Modelo de Epilepsia de Etiologia Infecciosa utilizando o Vírus da Encefalomielite Murina de Theiler

Resumo

A infecção intracerebral com o vírus da encefalomielite murina de Theiler (TMEV) em camundongos C57BL/6 replica muitos dos sintomas clínicos iniciais e crônicos da encefalite viral e subsequente epilepsia em pacientes humanos. Este artigo descreve a infecção viral, sintomas e histopatologia do modelo TMEV.

Resumo

Uma das principais causas de epilepsia é uma infecção do sistema nervoso central (SNC); Aproximadamente 8% dos pacientes que sobrevivem a essa infecção desenvolvem epilepsia como consequência, sendo as taxas significativamente mais altas em países menos desenvolvidos economicamente. Este trabalho fornece uma visão geral da modelagem da epilepsia de etiologia infecciosa e seu uso como plataforma para novos testes de compostos anticonvulsivantes. Um protocolo de indução de epilepsia por injeção intracerebral não estereotáxica do vírus da encefalomielite murina de Theiler (TMEV) em camundongos C57BL/6 é apresentado, o qual replica muitos dos sintomas clínicos iniciais e crônicos da encefalite viral e subsequente epilepsia em pacientes humanos. A avaliação clínica de camundongos durante a encefalite para monitorar a atividade convulsiva e detectar os potenciais efeitos anticonvulsivantes de novos compostos é descrita. Além disso, são mostradas consequências histopatológicas de encefalite viral e convulsões, como dano hipocampal e neuroinflamação, bem como consequências a longo prazo, como crises epilépticas espontâneas. O modelo TMEV é uma das primeiras plataformas experimentais translacionais, orientadas por infecção, para permitir a investigação dos mecanismos de desenvolvimento de epilepsia como consequência da infecção do SNC. Assim, também serve para identificar potenciais alvos terapêuticos e compostos para pacientes em risco de desenvolver epilepsia após uma infecção do SNC.

Introdução

Uma das consequências frequentes da encefalite viral são as crises epilépticas. Muitas infecções virais desencadeiam convulsões sintomáticas durante a fase aguda da infecção; O risco dessas crises é aumentado em mais de 20% no público em geral ^1,2,3. Pacientes que sobrevivem à infecção também têm um risco aumentado de 4%-20% de desenvolver epilepsia crônica nos meses a anos após a infecção ^1,4. O vírus da encefalomielite murina de Theiler (TMEV) foi identificado como um vírus adequado para o estudo de convulsões agudas e crônicas em um modelo murino de encefalite viral ^5,6,7. O TMEV é um vírus de RNA de fita simples, não envelopado, de sentido positivo, da família Picornaviridae e tem sido tradicionalmente usado para estudar a desmielinização na medula espinhal de camundongos SJL, dos quais os camundongos C57BL/6 (B6) estão protegidos porque têm a capacidade de eliminar o vírus rapidamente após a infecção. No entanto, o TMEV induz convulsões agudas em 50%-75% dos camundongos B6 machos e fêmeas na primeira semana pós-infecção (pi), enquanto cerca de 25%-40% desenvolvem epilepsia crônica semanas a meses pi 2,5,6,8,9. Além das crises, os camundongos também apresentam a histopatologia comum de hipocampo epiléptico com neurodegeneração e gliose5,6,8,10,11,12. Além disso, camundongos B6 infectados por TMEV apresentam desempenho significativamente pior em testes comportamentais de aprendizagem e memória e apresentam comorbidade cognitiva, o que também é observado em pacientes clínicos com epilepsia13,14,15.

Tradicionalmente, modelos de epilepsia e convulsões utilizam a aplicação de substâncias quimioconvulsivantes ou estimulação elétrica para induzir convulsões; no entanto, esses modelos carecem de validade de construto e frequentemente apresentam convulsões e danos cerebrais mais graves do que os observados em pacientes clínicos¹⁶. Não existe um modelo adequado para todas as questões de pesquisa¹⁷. O uso do modelo TMEV é especialmente interessante se os fatores predisponentes do desenvolvimento de convulsões após uma infecção do SNC forem pesquisados ou se os compostos forem examinados quanto à sua eficiência anticonvulsivante.

