뼈 유사체 생성을 위한 세포 함유 현탁액의 세라믹 전방향 바이오프린팅

요약

이 프로토콜은 젤라틴 기반 과립 지지체에 인산 칼슘 잉크를 증착하여 뼈와 같은 구조를 제조하는 3D 프린팅 기술을 설명합니다. 인쇄된 뼈 유사체는 다상 구축물을 위한 살아있는 세포 매트릭스 내에서 인쇄물의 직접 수확 또는 가교를 위한 유연성과 함께 자유 형태로 증착됩니다.

초록

구조적으로 뼈 조직은 계층적이고 고도로 광물화된 매트릭스 내에 내장된 대사 활성 세포를 포함하는 무기-유기 복합체입니다. 이 조직은 뼈의 이질적인 환경으로 인해 복제하기가 어렵습니다. 세포 현탁액의 세라믹 전 방향 바이오 프린팅 (COBICS)은 뼈의 미네랄 및 세포 구조를 독특하게 복제하는 마이크로 젤 기반 바이오 프린팅 기술입니다. COBICS는 뼈 모방 구조물의 적층 제조에서 가장 큰 두 가지 과제인 희생 지지 재료나 가혹한 후처리 단계(예: 방사선 및 고온 소결)가 필요 없이 복잡하고 생물학적으로 관련된 구조물을 인쇄합니다. 이 기술은 젤라틴 기반 마이크로겔 현탁액 내에서 새로운 인산칼슘 기반 잉크의 자유형 압출을 통해 가능합니다. 현탁액의 항복 응력 특성은 증착을 허용하고 인쇄된 뼈 구조를 지지합니다. UV 가교 및 나노 침전은 제자리에 "고정"됩니다. 세포가 함유된 생체 재료 내에서 나노 구조의 뼈 모방 세라믹을 인쇄하는 기능은 거시적 및 미시적 아키텍처에 대한 시공간 제어를 제공하고 임상 환경에서 복잡한 뼈 구조의 실시간 제조를 용이하게 합니다.

서문

뼈는 내인성 치유^{능력이 손상되었을} 때 치명적인 결함 크기까지 정상적인 세포 구성, 방향 및 기계적 강도를 재현하여 치유할 수 있는 신체의 몇 안 되는 구조 중 하나로서 놀라운 재생 능력을 가지고 있습니다1. 뼈는 연골 및 인대와 함께 신체 움직임을 지원하고 촉진하는 동시에 미네랄과 지방을 저장하고 혈액 세포를 생성합니다. 단단하고 조밀 한 결합 조직으로서 뼈는 주로 무기상, 물 및 콜라겐 섬유로 주로 구성된 유기 물질로 구성됩니다². 세포는 콜라겐 I 섬유와 수산화인회석(HA) 결정의 고도로 광물화된 매트릭스 내에 내장되어 계층적 구조³를 형성합니다.

이 조직의 복잡한 조직은 이질적인 뼈 마이크로 및 나노 환경을 복제하기 위한 합성 대안의 제조를 매우 어렵게 만듭니다³. 이를 위해 바이오 세라믹, 세포 함유 하이드로 겔 및 합성 재료를 포함한 다양한 재료가 뼈 매트릭스를 만드는 솔루션으로 제안되었습니다. 비계 제조 기술 중 3D 프린팅 기반 기술이 최근에 등장하여 환자 맞춤형 치료의 큰 가능성을 가진 매우 정교하고 정밀한 구조의 제조를 허용하는 놀라운 능력으로 인해 조직 공학 커뮤니티에서 많은 관심을 받았습니다.^4,5,6 . 하이드로겔은 매트릭스 모조물 및 바이오잉크의 가장 인기 있는 선택이었으며, 이는 이들이 세포 및 생리활성 분자와 함께 인쇄되어 기능적 구축물⁶을 생성할 수 있기 때문이다. 그러나 하이드로겔은 기계적 강도와 대사 활성 세포를 포함하는 고도로 석회화된 무기상과 같은 뼈의 기능적 특성이 부족합니다.

