Bioimpressão Cerâmica Omnidirecional em Suspensões Carregadas de Células para a Geração de Análogos Ósseos

Resumo

Este protocolo descreve uma técnica de impressão 3D para fabricar estruturas semelhantes a ossos, depositando uma tinta de fosfato de cálcio em um suporte granular à base de gelatina. Os análogos ósseos impressos são depositados em forma livre, com flexibilidade para a colheita direta da impressão ou reticulação dentro de uma matriz celular viva para construções multifásicas.

Resumo

Estruturalmente, o tecido ósseo é um composto inorgânico-orgânico contendo células metabolicamente ativas embutidas dentro de uma matriz hierárquica e altamente mineralizada. Essa organização é difícil de replicar devido ao ambiente heterogêneo do osso. A bioimpressão omnidirecional cerâmica em suspensões celulares (COBICS) é uma técnica de bioimpressão baseada em microgel que replica exclusivamente a estrutura mineral e celular do osso. A COBICS imprime construções complexas e biologicamente relevantes sem a necessidade de materiais de suporte sacrificiais ou etapas severas de pós-processamento (por exemplo, radiação e sinterização a alta temperatura), que são dois dos maiores desafios na fabricação aditiva de construções miméticas ósseas. Esta técnica é habilitada através da extrusão de forma livre de uma nova tinta à base de fosfato de cálcio dentro de uma suspensão de microgel à base de gelatina. As propriedades de rendimento-tensão da suspensão permitem a deposição e suportam a estrutura óssea impressa. A reticulação UV e a nanoprecipitação então a "bloqueiam" no lugar. A capacidade de imprimir cerâmicas miméticas ósseas nanoestruturadas em biomateriais carregados de células fornece controle espaço-temporal sobre macro e microarquitetura e facilita a fabricação em tempo real de construções ósseas complexas em ambientes clínicos.

Introdução

O osso tem notáveis habilidades de regeneração como uma das poucas estruturas do corpo que podem cicatrizar recriando sua composição celular normal, orientação e força mecânica até um tamanho de defeito crítico, quando a capacidade de cicatrização endógena é comprometida¹. O osso, juntamente com a cartilagem e o ligamento, suporta e facilita o movimento do corpo, além de armazenar minerais e gorduras e produzir células sanguíneas. Como um tecido conjuntivo duro e denso, o osso é composto principalmente de uma fase inorgânica, água e material orgânico composto principalmente de fibras colágenas². As células estão embutidas dentro dessa matriz altamente mineralizada de fibras colágenas I e cristais de hidroxiapatita (HA), formando uma estrutura hierárquica³.

A complexa organização desse tecido torna a fabricação de alternativas sintéticas para replicar os heterogêneos micro e nanoambientes ósseos excepcionalmente desafiadores³. Para este propósito, uma variedade de materiais, incluindo biocerâmica, hidrogéis carregados de células e materiais sintéticos foram propostos como soluções para criar matrizes ósseas. Entre as técnicas de fabricação de andaimes, as técnicas baseadas em impressão 3D surgiram recentemente e receberam muita atenção da comunidade de engenharia de tecidos devido à sua notável capacidade de permitir a fabricação de estruturas altamente sofisticadas e precisas com grande promessa de tratamento específico do paciente ^4,5,6 . Os hidrogéis têm sido a escolha mais popular de mímicos de matriz e biotintas, uma vez que podem ser impressos em conjunto com células e moléculas bioativas, gerando construtos funcionais⁶. No entanto, os hidrogéis não possuem as propriedades funcionais do osso, como resistência mecânica e uma fase inorgânica altamente calcificada contendo células metabolicamente ativas.

Os andaimes cerâmicos impressos em 3D normalmente requerem etapas de pós-processamento, incluindo sinterização, tratamentos a alta temperatura ou o uso de produtos químicos agressivos que devem ser cuidadosamente lavados antes de aplicações in vitro ou in vivo ⁵. Para abordar essas limitações, Lode et ^al.7 desenvolveram recentemente uma pasta à base de fosfato α-tricálcico formada por hidroxiapatita, que pode ser impressa e ajustada em condições fisiológicas. No entanto, este material ainda não pode ser impresso em conjunto com células vivas, pois requer pós-tratamento em um ambiente úmido e subsequente imersão em solução aquosa por um longo período.