Uma vez que o modelo TMEV foi estabelecido e usado em vários laboratórios diferentes internacionalmente, os autores identificaram muitos detalhes que permitem a implementação bem-sucedida do modelo, por exemplo, a especificidade de diferentes cepas de vírus e camundongos. A indução de crises mais confiável foi gerada com a linhagem de Daniel de camundongos TMEV e B6J 2,5,6,8,9. O modelo é atualmente utilizado pelo National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) como plataforma para identificar novas drogas contra epilepsia e convulsões^18,19. Este artigo inclui o protocolo detalhado de indução viral e monitoramento clínico para permitir que outros pesquisadores utilizem este modelo de encefalite viral para aprofundar a compreensão dos mecanismos da doença, bem como para testes de drogas.

O protocolo a seguir reflete um estudo desenhado para testes compostos neste modelo, embora vários outros tipos de estudos possam ser realizados. Os camundongos são anestesiados brevemente antes da injeção com a cepa de Daniel de TMEV na região temporal do hemisfério direito (posterior e medial ao olho direito). Dependendo da questão de pesquisa, se animais de controle não infectados forem necessários, os camundongos recebem solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS, pH 7,4, incluindo KH 2 PO₄ [1,06 mM], NaCl [155,17 mM] e Na 2 HPO₄·7H 2 O [_2,97mM]) em vez de TMEV. A experiência anterior em camundongos infectados com TMEV indicou que as convulsões induzidas pelo manuseio ocorrem entre o dia 3 e o dia 7 pós-infecção. A frequência de injeção, a via e o tempo de teste dos compostos experimentais variam de acordo com suas propriedades. Recomenda-se realizar a inoculação do vírus em uma sexta-feira, o que permite que o monitoramento de convulsões do dia 3-7 aconteça na semana seguinte, de segunda a sexta-feira. Durante a semana de monitoramento de convulsões, os compostos experimentais podem ser administrados (i.p.) duas vezes ao dia (com pelo menos 4 h de intervalo), a menos que seja sugerido de outra forma pela cinética ou mecanismo de ação do composto. O monitoramento de convulsões durante o tratamento pode ser realizado em um ponto de tempo previamente determinado. Os tempos de injeção e observação variam dependendo de cada composto. Os animais são injetados com o composto de teste ou com um veículo em vez do composto da droga. Esses dois grupos podem ser manuseados e observados de forma análoga ao grupo experimental. Durante o experimento, a única pessoa que manusear os camundongos e marcar as convulsões deve ser cegada para o tratamento.

Protocolo

Todos os procedimentos descritos foram autorizados pelas respectivas autoridades. Os animais são mantidos seguindo as recomendações do "Guide for Care and Use of Laboratory Animals" (Conselho Nacional de Pesquisa) e de acordo com a política do Serviço de Saúde Pública e do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Utah, protocolo animal (número: 21-11009, Departamento de Farmacologia e Toxicologia) e na Freie Universität Berlin (protocolo: G0015/21, LAGeSo Berlin, Instituto de Farmacologia e Toxicologia), respectivamente. Os resultados apresentados na Figura 3 e Figura 5 foram aprovados sob 33.9-42502-04-11/0516 e 33.9-42502-04-15/1892 (LAVES Oldenburg, Departamento de Farmacologia, Toxicologia e Farmácia, Universidade de Medicina Veterinária de Hannover).