3D 인쇄 된 세라믹 스캐 폴드는 일반적으로 소결, 고온 처리 또는 시험관 내 또는 생체 내 응용 프로그램 전에 철저히 세척해야하는 가혹한 화학 물질 사용을 포함한 후 처리 단계가 필요합니다⁵. 이러한 한계를 해결하기 위해 Lode et ^al.7 은 최근 생리적 조건에서 인쇄 및 설정할 수 있는 하이드록시아파타이트로 형성된 α-인산삼칼슘 기반 페이스트를 개발했습니다. 그러나 이 물질은 습한 환경에서 후처리가 필요하고 장기간 수용액에 담가야 하기 때문에 여전히 살아있는 세포와 함께 인쇄할 수 없습니다.

대안적으로, 무기 입자가 혼입된 세포 함유 하이드로겔이 3D 뼈 매트릭스 ^8,9의 대체물로서 제안되었다. 세포 생존력을 지원하는 뛰어난 능력에도 불구하고 조밀하게 광물화된 뼈 조직 환경을 요약할 수 없습니다. Thrivikarman et ^al.10은 나노 스케일 아파타이트 침착을 더 잘 모방하기 위해 비 콜라겐 단백질 유사체와 함께 과포화 칼슘 및 인산염 배지를 사용하는 생체 모방 접근법을 채택했다. 그러나 이들의 구조는 여전히 뼈대와 유사한 마이크로 및 매크로 스케일 아키텍처를 가진 견고한 3D 구조를 생성할 수 없습니다.

본 연구는 세포와 성장 인자¹¹을 모두 통합 할 수있는 무기 및 유기 단계에서 뼈 모방 구조물을 제조하기위한 인쇄 전략의 개발을 통해 이러한 단점을 해결합니다. COBICS는 마이크로젤 기반 바이오프린팅 기술을 사용하여 뼈의 미네랄 및 세포 구조를 독특하게 요약합니다. 본원의 프로토콜은 세라믹 본-잉크 및 젤라틴-기반 마이크로겔을 합성하고, 이어서 COBICS를 가능하게 하는 세포를 조합하는 과정을 설명한다. 이 공정은 뼈 잉크의 주요 전구체 물질의 합성으로 시작됩니다. 그런 다음 가교성 하이드로겔을 합성하여 마이크로겔로 형성합니다. 마지막으로, 뼈 잉크는 세포가 담긴 마이크로젤의 지지 수조에 전방향으로 증착됩니다(그림 1).

본-잉크는 적절한 항복-응력 특성, 즉 특정 전단 속도에서 유동화하고 후속적으로 증착된 구조를 지지하는 능력을 갖는 마이크로겔의 임의의 현탁액에 인쇄될 수 있다. 두 가지 유연한 접근법이 입증되었습니다 : 젤라틴 마이크로 겔로 구성된 현탁액과 젤라틴 메타 크릴 레이트 (GelMA) 마이크로 겔로 구성된 현탁액. 전자의 현탁액은 온도가 37°C로 상승될 때, 부유된 하이드로겔의 자유형 가역적 임베딩(FRESH) 기술(¹²)에서 용해되는 반면, 후자는 인쇄 후에 광가교결합될 수 있고, 마이크로겔을 효과적으로 "스티칭"하고 인쇄된 뼈-잉크를 제자리에 고정시킬 수 있다. 본 연구는 복잡한 뼈 모방 구조의 현장 인쇄로 세포 성장을 지원할 수 있다는 독특한 이점을 제공하기 때문에 GelMA를 매트릭스로 사용하는 데 중점을 둡니다. 궁극적으로 이 접근 방식은 질병 모델링, 약물 발견 및 재생 공학에 대한 높은 수준의 생체 모방과 광범위한 영향을 가진 복잡한 조직 모델의 생성을 가능하게 합니다.

