Medição da rigidez hepática usando microscopia de força atômica acoplada à microscopia de polarização

Resumo

Apresentamos um protocolo para medir os módulos elásticos de áreas ricas em colágeno em fígado normal e doente usando microscopia de força atômica. O uso simultâneo da microscopia de polarização fornece alta precisão espacial para localizar áreas ricas em colágeno nas seções do fígado.

Resumo

O enrijecimento da matriz tem sido reconhecido como um dos principais impulsionadores da progressão da fibrose hepática. Tem efeitos profundos em vários aspectos do comportamento celular, como a função celular, diferenciação e motilidade. No entanto, como esses processos não são homogêneos em todo o órgão, tornou-se cada vez mais importante entender as mudanças nas propriedades mecânicas dos tecidos no nível celular.

Para poder monitorar o enrijecimento de áreas ricas em colágeno dentro dos lobos hepáticos, este trabalho apresenta um protocolo para a medição de módulos elásticos do tecido hepático com alta precisão espacial por microscopia de força atômica (AFM). AFM é um método sensível com o potencial de caracterizar propriedades mecânicas locais, calculadas como módulo de Young (também referido como elástico). A AFM associada à microscopia de polarização pode ser usada para localizar especificamente as áreas de desenvolvimento de fibrose com base na birrefringência das fibras colágenas nos tecidos. Usando o protocolo apresentado, caracterizamos a rigidez de áreas ricas em colágeno de fígados fibróticos de camundongos e áreas correspondentes nos fígados de camundongos controle.

Um aumento proeminente na rigidez das áreas positivas para colágeno foi observado com o desenvolvimento de fibrose. O protocolo apresentado permite um método altamente reprodutível de medição da AFM, devido ao uso de tecido hepático levemente fixo, que pode ser usado para aprofundar a compreensão das mudanças iniciadas pela doença nas propriedades mecânicas do tecido local e seu efeito sobre o destino das células vizinhas.

Introdução

O fígado é um órgão vital para a manutenção da homeostase em organismos ^1,2. As doenças hepáticas crônicas são responsáveis por ~ 2 milhões de mortes em todo o mundo anualmente³. Eles se originam mais comumente como infecções virais, distúrbios autoimunes, síndromes metabólicas ou doenças relacionadas ao abuso de álcool e são acompanhados por fibrose hepática progressiva. A lesão hepática provoca uma resposta inflamatória, o que leva à ativação de células depositando matriz extracelular (ECM) em uma resposta de cicatrização de feridas. No entanto, na presença de um insulto crônico, o excesso de MEC forma tecido cicatricial não resolvido dentro do fígado, levando ao desenvolvimento de fibrose hepática, cirrose, carcinoma hepático e, finalmente, à insuficiência hepática⁴.

A lesão de hepatócitos resulta imediatamente em aumento da rigidez hepática ^5,6. Isso afeta diretamente a função dos hepatócitos, ativa as células estreladas hepáticas (HSCs) e os fibroblastos portais e resulta em sua transdiferenciação para miofibroblastos depositantes de colágeno ^7,8. A deposição de ECM fibrosa aumenta ainda mais a rigidez hepática, criando um ciclo de feedback auto-amplificador de enrijecimento hepático e ativação celular produtora de matriz.

A rigidez hepática tornou-se, assim, um parâmetro importante no prognóstico da doença hepática. A alteração nas propriedades biomecânicas do tecido pode ser detectada mais cedo do que a fibrose pode ser diagnosticada por análise histológica. Portanto, várias técnicas para a medição da rigidez hepática foram desenvolvidas em pesquisas e aplicações clínicas. Em contextos clínicos, a elastografia transitória (TE)9,10,11,12,13 e a elastografia por ressonância magnética (MRE)^{14,15,16,17,18} têm sido empregadas para diagnosticar de forma não invasiva os estágios iniciais do dano hepático, examinando a rigidez hepática macroscópica ¹⁹.

