образец (700 х г в течение 5 мин при 4 °C). Стволовые клетки теперь гранулируются вместе с измельченной тканью. Осторожно удалите и выбросьте супернатант, чтобы не потревожить гранулу.
10. Повторно суспендируйте гранулу в Advanced DMEM/F12 и снова открутите трубку (700 х г в течение 5 мин при 4 °C). Аспирируйте надосадочное вещество и не тревожите гранулу.
11. Рассчитайте объем солюбилизированного ECM, необходимого для посева диссоциированных клеток и тканей. Используйте 30 мкл солюбилизированного ECM на скважину 24-луночной пластины для достижения надлежащей плотности посева.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Встраивание образца после изоляции в 4-6 скважин 24-луночной пластины (т.е. на основе количества измельченной ткани в образце).
12. Добавьте расчетный объем солюбилизированного ECM в пробирку для образцов и медленно пипетку вверх и вниз, чтобы избежать образования пузырьков. Засейте суспензию в середине колодцев, чтобы солюбилизированный ECM мог образовать куполообразную структуру.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование наконечников пипеток из морозильной камеры -20 °C помогает в покрытии солюбилизированным ECM. Если куски ткани больше, чем наконечник пипетки P200, используйте широкие холодные наконечники или нарежьте холодные наконечники P1000, чтобы помочь в покрытии. Держите образец с солюбилизированным ECM на льду, когда это возможно.
13. Транспортируйте пластину в инкубатор (37 °C; 5% _co2 атмосфера) и дайте солюбилизированному ECM затвердеть в течение ~ 30 мин.
14. Смешать ингибитор ROCK и GSK3β в CMGF+ (концентрации в таблице 1). Добавьте 500 мкл этого раствора (CMGF+ R/G) в каждую лунку. Поместите пластину в инкубатор (37 °C; 5% _CO2 атмосферы).

Рисунок 3: Рабочий процесс изоляции органоидов собак. Собранный образец ткани переносится в чашку Петри и измельчается должным образом. Затем образец переносится в 1-кратную трубку CCS и выполняются этапы промывки. Для инкубации ЭДТА в 6-луночной пластине образец затем переносят в пробирку, содержащую 1x CCS и FBS. После того, как ткань осядет, надводное вещество с небольшим количеством ткани переносится в пустую трубку. Образец, следовательно, вращается, супернатант удаляется, а гранула повторно суспендируется в Advanced DMEM/F12. Трубка снова вращается, а супернатант аспирируется и выбрасывается. Солюбилизированный ECM добавляют в трубку, смешивают, и образец покрывают 24-луночной пластиной. Следовательно, пластину инкубируют (37 °C; 5% атмосферы _CO2 ) в течение 30 мин, а затем добавляют среду. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

ПРИМЕЧАНИЕ: В следующем разделе (шаги 4 и 5) описывается Протокол поддержания органоидов собак. Меняйте среду в соответствии с таблицей 2 и ежедневно проверяйте органоиды на наличие признаков апоптоза, загрязнения, перенаселенности и отслоения солюбилизированного ECM. Ежедневные заметки должны быть сделаны в соответствии с рисунком 4 для точного мониторинга условий и экспериментального воздействия на культуры. См. Дополнительную таблицу 1 для шаблона, позволяющего точно и воспроизводимо делать заметки, связанные с культурой органоидов. Для печеночных органоидов используйте CMGF+, усиленный ингибитором ROCK и GSK3β.

Рисунок 4: Руководство по размеру и плотности органоидов. (A) Диаграмма размеров органоидов для точного отслеживания роста органоидов. Руководство по размерам включает в себя сверхмалые (XS), малые (S), средние (M), большие (L) и очень большие (XL) категории. (B) Руководство по плотности состоит из категорий очень низкой плотности (VLD), низкой плотности (LD), средней плотности (MD), высокой плотности (HD) и очень высокой плотности (VHD). (C) Репрезентативные изображения бактериального и грибкового загрязнения образца органоида. (D) Репрезентативные изображения перенаселенности органоидов и апоптоза. Объективное увеличение указывается на каждой панели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рекомендация по изменению СМИ
Понедельник	Вторник	Среда	Четверг	Пятница	Суббота	Воскресенье
500 мкл	Н/Д	500 мкл	Н/Д	750 мкл	Н/Д	Н/Д

Таблица 2: Рекомендация об изменении средств массовой информации. Рекомендуемая временная шкала еженедельной смены СМИ. Среду (500 мкл CMGF+ для кишечных органоидов или 500 мкл CMGF+ R/G для печеночных органоидов) рекомендуется менять через день. Чтобы учесть дополнительные часы в выходные дни, 750 мкл мультимедиа добавляется в пятницу днем, а медиа обновляются в понедельник утром.

4. Очистка органоидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Очистка или пассаж органоидов должны выполняться регулярно для поддержания здоровья органоидной культуры. Выполняйте процедуру очистки всякий раз, когда замечен апоптоз в культуре, наличие мусора, переполненность органоидов или отслоение солюбилизированного ECM. Обратитесь к рисунку 4D.