그림 1: 워크플로의 개략도 . (A) 뼈 잉크는 α-인산 삼칼슘 합성과 글리세롤, 폴리소르베이트 80 및 인산이염기성 암모늄과의 후속 조합에서 시작하여 합성됩니다. (B) GelMA 마이크로젤은 유중수 에멀젼 방법으로 제조됩니다. 수득 된 마이크로 겔은 (C) 수화되고 (D) 세포와 결합된다. 세포-마이크로겔 복합체는 뼈-잉크가 증착되는 과립 욕조로 사용됩니다. (E) 그런 다음 전체 구축물을 UV 가교하여 배양을 위해 인큐베이터로 옮깁니다. 약어 : α-TCP = α- 인산 삼 칼슘; 겔마 = 젤라틴 메타크릴레이트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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프로토콜

1. 뼈 잉크 제작

1. α-인산삼칼슘의 합성
   1. 인산 수소 칼슘 (CaHPO₄)과 탄산 칼슘 (CaCO 3) 분말을₃ : 2 Ca:P 몰비로 계량합니다. 주걱을 사용하여 두 분말을 완전히 균질화하십시오.
   2. 인산 수소 칼슘-탄산 칼슘 분말 혼합물을 지르코니아 도가니에 첨가하여 75 % 이하가되도록합니다.
      알림: 오염을 방지하려면 새 도가니 또는 이전에 동일한 재료를 만드는 데 사용한 도가니를 사용하십시오. 청소하려면 100% 에탄올로 헹구고 분말을 추가하기 전에 완전히 건조될 때까지 흄 후드에서 자연 건조하십시오.
   3. 도가니를 용광로로 옮깁니다. 5 °C/min의 속도로 1,400°C로 가열하고 3시간 동안 유지합니다.
   4. 용광로에서 도가니를 제거하여 반응을 담금질하고 내화 블록 위에 두십시오. 취급하기 전에 완전히 식히십시오.
      알림: 적절한 길이의 도가니 집게를 사용하고 적절한 열 보호를 보장하십시오.
   5. 박격포와 유봉을 사용하여 α-TCP 케이크를 깨고 갈아서 생성 된 과립의 최대 크기가 200μm가되도록합니다.
      알림: 올바른 입자 크기를 보장하기 위해 표준 스테인리스 스틸 체를 사용하십시오.
   6. 유성 분쇄기를 사용하여 과립을 2 단계로 더 분쇄하십시오. 먼저 3mm 이트리아 안정화 지르코니아 볼을 8 : 1 볼 : 분말의 중량비로 추가 한 다음 100 % 에탄올을 3 : 1 에탄올 : 분말의 중량비로 첨가합니다. 뚜껑을 단단히 닫고 180rpm에서 2시간 동안 분쇄합니다.
   7. 현탁액을 모으고 세척을 위해 100 % 에탄올을 사용하여 볼을 분리하십시오.
   8. 현탁액을 120°C의 오븐에서 24시간 동안 건조시킨다.
   9. 건조 된 분말을 1mm 지르코니아 볼과 100 % 에탄올로 분쇄 용기에 첫 번째 단계와 동일한 중량비로 첨가하십시오. 180rpm에서 2시간 동안 분쇄하고 분리하고 건조시킵니다.
      참고: 전체 합성 절차는 그림 1A에 나와 있습니다.
2. 뼈 잉크의 배합
   1. 뼈 잉크를 만들려면 주걱으로 계속 저으면서 글리세롤 630μL와 폴리소르베이트 80 130μL가 포함된 볼 밀 용기에 α-TCP 분말 2g을 추가합니다.
   2. 인산암모늄 이염기성((NH₄)₂HPO₄, APD) 100mg을 넣고 섞이도록 저어줍니다.
      참고: 주걱에 액체 상의 과도한 잔류물이 남아 있으면 잉크 구성 요소의 비율 불균형이 발생하여 경화 역학이 발생합니다.
   3. 25mm 지르코니아 볼을 넣고 뚜껑을 단단히 고정한 다음 180rpm에서 60분 동안 유성 밀 안에 넣고 중간에 멈춰 주걱으로 항아리의 측면을 긁어냅니다.
   4. 주걱을 사용하여 잉크를 1mL 주사기에 넣습니다. 습기와의 접촉을 피하기 위해 적절하게 포장하십시오. 즉시 사용하지 않을 경우 -20 ° C에서 보관하십시오.
3. 뼈 잉크 미세 구조 특성화
   1. 뼈 잉크를 탈이온수에 인쇄하고 5분 동안 그대로 둡니다.
   2. 샘플을 100 % 에탄올로 3 회 세척하고 완전히 건조시킵니다.
   3. 얇은 금 층 (두께 15nm)으로 코팅하십시오.
   4. 5kV의 가속 전압에서 전계 방출 주사 전자 현미경을 사용하여 현미경 사진을 캡처합니다.