Alternativamente, hidrogéis carregados de células com partículas inorgânicas incorporadas têm sido propostos como substitutos da matriz óssea 3D ^8,9. Apesar de sua grande capacidade de suportar a viabilidade celular, eles não são capazes de recapitular o ambiente de tecido ósseo densamente mineralizado. Thrivikarman et ^al.10 adotaram uma abordagem biomimética na qual um meio supersaturado de cálcio e fosfato foi utilizado com um análogo proteico não colagenoso para melhor mimetizar a deposição de apatita em nanoescala. No entanto, suas construções ainda não podem gerar construções 3D rígidas com arquitetura de micro e macroescala semelhante a ossos.

O presente estudo aborda essas deficiências por meio do desenvolvimento de uma estratégia de impressão para fabricar construtos que imitam ossos, em fases inorgânica e orgânica, que sejam capazes de integrar tanto células quanto fatores de crescimento¹¹. O COBICS recapitula exclusivamente a estrutura mineral e celular do osso usando uma técnica de bioimpressão baseada em microgel. O protocolo aqui descrito descreve o processo de síntese dos microgéis cerâmicos à base de tinta óssea e gelatina e, em seguida, a combinação de células que permitem o COBICS. O processo começa com a síntese do principal material precursor da tinta óssea. O hidrogel reticulável é então sintetizado e formado em microgéis. Por fim, a tinta óssea é depositada omnidirecionalmente em um banho de suporte dos microgéis carregados de células (Figura 1).

A tinta óssea pode ser impressa em qualquer suspensão de microgéis que tenham as características apropriadas de tensão de rendimento, ou seja, a capacidade de fluidizar a uma taxa de cisalhamento específica e, posteriormente, apoiar a estrutura depositada. Foram demonstradas duas abordagens flexíveis: uma suspensão constituída por microgéis de gelatina e uma suspensão constituída por microgéis de metacrilato de gelatina (GelMA). A primeira suspensão dissolve-se quando a temperatura é elevada para 37 °C, a forma livre de incorporação reversível de hidrogéis suspensos (FRESH) técnica¹², enquanto a última pode ser fotoreticulada após a impressão, efetivamente "costurando" os microgéis juntos e travando a tinta óssea impressa no lugar. O presente estudo se concentra no uso de GelMA como matriz, pois fornece a vantagem única de ser capaz de suportar o crescimento celular com impressão in situ de estruturas miméticas ósseas complexas. Em última análise, essa abordagem permite a geração de modelos de tecidos complexos com altos níveis de biomimética e amplas implicações para a modelagem de doenças, descoberta de medicamentos e engenharia regenerativa.

Figura 1: Esquema do fluxo de trabalho . (A) A tinta óssea é sintetizada a partir da síntese de fosfato α-tricálcico e sua subsequente combinação com glicerol, polissorbato 80 e fosfato de amônio dibásico. (B) Os microgéis GelMA são fabricados pelo método de emulsão de água em óleo. Os microgéis obtidos são então (C) hidratados e (D) combinados com células. Os compósitos de célula-microgel são então usados como um banho granular no qual a tinta óssea é depositada. (E) Toda a construção é então reticulada por UV e transferida para a incubadora para cultura. Abreviaturas: α-TCP = fosfato α-tricálcico; GelMA = metacrilato de gelatina. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Protocolo