1. Удалите среду из скважин при наклоне плиты, чтобы избежать разрушения солюбилизированного ECM.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если солюбилизированная отслойка ECM является значительной, рекомендуется перенести среду в трубку объемом 15 мл, чтобы избежать потери фрагментов солюбилизированного ECM, содержащего образец.
2. Добавьте 0,5 мл предварительно охлажденного Advanced DMEM/F12 в каждую скважину, чтобы растворить матричные купола путем повторного пипетирования с использованием наконечника P1000 (избегайте создания чрезмерных пузырьков). Перенесите органоидсодержащую растворенную матрицу в центрифужную трубку объемом 15 мл. Держите трубку на льду и, если объем ниже 6 мл, медленно заполните трубку Advanced DMEM / F12, чтобы достичь общего объема 6 мл.
3. Раскрутите тюбик (700 х г в течение 5 мин при 4 °C) и удалите весь супернатант, не потревожив гранулу.
4. Добавьте необходимый объем солюбилизированного ECM (30 мкл на лунку для достижения надлежащей плотности посева) и медленно повторно суспендируйте гранулу путем перемешивания пипетки. Обложите подвеску в середине 24-луночной плиты, чтобы сформировать купол.
5. Поместите пластину в инкубатор (37 °C; 5% атмосферы _CO2 ) на ~30 мин, а затем добавьте соответствующий объем среды (таблица 2).

5. Органоидная пассаж

ПРИМЕЧАНИЕ: Пассаж обычно выполняется через 5-7 дней после первоначальной культивирования для расширения клеточной линии органоида. Органоидные культуры обычно могут быть расширены в соотношении 1:3. Изображения здоровых культур, готовых к прохождению, можно увидеть на рисунке 4. Органоиды должны быть не менее среднего размера.

1. Выполните шаги с 4.1 по 4.3.
2. Удалите супернатант, оставив в пробирке 0,5 мл. Следите за тем, чтобы не потревожить гранулу.
3. Добавьте 0,5 мл трипсин-подобной протеазы (см. Таблицу материалов), правильно перемешайте путем аспирации с пипеткой и инкубируйте на водяной бане при температуре 37 °C (инкубируйте кишечные органоиды в течение 8 мин или печеночные органоиды в течение 10 мин). Продолжайте смешивать раствор, щелкнув трубкой несколько раз в середине инкубации.
4. Переместите пробирку, содержащую образец, обратно в шкаф биобезопасности и медленно добавьте 6 мл предварительно охлажденного Advanced DMEM / F12, чтобы инактивировать трипсин-подобную протеазу и остановить диссоциацию клеток.
5. Раскрутите тюбик (700 х г в течение 5 мин при 4 °C) и удалите супернатант. Следите за тем, чтобы не потревожить гранулу.
6. Выполните шаги 4.4. и 4.5.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В следующем разделе (этапы 6-9) описывается протокол извлечения органоидов и биобанкинга. Органоидные культуры должны быть свободны от ткани, которая была удалена во время предыдущих проходов. Культуры также должны быть здоровыми, по крайней мере, большими по размеру и средними и высокими по плотности. Изображения здоровых культур, готовых к последующим приложениям, можно увидеть на рисунке 4. Движение вниз по течению с сохранением и сбором неоптимальных органоидных культур может негативно повлиять на результаты характеристики и жизнеспособность биобанка. Просмотрите рекомендуемую схему плит с 24 скважинами на рисунке 5.

Рисунок 5: Рекомендуемая схема плит на 24 скважины. Рекомендуемая компоновка 24-луночной пластины для базовой характеристики после расширения органоидной культуры. Парафин-встраивание шести лунок (средних и крупных органоидов средней и высокой плотности) обычно позволяет обеспечить высокую концентрацию органоидов в гистологическом блоке. Четыре скважины органоидов могут быть объединены в одну криовиальную с реагентом для хранения РНК для последующих применений. Четырнадцать скважин используются для биобанкинга образцов органоидов и обеспечивают материалом до семи криоконсервированных флаконов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

6. Фиксация органоидов

1. Удалите среду из колодца и убедитесь, что не нарушается солюбилизированный купол ECM.
2. Добавьте 500 мкл раствора формалин-уксусная кислота-спирт, служащий фиксатором (FAA; композиция в таблице 1).
3. Хранят органоиды при комнатной температуре. Через 24 ч аспирировать FAA и заполнить лунку 70% этанолом. Оберните пластины лабораторной гибкой пленочной лентой (см. Таблицу материалов), чтобы избежать быстрого испарения. Органоиды теперь готовы к встраиванию парафина. Парафин-встраивание органоидной культуры выполняется в традиционные формы на основе металла.