2. 인쇄용 마이크로젤 현탁액 제조

1. 겔마의 합성
   알림: 이 절차는 10g과 20g의 젤라틴으로 구성된 배치 크기에 대해 테스트되었습니다. 이 방법은 10g을 사용하는 배치에 대한 측정을 자세히 설명합니다.
   1. 젤라틴 10g의 무게를 달고 90mL의 PBS가 있는 원뿔형 플라스크에 추가하여 1x 인산염 완충 식염수(PBS)에 젤라틴 유형 A(돼지, 블룸 강도 300)의 10% w/w 용액을 만듭니다. 젤라틴이 완전히 용해될 때까지 교반하면서 50°C로 가열한다.
   2. 메타크릴 무수물 5.796mL를 추가합니다. 원뿔형 플라스크에 고무 캡을 놓고 50 ° C의 어두운 곳에서 90 분 동안 계속 교반합니다.
      주의 : 메타 크릴 무수물은 흡입하거나 삼키면 독성이 있으며 피부와 눈을 자극합니다. 흄 후드 내부만 다루고 적절한 PPE를 사용하십시오.
   3. 원뿔형 플라스크의 내용물을 PBS로 2배 희석하여 반응을 담금질합니다.
   4. 50mL 튜브에 디캔트하고 실온에서 3,000× g 에서 3분 동안 원심분리하여 미반응 메타크릴산 무수물을 제거합니다.
   5. 상청액을 14 kDa 컷오프 셀룰로스 투석관 내부의 탈이온수에 대해 40°C에서 5일 동안 부드럽게 교반하면서 투석한다. 탈이온수를 매일 교체하십시오.
   6. 50mL 튜브에 디캔팅하고 캡을 고정한 다음 냉장고에 12시간 동안 넣어 보관 준비를 합니다. 냉장고에 최대 7 일 동안 보관하십시오.
   7. 액체 질소를 사용하여 동결하고 즉시 -54 °C 및 0.4 mbar에서 5 일 동안 동결 건조한다.
      알림: 냉동 시 튜브에 40mL 이하의 액체가 들어 있는지 확인하십시오. 얼면 뚜껑을 탄성 밴드로 고정 된 섬세한 작업 물티슈와 같은 가스 교환이 가능한 덮개로 교체하십시오.
   8. 생성된 폼을 마이크로겔 현탁액 합성에 필요할 때까지 -20°C의 냉동고에 보관하십시오.
2. 겔마 마이크로젤의 합성
   참고: 마이크로겔은 유중수 에멀젼 방법¹³ 을 사용하여 합성됩니다(그림 2). 이 방법은 1-10 mL의 GelMA 용액 부피에 대해 테스트되었습니다. 동일한 프로토콜을 사용하여 독립형 뼈 인쇄물을 인쇄하는 데 사용되는 젤라틴 마이크로젤을 합성할 수 있습니다.
   1. 동결건조된 GelMA를 칭량하고, PBS가 있는 튜브에 첨가하고, 완전히 수화될 때까지 50°C의 수조에서 가열하여 PBS에서 10% w/w GelMA 용액을 만듭니다.
   2. GelMA 용액 1mL당 오일 37mL를 비커에 추가하여 65% 이하로 가득 차 있는지 확인합니다.
   3. 더 큰 비커 내부에 오일이 포함된 비커를 배치하여 자기 교반이 가능한 핫 플레이트에 이중 비커 시스템을 설정합니다.
      알림: 두 비커의 크기는 얼음이 벽 사이의 공간에 쉽게 떨어질 수 있도록 해야 합니다. 설정은 그림 2에 나와 있습니다.