1. Considerações e preparativos para a concepção do estudo

1. Vírus
   1. A cepa Daniel's de TMEV foi gentilmente cedida por Robert Fujinami da Universidade de Utah. Originalmente, foi isolado de um rato na colônia Harvard²⁰. Procure a classificação e os regulamentos específicos para agentes biológicos nos respectivos países antes de manusear o TMEV e discuta com o pessoal de biossegurança institucional para garantir o cumprimento dos regulamentos. Normalmente, o TMEV é classificado como BSL 2, dependendo da cepa e das modificações genéticas. A dose padrão necessária para induzir convulsões na maioria dos animais é de 3 x 10⁵ unidades formadoras de placas (UFP).
      NOTA: A dose pode ter de ser adaptada, por exemplo, se forem utilizados ratinhos transgénicos. Em geral, títulos entre 2 x 10⁴ UFP e 2,44 x 10⁷ PFU têm sido usados para induzir convulsões com sucesso. Os animais de controle recebem PBS estéril e não apresentam convulsões. O vírus não infecta humanos; no entanto, os EPIs (jaleco, luvas, óculos de segurança) devem ser usados pelos experimentadores em todos os momentos, e carcaças e roupas de cama de camundongos devem ser autoclavadas antes do descarte.
2. Animais
   1. Para induzir e investigar convulsões, use camundongos B6J, pois outras cepas de camundongos não necessariamente apresentam convulsões, por exemplo, camundongos SJL/J, FVB/N ou Balb/c⁵. Não há diferença entre camundongos fêmeas e machos na frequência de crises agudas⁵. Realizar os experimentos em camundongos adolescentes a adultos (a partir de 5-6 semanas de idade).
3. Dieta
   1. A dieta foi determinada como uma fonte de variabilidade lab-a-laboratório na gravidade da doença; portanto, considerar a dieta como um fator potencial de variação²².
4. Tamanho do grupo
   1. Como nem todos os animais desenvolvem convulsões agudas ou crônicas neste modelo, use cerca de 20 camundongos/grupo para testes compostos.
5. Bem-estar animal
   1. Se algum camundongo demonstrar efeitos adversos significativos da infecção ou administração do composto experimental (por exemplo, letargia, má tosa, vermelhidão excessiva e secreção purulenta da ferida) após um tempo de observação determinado pelas diretrizes locais da IACUC (por exemplo, 48 h), eutanasie o camundongo humanamente.
   2. Eutanasiar qualquer camundongo que demonstre perda de peso corporal extrema (>20%) durante o período de infecção humanamente.
   3. Se os animais não se alimentarem adequadamente, dê-lhes acesso a pastilhas suplementares umedecidas com solução eletrolítica pediátrica ou similar.

2. Inoculação viral

1. Esterilização da seringa de injeção
   1. Retire a tampa da seringa de insulina. Adicione tubos de polietileno como um colar ao redor da agulha para garantir uma profundidade de injeção adequada de 2,5 mm. Submergir a seringa em etanol por 30 min. Coloque a seringa sob luz UV durante 30 minutos.
   2. Coloque a tampa de volta na agulha. Embrulhe a seringa em uma bolsa esterilizante e tape-a fechada. Rótulo com a data de preparação.
2. Injeção de vírus
   1. Obtenha alíquotas da cepa de Daniel de TMEV do freezer de -80 °C. Descongelar o vírus e mantê-lo no gelo. Evite descongelar e congelar novamente o vírus. Carregar a seringa com a suspensão do vírus (3 x 10⁵ PFU diluída em 20 μL de PBS ou meio de cultura DMEM).
      CUIDADO: O vírus é infeccioso para camundongos, mas não para humanos.
   2. Limpe a bancada com desinfetante e trabalhe sob um absorvedor de fumos. A inoculação do vírus não é estéril, mas é o mais limpa possível.
   3. Transfira o camundongo para a câmara de indução anestésica e use isoflurano a 2% em oxigênio para induzir a anestesia. Atingir a tolerância cirúrgica leva alguns minutos; Ajuste a concentração com base na respiração do animal e na profundidade da anestesia.
   4. Transfira o rato anestesiado da caixa de anestesia sob o capô. Verifique a tolerância cirúrgica, por exemplo, por pinça dos dedos. Todo o procedimento é realizado em menos de 30 s, para que o animal não precise estar inalando isoflurano durante a injeção. Adicione pomada ocular para evitar o ressecamento da córnea.
   5. Limpe a cabeça do animal com uma almofada de álcool. Incline ligeiramente a cabeça do rato para a esquerda para que o local de injeção esteja apontado para cima.
   6. Puxe a pele um pouco para trás, insira a agulha na cabeça e injete 20 μL por via intracortical a uma profundidade de 2,5 mm na região temporal do hemisfério direito (posterior e medial ao olho direito).
   7. Realizar a injeção unilateralmente no mesmo hemisfério em todos os animais. Use o olho e o ouvido como pontos de referência para a localização do córtex parietal. O posicionamento foi previamente verificado histologicamente; veja a Figura 1. As coordenadas de injeção de acordo com a injeção estereotáxica em relação ao bregma são −2,0 (AP); +3,0 (ML); −1,5 (DV).
   8. Deixe a seringa no lugar por 5-15 s. Anote se há algum vazamento da injeção ou se bolhas de ar são vistas - nesse caso, prepare uma nova seringa. Ao retirar cuidadosamente a seringa, gire-a ligeiramente. Aplique pomada ocular para evitar o ressecamento durante a anestesia.
   9. OPCIONAL: Codifique o animal na cauda ou na orelha dependendo dos procedimentos locais (opcional, mas fácil, pois o animal está inconsciente).
   10. Transfira o animal para uma nova gaiola, que é colocada meio a meio/meio fora de uma almofada de aquecimento (35-40 °C) durante a recuperação da anestesia. Não deixe os animais sozinhos até que tenham recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal.
       NOTA: Os animais podem ser alojados em grupo novamente após a recuperação (os animais infectados não são misturados com animais infectados simulados). Os ratinhos infectados não devem ser alojados na mesma sala que os ratinhos não infectados.
   11. Mantenha o controle do peso dos camundongos nos primeiros 7 dias pi, pois eles perdem peso após a infecção e podem exigir alimentação adicional.