1. Fabricação de tinta de osso

1. Síntese de fosfato α-tricálcico
   1. Pesar os pós de hidrogenofosfato de cálcio (CaHPO₄) e carbonato de cálcio (CaCO 3) numa proporção molar de Ca:P de₃:2. Usando uma espátula, homogeneize completamente os dois pós.
   2. Adicione a mistura de hidrogenofosfato de cálcio e carbonato de cálcio em pó a um cadinho de zircônia de modo que não esteja mais do que 75% cheio.
      NOTA: Para evitar a contaminação, utilizar um cadinho novo ou um cadinho previamente utilizado para fabricar o mesmo material. Para limpar, enxágue com etanol a 100% e seque ao ar em um exaustor até secar completamente antes de adicionar os pós.
   3. Transferir o cadinho para um forno. Aquecer a 1 400 °C a uma velocidade de 5 °C/min e manter durante 3 h.
   4. Apague a reação removendo o cadinho do forno e deixe-o em cima de um bloco refratário. Deixe esfriar completamente antes de manusear.
      NOTA: Use pinças de cadinho de um comprimento apropriado e garanta uma proteção térmica adequada.
   5. Use uma argamassa e pilão para quebrar e moer o bolo α-TCP de tal forma que os grânulos resultantes tenham um tamanho máximo de 200 μm.
      NOTA: Use uma peneira de aço inoxidável padrão para garantir o tamanho correto das partículas.
   6. Moer ainda mais os grânulos usando um moinho planetário em dois estágios. Primeiro, adicione bolas de zircônia estabilizadas com ítria de 3 mm em uma proporção de peso de 8:1 bolas:pó, depois 100% de etanol em uma relação de peso de 3:1 etanol:pó. Prenda a tampa e triture por 2 h a 180 rpm.
   7. Colete a suspensão e separe as esferas, utilizando etanol 100% para lavagem.
   8. Secar a suspensão num forno a 120 °C durante 24 h.
   9. Adicione o pó seco aos frascos de moagem com bolas de zircônia de 1 mm e etanol a 100% nas mesmas proporções de peso do primeiro estágio. Moer por 2 h a 180 rpm, separar e secar.
      NOTA: Todo o procedimento de síntese é representado na Figura 1A.
2. Formulação de tinta óssea
   1. Para fazer a tinta óssea, adicione 2 g de pó de α-TCP a um frasco de moinho de bolas que contenha 630 μL de glicerol e 130 μL de polissorbato 80 enquanto mexe continuamente com uma espátula.
   2. Adicionar 100 mg de fosfato de amónio dibásico ((NH 4)₂HPO₄, APD) e agitar para combinar.
      NOTA: O resíduo excessivo de fases líquidas deixadas na espátula resultará em um desequilíbrio de proporção dos componentes da tinta e, portanto, da cinética de ajuste.
   3. Adicione uma bola de zircônia de 25 mm, prenda a tampa e coloque-a dentro de um moinho planetário por 60 minutos a 180 rpm, parando no meio do caminho para raspar as laterais do frasco com uma espátula.
   4. Usando uma espátula, carregue a tinta em uma seringa de 1 mL. Envolva adequadamente para evitar o contato com a umidade. Conservar a -20 °C se não for utilizado imediatamente.
3. Caracterização da microestrutura bone-ink
   1. Imprima a tinta de osso em água deionizada e deixe ajustada por 5 min.
   2. Lave a amostra 3x com etanol 100% e deixe secar completamente.
   3. Revestimento com uma fina camada (15 nm de espessura) de ouro.
   4. Capture micrografias usando um microscópio eletrônico de varredura de emissão de campo a uma tensão de aceleração de 5 kV.