   4. 교반하면서 40 °C로 가열합니다.
      알림: 와류가 난류가 아니며 비커의 오일 높이의 약 1/3 깊이인지 확인하십시오.
   5. GelMA 용액을 주사기에 넣고 0.45μm 필터를 통해 교반 오일에 적가합니다. 에멀젼이 10분 동안 평형을 이루도록 합니다.
   6. 에멀젼의 온도를 15°C로 낮추어 두 비커 사이의 공간에 분쇄된 얼음을 추가하여 구체를 열적으로 안정화시킵니다.
   7. 아세톤에 대한 1:11 GelMA 용액의 부피비로 방사 에멀젼에 아세톤을 첨가한다.
      알림: 에멀젼이 손상되지 않도록 깔때기를 통해 아세톤을 부드럽게 첨가하십시오. 60분 동안 저어줍니다.
   8. 비커의 내용물을 50mL 튜브에 넣고 비커의 벽을 아세톤으로 씻으십시오. 탈수 된 마이크로 젤이 바닥에 가라 앉을 수 있도록 20 분 동안 그대로 두십시오.
   9. 상청액을 버리고 아세톤으로 최소 2x 세척하십시오.
      알림: 상청액은 깨끗해야 합니다.
   10. 하나의 튜브로 통합하고 아세톤으로 채우고 10 초 동안 초음파 처리합니다. 아세톤으로 2 번 씻으십시오.
   11. 인쇄에 필요할 때까지 실온에서 아세톤에 보관하십시오.
3. 인쇄를 위한 GelMA 마이크로젤 현탁액 준비
   1. 동결 건조 된 GelMA를 튜브에 칭량하고 DMEM을 첨가하고 완전히 수화 될 때까지 50 ° C의 수조에서 가열하여 Dulbecco의 변형 된 독수리 배지 (DMEM)에서 GelMA의 1 % w / w 용액을 준비합니다.
   2. 탈수 된 마이크로 겔에서 아세톤을 증발시키고 생성 된 분말을 튜브에 칭량합니다. 아세톤을 첨가하고 멸균 환경으로 옮깁니다.
   3. 마이크로겔 현탁액을 형성하려면 아세톤을 증발시키고 DMEM, DMEM에 1% w/w GelMA 용액 및 2.5% w/w 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트(LAP) 개시제 용액을 추가하여 최종 패킹 분율 30%를 달성합니다. 실온에서 최소 12시간 동안 완전히 수분을 공급하십시오. 냉장고에 최대 7 일 동안 보관하십시오. 사용하기 전에 실온에 도달하십시오.
      참고: 이러한 시약의 부피는 마이크로젤의 건조 중량을 기준으로 하며 표 1의 방정식을 사용하여 계산할 수 있습니다.

	방정식
	x = 건조 마이크로젤의 중량(mg)
DMEM에서 1 % w / w 겔마의 부피 (μL)	ᅡ = 21.93배
DMEM의 부피, b (μL)	b = 8.773배
2.5 % w / w LAP 용액의 부피, c (μL)	씨 = 0.6267배
생성 된 마이크로 겔 현탁액의 총 부피 (μL)	a + b + c

표 1: GelMA 마이크로겔 현탁액을 수화하는 데 필요한 시약의 부피를 계산하기 위한 방정식. 약어 : GelMA = 젤라틴 메타 크릴 레이트; LAP = 리튬 페닐 -2,4,6- 트리메틸 벤조일 포스 피 네이트.