7. Сохранение РНК

1. Удалите среду из колодцев и убедитесь, что они не нарушают солюбилизированный купол ECM.
2. Используйте 0,5 мл предварительно охлажденного Advanced DMEM/F12 на скважину для растворения солюбилизированных куполов ECM путем многократного пипетирования вверх и вниз (избегайте создания чрезмерных пузырьков). Перенесите органоиды в центрифужную трубку объемом 15 мл. Держите трубку на льду и, если объем ниже 6 мл, медленно заполните трубку Advanced DMEM / F12, чтобы достичь 6 мл общего объема.
3. Раскрутите тюбик (700 х г в течение 5 мин при 4 °C) и удалите все супернатанты. Следите за тем, чтобы не потревожить гранулу.
4. Добавьте 100 мкл PBS в пробирку для образцов и повторно суспендируйте гранулу путем бережного пипетирования. Перенесите содержимое пробирки в криовиальную.
5. Добавьте 900 мкл реагента для хранения РНК (см. Таблицу материалов) в пробирку и перемешайте для сбора оставшихся органоидов. Перенесите эти остаточные органоиды в криовиальный и храните их при -80 °C (обычно четырех скважин, объединенных в одну криовиальную, будет достаточно для последующих применений, включая qPCR и секвенирование РНК).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Один криовиал обычно производит в общей сложности 4000 нг РНК (измеренных с помощью спектрофотометрического анализа).

8. Органоидный биобанкинг

ПРИМЕЧАНИЕ: Биобанкинг обычно происходит через 3-4 дня после прохождения. Признаки апоптоза не должны присутствовать в культуре для выполнения этого метода. Обратитесь к рисунку 4 для ссылки на размер и плотность, подходящие для замораживания. Биобанк средних и сверхбольших органоидов со средней и очень высокой плотностью. Этап экстренного замораживания может быть выполнен, если линия органоидных клеток особенно редка или дальнейшая жизнеспособность не гарантируется. Выполните те же действия для нормального органоидного биобанкинга (шаги с 8.1 по 8.4). Экстренная заморозка проводится с меньшими и менее плотными культурами. Объедините столько колодцев с растущими органоидами в один криовиал, следуя шагам с 8.1 по 8.4. Имейте в виду, что достаточное количество органоидов должно поддерживаться в живых в попытке расширить культуру (экстренное замораживание - это просто резервная процедура для защиты от возможной потери культуры в результате загрязнения или других неожиданных событий).

1. Выполните шаги с 7.1 по 7.3.
2. Добавьте в пробирку 1 мл морозильной среды на криовиал (композиция в таблице 1) и осторожно повторно суспендируйте гранулу путем пипетки вверх и вниз.
3. Переложить 1 мл раствора в один криовиал (соотношение две скважины/криовиал) и держать криовиалы на льду.
4. Переложите криовиалы изо льда в морозильную емкость (регулярно заправляйте резервуар изопропанолом) и сразу же переведите на -80 °C. Переместите образцы в жидкий азот (-196 °C) для длительного хранения через 24 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вместо традиционного можно также использовать безалкогольный контейнер для замораживания клеток. Убедитесь, что образцы не оттаивают во время транспортировки от -80 °C до длительного хранения жидкого азота. Повторное размораживание снижает жизнеспособность клеточной культуры.

9. Возрождение от хранения жидкого азота

ПРИМЕЧАНИЕ: При выборе размораживания органоидной линии подмножество возрожденных органоидов должно быть рефрозенозено и заменено в биобанке как можно быстрее по меньшей мере одним (предпочтительно более) криовиалом.

1. Поместите солюбилизированный ECM на лед для медленного оттаивания, поместите 24-луночную пластину в инкубатор (37 ° C; 5% атмосферы _CO2 ) и подготовьте необходимые реагенты, такие как трубка 15 мл и Advanced DMEM / F12.
2. Извлеките криовиал, содержащий органоидный образец, из хранилища жидкого азота и немедленно перенесите его в тепловую ванну (37 °C) в течение 2 мин.
3. Перенесите содержимое криовиала в центрифужную трубку объемом 15 мл в шкаф биобезопасности. Медленно добавляйте предварительно охлажденный Advanced DMEM/F12, чтобы достичь общего объема 6 мл.
4. Раскрутите трубку (700 х г в течение 5 мин при 4 °C). Удалите супернатант и убедитесь, что не потревожили гранулу.
5. Добавьте 180 мкл (30 мкл на лунку) солюбилизированного ECM к грануле и поместите эту суспензию в предварительно нагретую 24-луночную пластину. Один криовиал может быть покрыт шестью скважинами из 24 скважин.
6. Поместите 24-луночную пластину в инкубатор (37 °C; 5% атмосферы _CO2 ) на ~30 мин и добавьте CMGF+ R/G (для кишечных органоидов переключитесь на CMGF+ через 24-48 ч).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Когда образец покрыт и растет в 24-луночной плите, ему должно быть позволено восстановиться в течение не менее 2 дней перед прохождением, чтобы повысить жизнеспособность.

Результаты

Протокол органоидов собак обычно генерирует от ~ 50 000 до ~ 150 000 клеток кишечника или печени на лунку 24-луночной пластины. Репрезентативные органоиды можно увидеть на рисунке 6.