Figura 1: Esquema do procedimento de injeção de TMEV. Da esquerda para a direita: Para uma injeção no córtex parietal direito, a agulha é injetada ligeiramente lateral de uma linha imaginária entre o olho e a orelha oposta. O colar para controle de profundidade é indicado em amarelo. A via injetável pode ser vista na seção cerebral coronal, marcada pela seta. O local de injeção corresponde às coordenadas indicadas acima da seta. A imagem à direita mostra a distribuição do vírus Theiler (violeta) dentro do CA1 da formação hipocampal. A figura foi preparada usando biorender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Ensaios compostos

1. Preparação de compostos
   1. Revise as instruções de formulação. Preparar a solução do veículo de acordo com as recomendações ou instruções fornecidas. Como exemplo, o procedimento para a droga antiepiléptica levetiracetam (LEV) é apresentado. O LEV reduz a carga convulsiva para 30%-40% dos níveis do veículo na dose de 350 mg/kg. O veículo utilizado neste estudo é a metilcelulose a 0,5%.
   2. Calcule as doses dependendo do composto. Pese a droga de acordo com o cálculo. Para tratar 1 kg de ratinhos, pesar 350 mg de LEV.
   3. Preparar uma solução-mãe com o volume adequado de solução do veículo, conforme indicado pelas instruções de formulação (por exemplo, sonicação, excipientes do veículo, etc.). Considerando um volume de injeção de 0,01 mL/g de camundongo, o volume de injeção para 1 kg seria de 10 mL com 350 mg de LEV, resultando em uma solução de 35 mg/mL¹⁹. Relate o cálculo e a dose em mg/kg e o volume em mL.
      NOTA: Um protocolo exemplar pode ser encontrado na página 2 do Material Complementar 1.
2. Administração de compostos
   1. Randomizar gaiolas para o veículo ou grupo composto. Use camundongos infectados simulados para estudos sobre os mecanismos de desenvolvimento da epilepsia ou para fins de validação, mas não para triagem rotineira de drogas.
   2. Relate as condições do ambiente, como temperatura, umidade, hora do dia, etc.
   3. Vórtice a solução com o composto, bem como a solução do veículo. Aspirar o veículo ou composto em uma seringa e código de cor das seringas para evitar mistura.
   4. Pese os animais. Certifique-se de que os ratos B6J estão >18 g no dia 3 pi (não arredondados). Denuncie o peso.
   5. Administrar o composto (por exemplo, por injeção intraperitoneal ou outras vias apropriadas). Escreva o horário e a via de administração.
   6. Monitorar os animais para quaisquer mudanças comportamentais após a administração do composto, especialmente após as primeiras injeções. Se ocorrerem crises, relatar a intensidade das crises de acordo com a escala de^Racine23; Consulte a etapa 3.2.
      NOTA: Um protocolo exemplar para administração de compostos pode ser encontrado no Material Suplementar 1, página 3, enquanto as convulsões observadas durante a administração seriam registradas no Material Suplementar 1, páginas 4-5.
3. Monitoramento de convulsões de convulsões induzidas pelo manuseio
   1. Realizar este procedimento por um experimentador cego para o tratamento. Traga todas as gaiolas para o banco. Observar os animais para convulsões 2x ao dia durante a fase de luz.
   2. Pontuar a atividade convulsiva por uma escala de Racine modificada²³: 0 = nenhuma mudança de comportamento, 1 = movimentos de boca e face, 2 = cabeça balançando, 3 = clônus unilateral de membros torácicos, 4 = clônus bilateral de membros torácicos com criação, 5 = atividade tônico-clônica generalizada com perda do tônus postural, às vezes saltando, 6 = salto prolongado e excessivo e hiperatividade. Relate o número e a intensidade das crises.
   3. Deslize uma caneta pela gaiola para fazer algum barulho.
   4. Transfira cada animal para outra caixa e vice-versa.
   5. Agite suavemente a gaiola usando um movimento de vai-e-vem, tomando cuidado para não agitá-la tão vigorosamente que os animais batam nas laterais ou no topo da gaiola e corram o risco de sofrer ferimentos físicos.
   6. Monitorar todos os animais na gaiola para convulsões. A qualquer momento, se um rato tiver uma convulsão, transfira-a de volta para a gaiola de casa e anote o nível da convulsão sem mais estimulação convulsiva por ruído ou manuseio.
   7. Para animais que não se agarraram espontaneamente ou após um leve tremor da gaiola, desencadeie convulsões por manuseio mais intenso: Vire-o cuidadosamente sobre o mouse, virando-o em sua cauda da esquerda para a direita.
      NOTA: Animais com convulsões são hiperexcitáveis e podem ser saltitantes.
   8. Observe cada animal para o comportamento de convulsão novamente. Repita o processo para gaiolas subsequentes.
      NOTA: Um protocolo exemplar para monitoramento de convulsões pode ser encontrado no Material Suplementar 1, páginas 6-7.
4. Relatório de dados sobre efeitos compostos
   1. Analisar os pesos corporais diários usando ANOVA para medidas repetidas (RM).
   2. Use os valores de carga de apreensão cumulativa diária para uma representação gráfica dos dados. Apresentar os dados de eficácia (número de animais sem crises Racine estágio 3-5) como o número protegido/o número testado em cada respectivo grupo (geralmente N = 20). Portanto, compare os dados entre os grupos tratados com veículo e com drogas para respostas (apreensão ou não) usando um teste exato de Fisher.
      NOTA: Um animal é considerado "protegido" de convulsões se tiver uma convulsão de estágio 2 ou menos e animais não protegidos tiverem convulsões de estágios 3-5.
   3. Analise os dados de tolerabilidade da mesma forma, como o número de animais com prejuízos comportamentais ou efeitos tóxicos/o número testado em cada grupo. Observe quaisquer efeitos adversos, incluindo mortes.
   4. Se menos de 50% dos ratos injetados com o veículo apreenderem agudamente, não considere os dados.