그림 2: 마이크로겔 합성에 사용되는 오일-에멀젼 방법의 개략도. 이중 비커 설정은 냉각을 허용하기 위해 더 큰 비커 내부에 배치된 교반(화살표로 표시된) 에멀젼을 포함하는 비커를 보여줍니다. 약어: GelMA = 젤라틴 메타크릴레이트 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. 셀 현탁액에 뼈 잉크 인쇄

참고: 젤라틴 기반 마이크로젤은 다양한 세포 유형의 접착을 지원하므로 이 접근 방식은 마이크로젤 매트릭스 내의 단일 및 다중 세포에 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 근골격계 조직 공학에 널리 사용되고 강력한 세포 유형인 지방 유래 중간엽 줄기세포(ADSC)를 사용하는 절차를 설명합니다.

1. ADSC를 합류할 때까지 37°C 및 5%_CO2 에서 10% 태아 소 혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 저포도당 DMEM에서 배양한다.
2. 배지를 제거하고, 멸균 PBS로 세척하고, 3분 동안 0.25% 트립신과 함께 37°C 및 5%_CO2 에서 인큐베이션함으로써 조직 배양 플라스크로부터 ADSCs를 분리한다.
3. 실온에서 5분 동안 150× g 으로 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다.
4. 세포를 세고 GelMA 마이크로젤 1mL당 5 ×^{10 5} 세포를 계산합니다. 필요한 양의 세포 현탁액을 위와 같이 별도의 튜브와 펠릿에 할당합니다.
5. 피펫을 사용하여 가능한 한 많은 상청액을 조심스럽게 제거하고 세포 펠릿 만 남겨 둡니다. 필요한 양의 마이크로젤 현탁액을 펠릿에 추가하고 부드럽게 흡인하여 균일한 세포 분포를 보장합니다.
   알림: 현탁액에 과도한 기포가 있는 경우 부드럽게 원심분리하여 제거하고 위아래로 피펫팅하여 세포를 재분배합니다.
6. 세포가 함유된 마이크로겔 현탁액을 피펫을 사용하여 반응기에 로드합니다.
   참고: 본 연구에서는 부피 용량이 100μL인 10mm x 10mm x 3mm 반응기를 3D 프린팅했습니다.
7. 23G 바늘이 장착된 1mL 주사기를 사용하여 뼈 잉크를 넣습니다.
   참고: 3D 프린터에서는 1mL 주사기에서 직접 인쇄할 수 있는 압출 시스템을 개조하거나 뼈 잉크를 프린터의 압출 카트리지에 직접 로드하여 이 작업을 수행할 수 있습니다(그림 3).
8. 셀 및 뼈 잉크가 함유된 GelMA 마이크로겔 구조체를 UV 가교제 램프(405nm)로 90초 동안 가교결합합니다. 즉시 적절한 크기의 웰 플레이트로 옮기고 완전한 DMEM으로 덮습니다.
   참고: 앞서 언급한 3D 프린팅 반응기는 24웰 세포 배양 플레이트 내부에 맞습니다.
9. 37°C 및 5%_CO2에서 배양한다. 배양 배지를 24시간 후에 교체한 다음 필요에 따라 48-72시간마다 교체합니다.

그림 3 : 마이크로 젤의 수화, 세포의 통합 및 세포가 함유 된 마이크로 젤 현탁액에서 뼈 잉크의 후속 인쇄를 보여주는 COBICS 절차의 개략적 표현. 약어 : COBICS = 세포 현탁액의 세라믹 전 방향 바이오 프린팅; 겔마 = 젤라틴 메타크릴레이트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. 세포 생존율 및 증식 평가

1. 뼈 잉크 세포 독성을 평가하려면 세포가 함유된 COBICS 구조물을 완전한 배양 배지에 보관하십시오. 24시간, 72시간 및 120시간(또는 관련 시점)에 Live Dead 분석을 수행합니다.
2. 각 시점에서, 작제물을 PBS로 세척한 다음, 4 mM 칼세인 및 2 mM 에티듐 브로마이드를 함유하는 페놀-프리 DMEM 용액을 첨가한다. 37°C 및 5%_CO2에서 1시간 동안 배양한다.
3. PBS로 세척하고 유리 바닥 접시로 옮겨 494/517nm 및 528/617nm의 Ex/Em 스펙트럼에서 컨포칼 현미경으로 이미징합니다.