Рисунок 6: Репрезентативные изображения собачьих органоидов. Изображены изображения органоидов, выделенных с помощью этого протокола. (А,Б) Кишечные органоиды, полученные из двенадцатиперстной кишки (взяты при 10-кратном и 5-кратном объективном увеличении). Обратите внимание на наличие более старых баддированных органоидов и более молодых сфероидов. (С,Г) Собачьи энтероиды из нижней части тощей кишки (взяты при 10-кратном и 20-кратном объективном увеличении). (Э,Ф) Подвздошные энтероиды (взятые при 20-кратном и 5-кратном объективном увеличении) и (G,H) колоноиды (взятые при 10-кратном объективном увеличении). (I) Репрезентативное изображение печеночных органоидов, сделанное при 20-кратном объективном увеличении. Большинство органоидов находятся в своей почковой форме. На снимке также можно увидеть более молодых печеночных сфероидов. (J) Репрезентативное изображение, показывающее редкопеченочный органоид, который образует протоковую структуру (взятую при 10-кратном объективном увеличении). Шкала (500 мкм) присутствует в левом верхнем углу каждого изображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Энтероиды и колоноиды, полученные с использованием этого протокола, были ранее охарактеризованы Chandra et al. в ^{201912 году}. Кишечные органоиды собак состоят из регулярной клеточной популяции кишечного эпителия. Использование гибридизации РНК in situ , экспрессия биомаркеров стволовых клеток (leucine-Rich Repeat Containing G Protein-Coupled Receptor 5 - LGR5 и SRY-Box Transcription Factor 9 - SOX9), биомаркера клеток Paneth (рецептор Ephrin типа B 2 - EPHB2), абсорбирующих эпителиальных клеточных маркеров (щелочная фосфатаза - ALP) и энтероэндокринного маркера (Neurogenin-3 - Neuro G3)¹² было подтверждено. Окрашивание Alcian Blue проводилось на парафиновых слайдах для подтверждения наличия клеток Кубка. Кроме того, для подтверждения метаболической активности органоидов были выполнены функциональные анализы, такие как оптическая метаболическая визуализация (OMI) или трансмембранный регулятор проводимости муковисцидоза (CFTR), для подтверждения метаболической активности органоидов. Органоиды собак с диагнозом воспалительного заболевания кишечника, стромальных опухолей желудочно-кишечного тракта (GIST) или колоректальной аденокарциномы также были выделены с использованием этого ^{протокола12}.

После выделения стволовых клеток органоиды печеночных собак начинают свой жизненный цикл как расширяющиеся сфероиды, а через ~ 7 дней они превращаются в почковые и дифференцирующие органоиды. Сфероиды печени собак, выделенные и культивируемые в соответствии с этим протоколом, были измерены для количественной оценки их роста и определения идеального времени для прохождения. Сфероиды, полученные из лапароскопической биопсии печени здоровых взрослых собак (n = 7), были измерены в течение первых 7 дней культивирования. Были сделаны репрезентативные снимки, и продольный (a) и диагональный (b) радиус сфероидов (n = 845) был измерен по всей культуре. Были рассчитаны объем (V), площадь поверхности (P), площадь эллипса 2D (A) и окружность (C) сфероидов. Расчеты и результаты эксперимента обобщены на рисунке 7. Площадь и окружность 2D-эллипса использовались для оценки здоровья органоидной культуры с помощью световой микроскопии. Эти ценности могут служить руководством для принятия решений о поддержании культуры.

Короче говоря, сфероиды быстро расширялись по объему, площади поверхности, площади 2D-эллипса и окружности. Данные измерений семи биглей были усреднены для следующих расчетов. Объем увеличился на 479% (±6%) со 2 по 3 день. В то же время площадь сфероидной поверхности и площадь 2D-эллипса увеличились на 211% (±208%) и 209% (±198%) соответственно. Окружность 2D эллипса увеличилась со 2-го по 3-й день на 73% (±57%). Увеличение общего объема печеночных органоидов со 2-7 дней составило более 365 раз, площадь поверхности и площадь 2D эллипса увеличились в 49 раз, а окружность 2D эллипса увеличилась в шесть раз.

Затем сфероиды, полученные из двух образцов взрослых собак, дополнительно выращивались после прохождения и собирались каждый день (день 2-7) для гибридизации РНК in situ (РНК ISH). Были разработаны собачьи зонды (список зондов приведен в виде дополнительной таблицы 2), а экспрессия мРНК оценивалась для маркеров стволовых клеток (LGR5), маркеров, специфичных для холангиоцитов (цитокератин 7 - KRT-7 и аквапорин 1 - AQP1), а также маркеров гепатоцитов (белок вилочной коробки A1 - FOXA1; и цитохром P450 3A12 - CYP3A12). Экспрессия маркеров оценивалась полуколичественным способом (репрезентативные изображения на рисунке 8). Сфероиды преимущественно экспрессировали холангиоцитарный маркер КРТ-7 в диапазоне от 1% до 26% в сигнальной площади/общей площади клеток. AQP1 не экспрессировался в образцах органоидов, возможно, потому, что его присутствие в образцах печени собак редкое. Экспрессия маркера стволовых клеток (LGR5) варьировалась от 0,17% до 0,78%, в то время как маркеры гепатоцитов экспрессировались в меньшей степени на уровне 0,05%-0,34% для FOXA1 и 0,03%-0,28% для CYP3A12.