2. Fabricação de suspensões de microgel para impressão

1. Síntese de GelMA
   NOTA: Este procedimento foi testado para tamanhos de lote constituídos por 10 g e 20 g de gelatina. Este método detalha as medições de um lote usando 10 g.
   1. Fazer uma solução a 10% p/p de gelatina tipo A (suína, resistência Bloom 300) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 1x, pesando 10 g de gelatina e adicionando-a a um balão cónico com 90 ml de PBS. Aqueça a 50 °C enquanto mexe até que a gelatina esteja completamente dissolvida.
   2. Adicionar 5.796 mL de anidrido metacrílico. Colocar uma tampa de borracha no balão cónico e continuar a agitar no escuro a 50 °C durante 90 minutos.
      CUIDADO: O anidrido metacrílico é tóxico se inalado ou engolido e é irritante para a pele e os olhos. Manuseie apenas dentro de um exaustor e use EPIs apropriados.
   3. Apagar a reacção diluindo o conteúdo do balão cónico duas vezes com PBS.
   4. Decante em tubos de 50 mL e centrifuga a 3.000 × g à temperatura ambiente por 3 min para remover anidrido metacrílico não reagido.
   5. Dializar o sobrenadante no interior de tubos de diálise de celulose de corte de 14 kDa contra a água desionizada a 40 °C durante 5 dias, agitando suavemente. Substitua a água deionizada todos os dias.
   6. Prepare-se para o armazenamento decantando em tubos de 50 mL, prendendo a tampa e colocando-a na geladeira por 12 h. Armazenar em geladeira por até 7 dias.
   7. Congelar com azoto líquido e liofilizar imediatamente durante 5 dias a -54 °C e 0,4 mbar.
      NOTA: Certifique-se de que os tubos não contenham mais de 40 ml de líquido durante o congelamento. Uma vez congelada, substitua a tampa por uma cobertura que permita a troca gasosa, como uma delicada limpeza de tarefas presa com um elástico.
   8. Conservar a espuma resultante num congelador a -20 °C até ser necessário para a síntese da suspensão de microgel.
2. Síntese de microgéis GelMA
   NOTA: Os microgéis são sintetizados usando um método de emulsão de água em óleo¹³ (Figura 2). Este método foi testado para volumes de solução de GelMA de 1-10 mL. O mesmo protocolo pode ser usado para sintetizar microgéis de gelatina usados para imprimir impressões ósseas autônomas.
   1. Fazer uma solução de GelMA a 10% p/p em PBS pesando o GelMA liofilizado, adicionando-o a um tubo com PBS e aquecendo em banho-maria a 50 °C até ficar totalmente hidratado.
   2. Adicione 37 mL de óleo por 1 mL de solução de GelMA a um copo, garantindo que ele não esteja mais do que 65% cheio.
   3. Configure um sistema de copo duplo em uma placa quente com agitação magnética, colocando o copo contendo óleo dentro de um copo maior.
      NOTA: O tamanho dos dois copos deve ser tal que o gelo possa ser facilmente jogado no espaço entre suas paredes. A configuração é mostrada na Figura 2.
   4. Aqueça a 40 °C enquanto agita.
      NOTA: Certifique-se de que o vórtice não é turbulento e tem uma profundidade de aproximadamente 1/3 da altura do óleo no béquer.
   5. Carregue a solução de GelMA numa seringa e adicione-a gota a gota ao óleo de agitação através de um filtro de 0,45 μm. Deixe a emulsão se equilibrar por 10 min.
   6. Reduzir a temperatura da emulsão para 15 °C para estabilizar termicamente as esferas, adicionando gelo triturado no espaço entre os dois béqueres.
   7. Adicionar acetona à emulsão giratória numa proporção de volume de 1:11 GelMA solução para acetona.
      NOTA: Adicione a acetona suavemente através de um funil para evitar interromper a emulsão. Mexa por 60 min.
   8. Decantar o conteúdo do copo em tubos de 50 mL, certificando-se de lavar as paredes do copo com acetona. Deixe por 20 min para permitir que os microgéis desidratados se depositem no fundo.
   9. Descarte o sobrenadante e lave pelo menos 2x com acetona.
      NOTA: O sobrenadante deve ser claro.
   10. Consolide em um tubo, recarregue com acetona e sonicate por 10 s. Lave 2x com acetona.
   11. Conservar em acetona à temperatura ambiente até ser necessário para impressão.
3. Preparação da suspensão de microgel GelMA para impressão
   1. Preparar uma solução a 1% p/p de GelMA no meio Eagle Modificado (DMEM) da Dulbecco, pesando GelMA liofilizado num tubo, adicionando DMEM e aquecendo em banho-maria a 50 °C até ficarem totalmente hidratados.
   2. Evaporar a acetona dos microgéis desidratados e pesar o pó resultante num tubo. Adicione acetona e transfira para um ambiente estéril.
   3. Para formar a suspensão de microgel, evapore a acetona e adicione DMEM, solução de GelMA a 1% p/p em DMEM e solução de iniciador de fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato de lítio a 2,5% p/p para obter uma fração de embalagem final de 30%. Deixe hidratar completamente por pelo menos 12 h à temperatura ambiente. Armazenar em geladeira por até 7 dias. Deixe subir à temperatura ambiente antes de usar.
      NOTA: Os volumes desses reagentes são baseados no peso seco dos microgéis e podem ser calculados usando as equações da Tabela 1.