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결과

COBICS는 뼈 모방 구조물의 적층 제조에서 가장 큰 두 가지 과제인 희생 지지 재료나 가혹한 후처리 단계(예: 방사선 및 고온 소결)가 필요 없이 복잡하고 생물학적으로 관련된 구조물을 인쇄합니다. 복잡한 뼈 구조의 COBICS 형성 및 마이크로 겔 현탁액에서 세포의 공동 인쇄를 입증하기 위해 뼈 잉크로 만든 뼈 모양의 복합체의 대표 이미지를 취하고 최대 7 일 동안 COBICS에서 ADSC 생존력의 반 정량 분?...

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토론

3D 프린팅 기술 COBICS는 압출을 통해 살아있는 세포를 포함하는 가교 결합 가능한 마이크로 겔 현탁액으로 광물화 된 뼈와 같은 구조를 제조 할 수 있도록 개발되었습니다. 상기 기술은 분해가능한 마이크로겔 현탁액에 적용되었고, 세포는 시스템⁽¹¹) 내에서 양호한 생존력, 확산 및 골형성 분화 능력을 나타낸다. 이 기술을 사용하여 생성 된 구문의 성공을 결정하는 핵심 요소는 α...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D Printer Extruder	Hyrel3D	EMO-25
50 mL centrifuge tubes	Falcon	BDAA352070
Absolute Ethanol 100% Denatured	Chem-Supply
Acetone	Chem-Supply	154871
Alumina crucible	Coors
Ammonium phosphate dibasic (NaHPO4)	Sigma	A5764
Autodesk Fusion 360	Autodesk
Biosafety cabinet level 2
Calcium carbonate	Sigma	239216
Calcium hydrogen phosphate (CaHPO4)	Sigma	C7263
Cell culture flasks	Corning		various volumes used
Cellulose Dialysis Tubes, 14 kDa cut-off	Sigma	D9777
Centrifuge	Eppendorf	5430R
Centrifuge	Sigma	3-16KL
Dispensing Tip, 23 G	Nordson	7018302
DMEM, low glucose, pyruvate	Thermo FIsher	11885084
DPBS, no calcium, no magnesium	Thermo FIsher	14190144
Elevator furnace	Labec
Engine HR Multihead Printer	Hyrel3D
Fetal Bovine Serum	Bovogen
Gelatin type A, from porcine skin	Sigma	G2500
General Purpose Stainless Steel Tips	Nordson EF
Glycerol	Sigma	G9012
Human adipose derived stem cells	ATCC	PCS-500-011
LSM 800 Confocal Microscope	ZEISS
Lyophilizer (Alpha 1-4 LDplus)	Christ	101541
Magnetic hot plate and stirrer
Methacrylic anhydride	Sigma	276685
Mini 2 Desktop 3D Printer	LulzBot
Parafilm sealing film	Parafilm	PM996
Penicillin-Streptomycin	Thermo FIsher	15140122
Planetary ball mill
Planetary ball mill jar
Polyoxyethylenesorbitan monooleate Tween-80	Sigma	P6224
Scanning electron microscope	FEI Nova NanoSEM 450 FE-SEM
Science Kimwipes Delicate Task Wipers	Kimtech	18813156
Stainless steel standard test sieve
Sunflower Oil	Community Co
Trypsin-EDTA 0.25% phenol red	Thermo FIsher	25200056
ZEN Microscope Software	ZEISS
Live/Dead viability/ cytotoxicity kit for mammalian cells	Invitrogen	L3224
DMEM, low glucose, no phenol red	Thermo Fisher	11054020