Рисунок 7: Измерения печеночных сфероидов. (А) Рост сфероидов печени наблюдался каждый день культур со 2-7-го дня. Сфероиды впервые сформировались на 2-й день, а последние сфероиды начали процесс бутонизации на 7-й день. В последующем эксперименте использовались две линии органоидов собак после прохождения для сбора сфероидов каждый день для встраивания парафина для выполнения РНК ISH (изображение 2-го дня было получено в 40 раз, изображение 6-го дня в 10-кратном увеличении, а остальные изображения были сделаны с 20-кратным увеличением). (B) Показан печеночный сфероидный кластер, прикрепленный к куску ткани, встроенному в солюбилизированный ECM через 4 дня после выделения. Были измерены продольные и диагональные радиусы сфероидов (изображение сделано в 10 раз). На панели (C) изображена формула, используемая для расчетов для получения объема (V), площади поверхности (P), площади 2D-эллипса (A) и окружности (C). Для этих расчетов предполагалось, что собачьи печеночные сфероиды являются идеальными сфероидами. Результаты измерений объема печеночных сфероидов, площади поверхности, площади 2D эллипса и окружности 2D эллипса для отдельных дней роста изображены на панели (D). Полосы погрешностей представляют стандартную погрешность среднего значения (SEM). (E) экспрессия мРНК KRT-7, LGR5, FOXA1 и CYP3A12 была измерена в образцах собачьих печеночных сфероидов после прохождения со 2-го по 7-й день. AQP1 не был выражен в этих образцах. Шкала (5x: 500 мкм; 10x: 200 мкм; 20x: 100 мкм; 40x: 50 мкм) присутствует в левом верхнем углу каждого изображения. Отмечено объективное увеличение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Органоиды редко не распадаются во время процесса пассирования в соответствии с этой стандартизированной техникой. Если диссоциация не происходит, время прохождения может быть скорректировано для достижения оптимальной дезинтеграции клеточного кластера. Однако длительное воздействие трипсин-подобной протеазы может негативно повлиять на рост органоидов. Печеночные органоиды были использованы в последующем эксперименте для исследования оптимального времени диссоциации и установления правильного метода пассирования. Вкратце, печеночные органоиды от двух здоровых собак (по 6 хорошо реплицированных каждая) проходили с трипсин-подобной протеазой в течение 12 мин и 24 мин. Образцы перемешивали каждые 6 минут. В конце временной точки диссоциации в раствор добавляли 6 мл ледяного Advanced DMEM/F12 и вращали образцы (700 х г в течение 5 мин при 4 °C). Супернатант (Advanced DMEM/F12 с разбавленной трипсин-подобной протеазой) удаляли, а гранулы внедряли в солюбилизированный ECM, как описано выше (этапы 4.4-4.5). После 12 ч культивирования в солюбилизированных ECM и CMGF+ R/G различия наблюдались в обоих образцах. 12-минутная инкубация с трипсин-подобной протеазой не ингибировала рост органоидов. Однако на рост органоидов негативно повлияли (см. Рисунок 9) с использованием 24-минутной инкубации.

Рисунок 9: Эксперимент по прохождению органоидов по печеночной железе у собак. Репрезентативные изображения органоидов, полученные от двух собак (D_1 и D_2), пройденные с использованием трипсин-подобного метода инкубации протеазы в течение 12 мин или 24 мин. Контрольные образцы проходили с трипсин-подобной протеазой в течение 10 мин. Шкала (мкм) присутствует в левом верхнем углу каждого изображения и представляет собой 500 мкм (5-кратное увеличение объектива). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Далее было проведено исследование живучести собачьих печеночных органоидов, полученных из этого протокола, в неблагоприятной среде (лишение структурной поддержки и питания). Исследование было сосредоточено на определении объема органоидных сред и фундаментной матрицы, необходимых для успешного роста и выживания печеночных органоидов, а также на установлении влияния таких условий на органоидную культуру. Живучесть измеряли в 96-луночной пластине с ограниченным количеством органоидов. Органоиды двух собак проходили, как описано выше, и встраивали (12 реплик) в разные объемы солюбилизированного ECM (10 мкл или 15 мкл). Клетки были покрыты в концентрации 400 клеток/10 мкл и 600 клеток/15 мкл, что соответствует 40 000 клеток/мл. Два типа сред (CMGF+, или CMGF+ R/G) добавляли в разных объемах (25 мкл, 30 мкл или 35 мкл). Средства массовой информации никогда не менялись, и никаких процедур технического обслуживания не проводилось. Живучесть органоидов контролировалась каждый день. Органоидная смерть определялась как растворение более 50% органоидных структур. Выживаемость органоидов в этих условиях варьировалась от 12,9 (±2,3) дней до 18 (±1,5) дней, а результаты обобщены в таблице 3. Два образца, которые выжили дольше всего, были органоидами, полученными от собак, встроенных в 15 мкл солюбилизированного ECM и 30 мкл среды CMGF +. Оба образца были встроены в солюбилизированный ECM (30 мкл) и свежие среды (500 мкл) в стандартную 24-луночную пластину после 18 дней депривации, чтобы гарантировать, что расширение органоидов все еще возможно (рисунок 10).