Resultados

Efeitos compostos em convulsões agudas
As convulsões comportamentais são registradas se ocorrerem durante a injeção de drogas (DI) ou durante as sessões subsequentes de manipulação/monitoramento de convulsões AM/PM. As convulsões observadas durante o manuseio das crises podem ser apresentadas como um mapa de calor, que é mostrado na Figura 2 para LEV (350 mg/kg). Para a análise da carga convulsiva, a média dos valores finais (dia 7) da carga convulsiva cumulativa para o grupo tratado com veículo é tomada e comparada pelo teste U de Mann-Whitney com o grupo tratado com composto (os valores da carga convulsiva incluem aqueles coletados na observação pós-injeção). Para a eficácia do composto, um teste exato de Fisher determina se há uma diferença estatística na eficácia entre os grupos tratados com veículo e medicamentos. Da mesma forma, os dados de tolerabilidade são analisados com o teste exato de Fisher. A análise do peso corporal é realizada por ANOVA de medidas repetidas para determinar mudanças ao longo do experimento, bem como diferenças entre camundongos tratados com compostos e veículos.

Figura 2: Um mapa de calor das convulsões comportamentais após o teste com veículo (0,5% metilcelulose) ou LEV (350 mg/kg). Duas injeções diárias ocorreram 1 h antes do manuseio e observações de convulsões. As crises comportamentais foram registradas se ocorressem durante a injeção de drogas (DI) ou durante as sessões subsequentes de manipulação/monitoramento de crises AM/PM. LEV (350 mg/kg) reduz significativamente as convulsões observadas durante as sessões de manuseio (35,9% da carga de apreensão do veículo) durante o período de observação de 5 dias. O mapa de calor é criado retratando os estágios 1-3 em verde, 4 em amarelo e 5 em laranja. Essa nova figura foi criada a partir de um conjunto de dados publicado¹⁹. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Epilepsia crônica
Além da carga convulsiva relatada na primeira semana pi, há várias leituras que podem ser úteis dependendo do estudo e da hipótese. Se os animais forem mantidos a longo prazo, um subgrupo de animais infectados desenvolverá crises epilépticas espontâneas em várias semanas pi, que ocorrem com menos frequência do que as crises agudas e, portanto, requerem registro de EEG. Para registrar o EEG de camundongos, eletrodos precisam ser implantados em uma cirurgia estereotáxica²⁴. A Figura 3 mostra vários eventos epilépticos na fase crônica pelo registro do EEG em camundongos infectados com TMEV⁸.

Figura 3: Traços típicos de EEG na fase crônica (14 semanas pi) após a infecção pelo vírus DA em camundongos. (A-C) Eventos representativos de EEG nos quais nenhum correlato motor comportamental foi observado, ou seja, (A) pontas únicas, (B) grupos de espículas, (C), bem como uma convulsão eletrográfica, presumivelmente focal. (D-F) Eventos representativos do EEG com correlatos comportamentais. O camundongo ilustrado em D apresentou eventos semelhantes a convulsões com contrações mioclônicas (indicadas por "M", acompanhadas de artefatos de movimento), movimentos estereotipados (indicados por "head press", quando o camundongo pressionou a cabeça no chão) ou parada comportamental; "Scr" descreve um artefato de movimento de coçar, (E) e (F) mostram alterações típicas no EEG durante crises convulsivas generalizadas: (E) uma crise de Racine estágio 3 com duração de 22 s e 1 Hz, e (F) uma crise estágio 5 com duração de 34 s e 5,4 Hz. Este número foi publicado antes de⁸ e é reimpresso com permissão da Elsevier. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Histologia