	Equação
	x = peso dos microgéis secos (mg)
Volume de 1% p/p GelMA em DMEM, a (μL)	a = 21,93x
Volume de DMEM, b (μL)	b = 8,773x
Volume de solução de LAP a 2,5% p/p, c (μL)	c = 0,6267x
Volume total de suspensão de microgel produzido (μL)	a + b + c

Tabela 1: Equações para o cálculo dos volumes de reagentes necessários para hidratar as suspensões de microgel GelMA. Abreviaturas: GelMA = metacrilato de gelatina; LAP = fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato de lítio.

Figura 2: Esquema do método óleo-emulsão utilizado para a síntese de microgel. A configuração de copo duplo mostra um copo contendo a emulsão de agitação (indicada por seta) colocada dentro de um copo maior para permitir o resfriamento. Abreviação: GelMA = metacrilato de gelatina Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Impressão de tinta de osso em suspensões celulares

NOTA: Os microgéis à base de gelatina suportam a adesão de muitos tipos diferentes de células, o que torna esta abordagem passível de células únicas e múltiplas dentro da matriz de microgel. Este protocolo descreve o procedimento para o uso de células-tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo (ADSCs), pois este é um tipo de célula popular e robusto para a engenharia de tecidos musculoesqueléticos.

1. Culturar os ADSCs em DMEM de baixa glicose suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina a 37 °C e 5% de CO₂ até confluente.
2. Retirar os ADSCs do balão de cultura de tecidos, removendo o meio, lavando com PBS estéril e incubando a 37 °C e 5% de CO₂ com tripsina a 0,25% por 3 min.
3. Pellet as células por centrifugação a 150 × g à temperatura ambiente durante 5 min.
4. Conte as células e calcule 5 × 10⁵ células para cada 1 ml de microgéis GelMA. Aloque o volume necessário de suspensão de células a um tubo e pellet separados, como acima.
5. Retire cuidadosamente o máximo de sobrenadante possível usando uma pipeta, deixando apenas a pastilha celular. Adicione o volume necessário de suspensão de microgel ao pellet e aspirar suavemente para garantir uma distribuição celular uniforme.
   NOTA: Se houver excesso de bolhas de ar na suspensão, centrifugar suavemente para remover e pipetar para cima e para baixo para redistribuir as células.
6. Carregue a suspensão de microgel carregada de células em um reator usando uma pipeta.
   NOTA: No presente estudo, foram impressos em 3D reatores de 10 mm x 10 mm x 3 mm com capacidade de volume de 100 μL.
7. Deposite tinta óssea usando uma seringa de 1 mL equipada com uma agulha de 23 G.
   NOTA: Isso pode ser feito com uma impressora 3D adaptando um sistema de extrusão que permita imprimir diretamente da seringa de 1 mL ou carregando a tinta óssea diretamente no cartucho de extrusão da impressora (Figura 3).
8. Cruze a construção de microgel GelMA carregada de tinta celular e óssea com uma lâmpada de reticulação UV (405 nm) por 90 s. Transfira imediatamente para uma placa de poço de tamanho apropriado e cubra com DMEM completo.
   NOTA: Os reatores impressos em 3D acima mencionados cabem dentro de placas de cultura de células de 24 poços.
9. Incubar a 37 °C e 5% de CO₂. Substitua o meio de cultura após 24 h, depois a cada 48-72 h, conforme necessário.