	Тип носителя	Среднее (уцелевшие дни)	Медиана	КНВ%	Среднее (уцелевшие дни)	Медиана	КНВ%	Среднее (уцелевшие дни)	Медиана	КНВ%	Среднее (уцелевшие дни)	Медиана	КНВ%
Носитель (мкл)		30			25			35			30
ECM (мкл)		10			10			10			15
D_1	CMGF+ R/G	12.50	13	11.57	12.83	13	4.50	11.83	11.5	12.91	12.08	13	12.46
	CMGF+	17.08	17	16.26	18.50	19	4.89	18.42	19	14.54	17.82	19	8.99
D_2	CMGF+ R/G	13.67	14	13.36	13.00	13	12.70	14.00	14.5	17.23	13.08	13	8.90
	CMGF+	15.50	15	18.56	17.50	18	10.48	17.50	19	20.89	17.00	17	14.41
ИТОГ	CMGF+ R/G	13.08	13	13.13	12.92	13	9.39	12.92	13	17.52	12.58	13	11.22
	CMGF+	16.29	16.5	17.69	18.00	18.5	8.35	17.96	19	17.65	17.43	17	11.70
	смерть = более 50% массы органоидов нежизнеспособны

Таблица 3: Результаты эксперимента по живучести. Эксперимент был основан на лишении структурной поддержки или питания двух органоидных культур. Результаты включают среднее, медианное и стандартное отклонение (CV%) индивидуальных концентраций солюбилизированных ECM и сред у отдельных собак.

Рисунок 10: Органоидная пищевая и структурная депривация. Органоиды были перекрыты в 24-луночные пластины, чтобы подтвердить способность к расширению после депривации (А). Репрезентативные изображения с 4-го и 7-го дня после повторного покрытия показывают расширение органоидов, подтверждая способность визуально идентифицировать жизнеспособные органоиды (изображения делаются при 5-кратном объективном увеличении). Репрезентативные изображения органоидов, считающихся живыми или мертвыми, видны в (B). Снимки делаются с 5-кратным объективным увеличением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 8: Репрезентативные изображения гибридизации РНК in situ печеночных сфероидов. Репрезентативные изображения маркеров LGR5, KRT7, FOXA1 и CYP3A12 были получены при 60-кратном объективном увеличении образцов со 2-7-го дня после прохождения. Положительные молекулы мРНК окрашиваются в красный цвет. AQP1 не был выражен в образцах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Неполный состав хелатирующего раствора (ICS)	Конечная концентрация
500 мл H2O	Н.А.
2,49 г Na2HPO4-2H2O	4,98 мг/мл
2,7 г KH2PO4	5,4 мг/мл
14 г NaCl	28 мг/мл
0,3 г KCl	0,6 мг/мл
37,5 г сахарозы	75 мг/мл
25 г D-сорбита	50 мг/мл
Состав полного хелатирующего раствора (CCS)	V/V % или конечная концентрация
Неполный хелатный раствор	20%
Стерильный H2O	80%
Диднавиация	520 мкМ
Стрептококковое перо	Ручка: 196 U/ml; Стрептококк 196 мкг/мл
Состав органоидных сред	Конечная концентрация
Усовершенствованный DMEM/F12	Н.А.
ФБС	8%
Глутамакс	2 мМ
ХЕПЕС	10 мМ
Примоцин	100 мкг/мл
Добавка B27	в 1 раз
Добавка N2	в 1 раз
N-ацетил-L-цистеин	1 мМ
Мурин EGF	50 нг/мл
Мурин Ноггин	100 нг/мл
Человек R-Спондин-1	500 нг/мл
Мурин Wnt-3a	100 нг/мл
[Leu15]-Гастрин I человек	10 нМ
Никотинамид	10 мМ
А-83-01	500 нМ
SB202190 (ингибитор P38)	10 мкМ
ТМС (триметоприм сульфаметоксазол)	10 мкг/мл
Дополнительные компоненты	Конечная концентрация
Ингибитор ROCK (Y-27632)	10 мкМ
Стемолекул CHIR99021 (GSK3β)	2,5 мкМ
Состав морозильной среды	V/V процент
Органоидные среды и ингибитор ROCK	50%
ФБС	40%
Диметилсульфоксид (ДМСО)	10%
Состав FAA	V/V процент
Этанол (100%)	50%
Уксусная кислота, ледниковая	5%
Формальдегид (37%)	10%
Дистиллированная вода	35%

Таблица 1: Состав растворов и сред. Перечень компонентов и концентраций неполных и полных хелатирующих растворов, CMGF+ (органоидные среды), морозильных сред и FAA.

Дополнительная таблица 1: Шаблон по уходу за органоидами. Этот шаблон позволяет точно и воспроизводимо записывать органоиды для каждого дня. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительная таблица 2: Зонды гибридизации РНК in situ. Список зондов, специально разработанных для мишеней мРНК собак производителем технологии для выполнения метода гибридизации РНК in situ. Перечисляются сведения о значимости отдельных маркеров, наименовании зонда, его референсном номере, целевом регионе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Обсуждение

В настоящее время отсутствуют стандартизированные протоколы для выделения и поддержания собачьих печеночных и кишечных органоидов. Установление стандартных операционных процедур для органоидных культур является оправданным для того, чтобы эта модель была применима в различных лабораторных условиях. В частности, предоставление стандартизированных рабочих протоколов для культивирования этих собачьих органоидных моделей является ключом к характеристике нормального роста органоидов во время культивирования и прохождения для получения оптимальных временных точек для расширения и поддержания. Органоиды кишечника собак, культивируемые с использованием протокола, ранее характеризовались Chandra et ^al.12.