Como epilepsia e convulsões são geralmente acompanhadas por patologia hipocampal em pacientes, que é recapitulada em modelos experimentais, a maioria dos laboratórios também analisa as alterações hipocampais ou o efeito de um potencial tratamento anticonvulsivante na patologia. Os parâmetros comumente analisados incluem neurodegeneração e encolhimento do hipocampo, bem como inflamação por marcação para populações específicas de células imunes. Para tais análises, no final do experimento, os camundongos são profundamente anestesiados até que ocorra a parada respiratória e a frequência cardíaca diminua significativamente ou mostre arritmia. O sangue é removido por perfusão intracárdica de PBS seguida de paraformaldeído (PFA) a 4%²⁵ para fixação do tecido. O tecido é então processado por criossecção e coloração (imuno)²⁶, seguida de análises microscópicas.

Figura 4: Degeneração hipocampal em camundongos epilépticos infectados com TMEV. (A,B) Cortes coronais corados com violeta de cresil mostram citoarquitetura normal em um camundongo (A) controle (PBS) e degeneração hipocampal em um camundongo (B) TMEV aos 2 meses pi. Nota: Ventrículos laterais aumentados, colapso do alvéolo e adelgaçamento da camada de células piramidais. (C) A quantificação desse dano mostra uma diminuição significativa na área hipocampal e um aumento correspondente na área ventricular de camundongos TMEV (N = 7) vs. PBS (N = 6; os dados são médios ± EPM; p < 0,001; Teste t de Student). (D,E) A marcação de NeuN ilustra ainda mais a magnitude da perda de células neuronais em cortes tomados aos 6 meses pi. As setas indicam regiões com perda completa de células piramidais. (E) O giro denteado parece estar relativamente intacto mesmo em camundongos epilépticos. Barra de escala = (A,B) 2 mm; (D,E) 0,5 milímetros. Este número foi publicado antes de⁶ e é reimpresso com permissão da Oxford University Press. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Fotomicrografias representativas de diferentes gravidades da infiltração de células T por encefalite aguda aos 7 dias pós-infecção. Cortes seriados contendo o hipocampo dorsal ipsilateral foram corados com anticorpos contra CD3 para marcação de linfócitos T. (A,D) Um hipocampo normal sem infiltração de células T como apareceu em animais infectados simulados. (B, E) Infiltração moderada de células T, como é visto na maioria dos camundongos infectados com TMEV. (C, F) Uma infiltração severa de linfócitos T, que só foi observada em alguns dos camundongos infectados. Este número foi publicado antes de⁸ e é reimpresso com permissão da Elsevier. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo suplementar 1: O arquivo suplementar consiste no formulário usado para testes compostos no modelo TMEV. A página 1 fornece uma visão geral da configuração experimental. As informações sobre a preparação do composto, do veículo e da solução composta são registadas nas páginas 1-2. A aplicação composta é registada na página 3. As folhas de pontuação nas páginas 4-5 são usadas para registrar as convulsões observadas e quantificadas pelo experimentador que realiza a injeção do composto. Na página 4, os dados podem ser coletados para as gaiolas 1-4 de 5 camundongos cada, e na página 5, as gaiolas 5-8 podem ser registradas, que é o número padrão de animais para testes compostos em nossas mãos. As folhas de pontuação nas páginas 6-7 são usadas pelo observador cego que está realizando a observação, manuseio e agitação suave da gaiola 1 h após cada injeção composta. Novamente, as pontuações de apreensão podem ser notadas para oito gaiolas no total nessas folhas de pontuação exemplares. A última página 8 pode ser usada para registrar quaisquer outras observações ou notas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Este é o primeiro modelo de roedor baseado em infecção para epilepsia que permite a investigação do desenvolvimento de crises agudas e crônicas. Isso ajudará a identificar alvos de drogas e novos compostos para a prevenção ou modificação de doenças para uma das etiologias mais comuns da epilepsia.