Na TE, ondas ultrassonográficas de amplitude leve e baixa frequência (50 Hz) são propagadas pelo fígado, e sua velocidade é medida, que é então utilizada para o cálculo do módulo elástico tecidual¹³. No entanto, essa técnica não é útil para pacientes com ascite, obesidade ou espaços intercostais inferiores devido à transmissão inadequada das ondas ultrassonográficas através dos tecidos ao redor do fígado⁹.

A ERM é baseada na modalidade de ressonância magnética e usa ondas de cisalhamento mecânico de 20-200 Hz para atingir o fígado. Uma sequência específica de ressonância magnética é então utilizada para traçar as ondas dentro do tecido e calcular a rigidez tecidual¹⁶. Os valores de rigidez relatados com as técnicas de ET e ERM correlacionam-se bem com o grau de fibrose hepática obtido a partir de biópsias de amostras de fígado humano classificadas usando escores histológicos do METAVIR²⁰ (Tabela 1). A ET e a ERM também foram adaptadas para a mensuração da rigidez hepática em modelos de roedores para fins de pesquisa^21,22,23. No entanto, como ambos os métodos derivam os valores de rigidez da resposta do tecido às ondas de cisalhamento propagadoras, os valores obtidos podem não refletir a rigidez mecânica absoluta do tecido.

Para uma caracterização mecânica direta de fígados de roedores, Barnes et al. desenvolveram um ensaio modelo-gel-tecido (ensaio MGT) envolvendo a incorporação de tecido hepático em gel de poliacrilamida²⁴. Este gel é comprimido por uma força uniforme pulsada a partir da qual o módulo de Young pode ser calculado. O ensaio de MGT mostra uma boa correlação com um ensaio de indentação adaptado para fígados normais e fibróticos²⁴ (Tabela 1).

Tabela 1: Valores de rigidez hepática no nível do volume. TE e MRE em comparação com medições mecânicas ex vivo diretas de módulos elásticos hepáticos usando ensaios de recuo e MGT para fígados de diferentes fontes. A relação entre E e G é dada por E = 2G (1 + v), onde v é a razão de Poisson da amostra; F0 a F4 representam o escore de fibrose no sistema de pontuação METAVIR, com F0 denotando baixa ou nenhuma fibrose e F4 fígados cirróticos. Abreviaturas: TE = elastografia transitória; ERM = elastografia por ressonância magnética; MGT = modelo-gel-tecido; E = módulo elástico (de Young); G = módulo de cisalhamento. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Uma das principais desvantagens das medições genéricas de rigidez hepática é que elas não fornecem resolução em nível celular da heterogeneidade da rigidez no fígado. Durante a progressão da fibrose, áreas ricas em colágeno apresentam maior rigidez em relação ao parênquima circundante^25,26. Esse gradiente de rigidez influencia localmente as células residentes e desempenha um papel importante na condução da heterogeneidade do HSC²⁷. Assim, as alterações nas propriedades mecânicas locais durante o desenvolvimento da doença hepática precisam ser caracterizadas em um nível microscópico para entender melhor a progressão da fibrose.

O AFM permite que as propriedades mecânicas do tecido sejam medidas com alta resolução e alta sensibilidade à força. O AFM usa a ponta de um cantilever para recuar a superfície de uma amostra com forças tão baixas quanto vários piconewtons, induzindo uma deformação em um nível microscópico ou nanoscópico com base na geometria e no tamanho da ponta empregada. A resposta de força da amostra à deformação aplicada é então medida como a deflexão no cantilever²⁸. As curvas de força-deslocamento são coletadas a partir da aproximação e retração do balanço, que pode ser equipado com modelos mecânicos de contato apropriados para avaliar a rigidez local da amostra²⁹.

Além de medir a rigidez de uma determinada área, o AFM também pode fornecer informações topográficas sobre características específicas da amostra, como a estrutura das fibras de colágeno^30,31,32. Vários estudos descreveram a aplicação de AFM para medir a rigidez de vários tecidos saudáveis e doentes, como pele 32,33, pulmão 34,35, cérebro³⁶, mamário^37,38,39, cartilagem 40 ou coração^41,42,43,44 de amostras de modelos de pacientes e camundongos. Além disso, a AFM também tem sido utilizada in vitro para determinar a rigidez de células e andaimes proteicos extracelulares^45,46,47.