Figura 3: Representação esquemática do procedimento COBICS mostrando a hidratação dos microgéis, incorporação de células e posterior impressão de tinta óssea na suspensão de microgel carregada de células. Abreviação: COBICS = bioimpressão omnidirecional cerâmica em suspensões celulares; GelMA = metacrilato de gelatina. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Avaliação da viabilidade celular e da proliferação

1. Para avaliar a citotoxicidade da tinta óssea, mantenha as construções COBICS carregadas de células em meio de cultura completo. Realize um ensaio Live Dead às 24 h, 72 h e 120 h (ou pontos de tempo relevantes).
2. Em cada ponto de tempo, lave as construções com PBS e, em seguida, adicione uma solução de DMEM livre de fenol contendo calceína 4 mM e brometo de etídio 2 mM. Incubar durante 1 h a 37 °C e 5% de CO₂.
3. Lavar com PBS e transferir para um prato com fundo de vidro para obtenção de imagens com um microscópio confocal nos espectros Ex/Em de 494/517 nm e 528/617 nm.

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Resultados

A COBICS imprime construções complexas e biologicamente relevantes sem a necessidade de materiais de suporte sacrificiais ou etapas severas de pós-processamento (por exemplo, radiação e sinterização a alta temperatura), que são dois dos maiores desafios na fabricação aditiva de construções miméticas ósseas. Para demonstrar a formação de COBICS de estruturas ósseas complexas e a co-impressão de células em suspensões de microgel, foram obtidas imagens representativas de compósitos ósseos feitos de tin...

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Discussão

A técnica de impressão 3D COBICS foi desenvolvida para permitir a fabricação de estruturas mineralizadas semelhantes a ossos por extrusão em uma suspensão de microgel reticulável contendo células vivas. A técnica tem sido aplicada a uma suspensão de microgel degradável, e as células apresentam boa viabilidade, disseminação e capacidade de diferenciação osteogênica dentro do sistema¹¹. Um determinante chave do sucesso de construções criadas usando essa técnica é a síntese adeq...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D Printer Extruder	Hyrel3D	EMO-25
50 mL centrifuge tubes	Falcon	BDAA352070
Absolute Ethanol 100% Denatured	Chem-Supply
Acetone	Chem-Supply	154871
Alumina crucible	Coors
Ammonium phosphate dibasic (NaHPO4)	Sigma	A5764
Autodesk Fusion 360	Autodesk
Biosafety cabinet level 2
Calcium carbonate	Sigma	239216
Calcium hydrogen phosphate (CaHPO4)	Sigma	C7263
Cell culture flasks	Corning		various volumes used
Cellulose Dialysis Tubes, 14 kDa cut-off	Sigma	D9777
Centrifuge	Eppendorf	5430R
Centrifuge	Sigma	3-16KL
Dispensing Tip, 23 G	Nordson	7018302
DMEM, low glucose, pyruvate	Thermo FIsher	11885084
DPBS, no calcium, no magnesium	Thermo FIsher	14190144
Elevator furnace	Labec
Engine HR Multihead Printer	Hyrel3D
Fetal Bovine Serum	Bovogen
Gelatin type A, from porcine skin	Sigma	G2500
General Purpose Stainless Steel Tips	Nordson EF
Glycerol	Sigma	G9012
Human adipose derived stem cells	ATCC	PCS-500-011
LSM 800 Confocal Microscope	ZEISS
Lyophilizer (Alpha 1-4 LDplus)	Christ	101541
Magnetic hot plate and stirrer
Methacrylic anhydride	Sigma	276685
Mini 2 Desktop 3D Printer	LulzBot
Parafilm sealing film	Parafilm	PM996
Penicillin-Streptomycin	Thermo FIsher	15140122
Planetary ball mill
Planetary ball mill jar
Polyoxyethylenesorbitan monooleate Tween-80	Sigma	P6224
Scanning electron microscope	FEI Nova NanoSEM 450 FE-SEM
Science Kimwipes Delicate Task Wipers	Kimtech	18813156
Stainless steel standard test sieve
Sunflower Oil	Community Co
Trypsin-EDTA 0.25% phenol red	Thermo FIsher	25200056
ZEN Microscope Software	ZEISS
Live/Dead viability/ cytotoxicity kit for mammalian cells	Invitrogen	L3224
DMEM, low glucose, no phenol red	Thermo Fisher	11054020