Conforme descrito acima, pode ser necessária uma consideração cuidadosa do lote e do título viral para garantir que uma proporção adequada de camundongos tratados com TMEV demonstre convulsões induzidas pelo manuseio. Se os animais tiverem menos convulsões do que o habitual, use um lote de N = 20 animais para verificar a eficiência do vírus. Se sua atividade estiver diminuída (menor que 50%), é hora de fazer novas alíquotas e testá-las com N = 20 animais. Se as novas alíquotas não forem mais eficientes, um novo lote do vírus deve ser purificado. Para algumas linhagens de camundongos transgênicos, pode ser necessário usar um título viral mais baixo; portanto, o título viral deve ser diluído conforme necessário após experimentos preliminares. A maioria dos dados disponíveis em camundongos B6 originou-se dos Laboratórios Jackson (Bar Harbor, ME, EUA ou Charles River, Sulzfeld, Alemanha); no entanto, taxas semelhantes de convulsões em camundongos B6 obtidos de Harlan (Eystrup, Alemanha) foram confirmadas⁸. As taxas de apreensão de animais transgênicos com fundo B6 são comparáveis às de camundongos B6 selvagens, mas podem diferir se as alterações genéticas tiverem influência na invasão viral, resposta inflamatória ou neurodegeneração²¹. As crises agudas são observadas espontaneamente, mas desencadeadas pelo manuseio e ruído, por isso é de extrema importância manusear todos os animais de maneira semelhante quando as taxas de convulsões estão sendo comparadas. Duas sessões diárias de manuseio forneceram previamente uma alta carga convulsiva e uma maior proporção de camundongos demonstrando convulsões durante os dias 3-7 após a infecção ^6,8,19. Sessões adicionais de manuseio (dia 1 e dia 2) também podem ser empregadas para aumentar a carga convulsiva. Além disso, os animais podem ser observados antes de cada sessão de manuseio para garantir que convulsões espontâneas não estejam ocorrendo. Um ambiente de laboratório barulhento, por exemplo, pode produzir convulsões, o que pode, por sua vez, tornar os animais refratários a convulsões induzidas pelo manuseio durante os períodos de teste.

Embora a infecção por TMEV produza convulsões induzidas pelo manuseio na maioria dos camundongos, não se sabe por que alguns animais são resistentes a esse tratamento. Como descrito acima, pode ser que convulsões eletrográficas (com comportamentos mínimos ou nenhum comportamento associado) ocorram e não sejam normalmente quantificadas sem registro concomitante no EEG. Também pode ser que pequenas diferenças no local da injeção facilitem a redução do efeito viral no cérebro; no entanto, convulsões têm sido relatadas após infecção cortical e estriatal5,6,8,9 devido ao tropismo do vírus para o hipocampo. Para estudos de triagem de drogas nesse modelo, para identificar uma redução nas crises (por exemplo, uma redução de 50% na carga de crises), é necessário um número maior de animais para cada grupo (por exemplo, N = 20). Além disso, a variabilidade nos comportamentos de crise neste modelo requer maiores diferenças nos efeitos da droga versus veículo para identificar uma redução significativa das crises. Portanto, uma limitação desse modelo é a exigência de grupos maiores. No entanto, tamanhos suficientes de grupos também permitem a identificação de efeitos anticonvulsivantes e anti-inflamatórios nesse modelo¹⁹.