Одним из наиболее важных шагов протокола является прохождение органоидов. Оптимальное время для первого прохождения печеночных сфероидов было определено на 7 день после выделения на основе измерений печеночных сфероидов. Максимальный объем сфероидов был достигнут к 7 дню, и в это же время сфероиды начали бутонироваться и образовали печеночные органоиды. Увеличение общего объема органоидов со 2-7 дня после выделения составило более 365 раз, что говорит о том, что оптимальное время прохождения дольше, чем у кишечных органоидных культур. После 7 дней в культуре не наблюдалось грубых признаков клеточного апоптоза в печеночном сфероиде даже без очистки или пассирования (рисунок 7). Прохождение кишечных и печеночных органоидов может быть сложной задачей, поскольку процедура может привести к потере клеток и изменению жизнеспособности. Результаты свидетельствуют о том, что длительная инкубация печеночных органоидов трипсин-подобной протеазой (до 12 мин) не оказывает негативного влияния на субкультуру. Инкубация органоидов в трипсин-подобной протеазе в течение более 24 мин может нанести ущерб последующей субкультуре органоидов.

В случае субоптимального разрушения в клеточных кластерах с органоидным проходом, механическая диссоциация вместо длительной инкубации с трипсин-подобной протеазой может быть более полезной. Если возникают проблемы с надлежащей диссоциацией органоидов, может быть предпринята попытка кратковременного вихря образцов для повышения выхода прохода. С другой стороны, вихрь может разрушить культуру и повредить клетки, поэтому его следует использовать только тогда, когда другие процедуры неоднократно терпели неудачу. Разрушение печеночных органоидов на отдельные клетки снижает скорость роста органоидов, в то время как разбивание их на кластеры клеток может значительно улучшить их жизнеспособность. Десять минут было выбрано в качестве инкубационного времени для органоидного протокола. 12-минутная инкубационная точка считалась нецитотоксичной по сравнению с 24-минутной инкубацией в эксперименте с трипсин-подобной протеазой.

Эксперимент по живучести подтвердил, что собачьи печеночные органоиды могут выживать до 19,5 дней в неблагоприятных условиях (структурное и пищевое истощение). Органоиды, которые пережили эти условия дольше всего, культивировались средой CMGF+. Это наблюдение, возможно, было вызвано более медленным ростом печеночных органоидов в средах, не дополненных ингибитором Rock и GSK3β. Органоидные культуры с CMGF + R / G росли быстрее и, возможно, быстрее истощали свои ресурсы. Этот эксперимент открывает возможности миниатюризации собачьей органоидной культуры для достижения высокопроизводительного преобразования системы. Такая технология показывает потенциал для облегчения открытия лекарств или токсикологических исследований при значительно сниженных затратах.

Некоторые распространенные проблемы, возникающие во время поддержания культуры органоидов собак, - это неправильное затвердевание образца при покрытии, загрязнение культуры и установление надлежащей плотности и размера органоидов. Если солюбилизированный ECM преждевременно затвердевает во время покрытия, немедленно поместите его на лед на 10 минут. Если солюбилизированный ECM не образует куполообразных структур, вполне вероятно, что из образца было удалено недостаточно сред. Если это так, разбавьте образец более солюбилизированным ECM до тех пор, пока не образуются купола.

Когда грибковое или бактериальное загрязнение обнаружено во всей пластине (см. Рисунок 4), лучшим решением является выброс пластины. Лечение противогрибковыми или антибиотическими препаратами можно попробовать, но успех такой попытки крайне низок. Если одна скважина загрязнена плитой, жизнеспособные и незатронутые скважины могут быть очищены (выполните шаги 4.1-4.5) на новой плите и тщательно контролироваться. Если образец уже был заморожен в экстренном порядке, рекомендуется выбросить весь образец, так как размораживание образца подвергает инкубатор дополнительному риску загрязнения.

Здоровая органоидная культура должна быть, по крайней мере, в категории среднего размера и средней плотности или больше. Оптимальная плотность имеет решающее значение для роста органоидной культуры. Более низкая плотность должна быть скорректирована путем очистки органоидов до средней плотности. Если возникает ситуация экстремальной плотности (перенаселенность), органоиды следует расширить до большего количества скважин. Грубые признаки клеточного апоптоза часто сопровождают как перенаселенность, так и низкую плотность органоидной культуры. Если эти проблемы не будут исправлены вовремя, вся органоидная культура превратится в апоптотическую в течение нескольких дней. Если органоиды достигают очень большого размера или очень высокой плотности, культуру следует использовать для эксперимента, замораживания или фиксации.

Органоидная среда в настоящее время содержит 17 компонентов, и поэтому добавление факторов роста, необходимых для поддержания и расширения органоидов, может быть дорогостоящим. Эта проблема может быть решена путем выращивания 2D-клеточных культур, которые синтезируют факторы роста для получения условного CMGF+. Клеточная культура L-WRN продуцирует факторы роста Wnt-3a, R-Spondin-3 и ^Noggin37. Клеточная колония использует 90% DMEM/F12 и 10% питательных сред FBS. Когда культура достигает 90-процентного слияния, среду собирают каждый день в течение 1 недели. Собранную среду затем смешивают с 2x CMGF+ (без этих факторов роста). В то время как 2D-культуры могут производить необходимые факторы роста за небольшую часть стоимости, необходимо ожидать дополнительного времени и подготовки к производству среды. Концентрации факторов роста между партиями условных сред также могут ^{различаться37,38}.