A grande maioria das convulsões observáveis neste modelo ocorre durante o período de infecção aguda. Apesar da ocorrência de degeneração hipocampal, ativação de células imunes e déficits cognitivos observados em camundongos tratados com TMEV, apenas uma pequena parcela dos animais tratados eventualmente desenvolve convulsões crônicas espontâneas. Essa baixa carga convulsiva global exigiria um grande número de camundongos infectados para estudar adequadamente as crises espontâneas neste modelo, o que está além do escopo e da capacidade de muitos projetos. O implante de eletrodos de profundidade e o monitoramento do EEG também aumentariam a carga sobre os animais experimentais. Embora os eletrodos de profundidade possam ajudar na identificação da atividade convulsiva espontânea, mudanças na anatomia hipocampal após a infecção podem tornar a colocação consistente do eletrodo um desafio.

A necessidade urgente de identificar novos tratamentos para a epilepsia requer o desenvolvimento de modelos que possam ser usados como um método de triagem rápida para a eficácia anticonvulsivante. Esse modelo fornece recursos para atender a essa solicitação urgente. Além disso, o fato de não necessitar de cirurgia estereotáxica o torna um modelo adequado e de fácil execução para a investigação de compostos anticonvulsivantes.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbent paper	-	-	any
Analytical balance	Mettler Toledo (Columbus, OH, U.S.A.)	30216542	0. 1 mg–220 g
Animal balance	Ohaus (Parsippany, NJ, U.S.A.)	STX2202	0.01 g–2200 g
BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes	BD (Mississauga, ON, Canada)	BD329461	Lo-Dose sterile syringes with permanent BD Micro-Fine IV needle - 1 mL
Daniel's strain of TMEV	kindly provided by Robert Fujinami (University of Utah)	-	3 x 105 plaque-forming units aliquot(s)
Disinfectant, e.g. VennoVet 1 super	Menno Chemie Vertriebsgesellschaft GmbH, Germany	-	Recommended by campus veterinarians with less than or equal to 5% alcohol
Fisherbrand medium sterile Alcohol prep pad C7	Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.)	22-363-750
Fluriso	VETone (Boise, ID, U.S.A)	502017	Isoflurane 250 mL, 2%–5%
Fume absorber	Labconco (Kansas City, MO, U.S.A.)	-	-
General Protection Disposable SMS White Lab Coats	Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.)	17-100-810A
GraphPad Prism version 9	(La Jolla, CA, U.S.A.)
Ice bucket	-	-	any
Microsoft Excel Microsoft	(Redmond, WA, U.S.A.)
Microsoft Word Microsoft	(Redmond, WA, U.S.A.)
Mouse cage	-	-	any mouse cage holding at least 5 mice
PrecisionGlide needles	BD (Mississauga, ON, Canada)	329652	BD Slip Tip with PrecisionGlide Needle Insulin Syringes - 26 G x 3/8 - 0.45 mm x 10 mm
Self-Sealing Sterilizing Pouch	Fisher Scientific (Hampton, NY, U.S.A.)	NC9241087	12.6 x 25.5 cm
Small glass flask	-	-	any, volume 25 mL
sterile PBS	Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.)	10010056
Stir bar	Carl Roth GmbH & CO. KG	X171.1	size according to volume of solution
Stir plate	Carl Roth GmbH & CO. KG	AAN2.1
Syringe Luer-Lok	BD (Mississauga, ON, Canada)	309628	1 mL syringe only
Ultrasonic Cleaner, Heater/Mechanical Timer	Cole-Parmer (Vernon Hills, IL, U.S.A.)	EW-08895-23	Bath sonicator - 0.5 gal, 115 V
Vehicle solution	-	-	depending on compound vehicle
Vortex REAX	Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Germany	541-10000-00