Органоидные культуры взрослых собак, полученные из стволовых клеток, являются уникальной биомедицинской моделью, которая может помочь в достижении целей инициативы «Единое здоровье»³⁹. Органоидная технология может быть использована во многих областях фундаментальных и биомедицинских исследований, охватывающих от биологии развития, патофизиологии, открытия и тестирования лекарств, токсикологии до изучения инфекционных заболеваний и регенеративной ^{медицины40}. Трансляционные и обратные трансляционные исследования являются областями, в которых применимы собачьи ^{органоиды15}. Собаки веками использовались в трансляционных экспериментальных условиях, и их статус животного-компаньона также облегчил их положение как одного из наиболее изученных видов в ветеринарии.

В заключение, эта рукопись содержит стандартизированные операционные протоколы для выделения, обслуживания, сбора и биобанкинга собачьих печеночных и кишечных органоидов, чтобы облегчить применение этой модели в различных биомедицинских областях. Эта модель уникально подходит для содействия обратным трансляционным исследованиям в качестве инструмента инициативы «Единое здоровье» для содействия меж- и внутридисциплинарному обмену знаниями.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chelating solution
D-Sorbitol	Fisher Chemical	BP439-500
DTT	Promega	V3151
KCl	Fisher Chemical	P217-500
KH2PO4	Sigma	P5655-100G
Na2HPO4-2H2O	Sigma	S5136-100G
NaCl	Fisher Chemical	S271-500
Pen Strep	Gibco	15140-122
Sucrose	Fisher Chemical	S5-500
Organoid media
[Leu15]-Gastrin I human	Sigma	G9145-.5MG
A-83-01	PeproTech	9094360
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634-010
B27 supplement	Gibco	17504-044
FBS	Corning	35-010-CV
Glutamax	Gibco	35050-061
HEPES	VWR Life Science	J848-500ML
Human R-Spondin-1	PeproTech	120-38-500UG
Murine EGF	PeproTech	315-09-1MG
Murine Noggin	PeproTech	250-38-250UG
Murine Wnt-3a	PeproTech	315-20-10UG
N2 supplement	Gibco	17502-048
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma	A9165-25G
Nicotinamide	Sigma	N0636-100G
Primocin	InvivoGen	ant-pm-1
ROCK inhibitor (Y-27632)	EMD Millipore Corp.	SCM 075
SB202190 (P38 inhibitor)	Sigma	S7067-25MG
Stemolecule CHIR99021 (GSK3β)	Reprocell	04-0004-base
Trimethoprim	Sigma	T7883-5G
Sulfamethoxazole	Sigma-Aldrich	S7507-10G
Reagents
Acetic Acid, Glacial	Fisher Chemical	A38-500
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Fisher Chemicals	D128-500
EDTA, pH 8.0, 0.5 M	Invitrogen	15575-038
Formaldehyde (37%)	Fisher Chemical	F79P-4
Glutaraldehyde solution	Sigma	G5882
Matrigel Matrix For Organoid Culture	Corning	356255	Extracellular Membrane Matrix
Paraformaldehyde, 97%	Alfa Aesar	A11313
PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline)	Corning	21-040-CM
PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline)	Corning	21-040-CM
RNAlater Soln.	Invitrogen	AM7021	RNA Storage Reagent
TrypLE Express	Gibco	12604-021	Trypsin-like Protease
Other
6 Well Cell Culture Plate	Corning	3516
ACD Hybez II Hybridization System	ACD a biotechne brand	321710
Centrifuge Tube, 15 mL	Corning	430766
CoolCell LX	Corning	BCS-405MC
Cryogenic Vials	Corning	430488
Disposable Centrifuge Tube (50 mL)	Fisherbrand	05-539-13
GyroMini Nutating mixer (Rocker)	Labnet	S0500-230V-EU
Heat Bath	Lab-Line Instruments	3000
Mr. Frosty Freezing Container	ThermoFisher Scientific	5100-0001
NanoDrop 2000	ThermoFisher Scientific	ND2000CLAPTOP	SpectrophotometerAnalysis
Panasonic incubator	Panasonic	MCO-170ML-PA
Parafilm M Wrapping Film	Bemis Company Inc	PM996/EMD	Laboratory Flexible Film Tape
Protected Disposable Scalpels	Bard-Parker	239844
RNAscope 2.5 HD Assay – RED	ACD a biotechne brand	322350
RNAscope H2O2 & Protease Plus Reagents	ACD a biotechne brand	322330
RNAscope Target Retrieval Reagents	ACD a biotechne brand	322000
RNAscope Wash Buffer Reagents	ACD a biotechne brand	310091
Tissue Culture Dish	Dot Scientific	6676621
Tissue Culture Plate 24 wells	Fisherbrand	FB012929