A medição das propriedades mecânicas de amostras biológicas usando AFM não é trivial devido à sua suavidade e fragilidade. Assim, vários estudos padronizaram diferentes condições e configurações, que produzem valores amplamente flutuantes dos módulos de Young (revisados por Mckee et ^al.48). Semelhante a outros tecidos moles, os valores do módulo hepático de Young em diferentes graus de fibrose hepática também apresentam extensa variação (Tabela 2). As diferenças nos valores do módulo de Young decorrem de diferenças no modo de operação do AFM, ponta do cantilever, método de preparação da amostra, espessura da amostra, profundidade e forças de recuo, ambiente do tecido hepático durante a medição e método de análise (Tabela 2).

Tabela 2: Valores de rigidez hepática a nível celular. Os valores de rigidez hepática obtidos usando AFM descrevem as propriedades mecânicas do fígado no nível celular. Abreviaturas: AFM = microscopia de força atômica; E = módulo elástico (de Young); PFA = paraformaldeído; PBS = solução salina tamponada com fosfato. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Este trabalho descreve um protocolo para a medida reprodutível dos módulos de Young de áreas fibróticas ricas em colágeno no tecido hepático por AFM com uma localização precisa fornecida pelo uso de microscopia de polarização. Administramos tetracloreto de carbono (CCl₄) para induzir a deposição de colágeno de forma centrolobular⁴⁹ em um modelo de camundongo, imitando de forma confiável aspectos cruciais da fibrose hepática humana⁵⁰. Imagens microscópicas polarizadas possibilitam a visualização do colágeno no fígado devido à birrefringência das fibras colágenas⁵¹, o que permite o posicionamento preciso da ponta do cantilever sobre a área de interesse desejada dentro do lóbulo hepático⁵².

Protocolo

Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com um protocolo animal aprovado pelo Comitê de Cuidados com Animais do Instituto de Genética Molecular e de acordo com a Diretiva da UE 2010/63/UE para experimentos com animais. Um diagrama esquemático geral do protocolo apresentado é mostrado na Figura 1.

Figura 1: Esquema geral da avaliação AFM do módulo de Young de fígados de camundongos. (A) Isolamento do fígado de camundongos controle ou tratados seguido de seccionamento e armazenamento a -80 °C (armazenamento máximo, 2 semanas). (B) Fixação do grânulo esférico ao cantilever com posterior cura de cola durante a noite (esquerda). Calibração do cantilever seguida de montagem da amostra (à direita). (C) Alinhamento do polarizador e do analisador para visualizar estruturas brilhantes de colágeno seguidas por uma sobreposição da imagem na câmera com o campo de medição sob o balançol AFM. (D) Aquisição de mapas e análises de rigidez. Abreviaturas: AFM = microscopia de força atômica; PBS = solução salina tamponada com fosfato; OCT = composto de temperatura de corte ideal; CCl₄ = tetracloreto de carbono. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Preparação da amostra I

1. Extirpar o fígado do abdômen aberto de um camundongo eutanasiado por luxação cervical sob anestesia. Isole o lobo lateral esquerdo e incorpore a metade lateral do lobo no composto de temperatura de corte ideal (OCT) por congelamento rápido em gelo seco. Conservar o tecido incorporado em OCT a -80 °C.
   NOTA: Estudos prévios mostraram que os valores de rigidez são semelhantes entre tecidos congelados e frescos^25,26.
2. Seção de 30 μm de espessura de seções hepáticas em lâminas carregadas positivamente usando um criótomo e armazenar as lâminas a -80 °C até o dia da medição da AFM não mais do que 2 semanas a partir daí.

2. Criação do instrumento

1. Fixação de um talão de 5,7 μm à ponta do cantilever AFM (Figura suplementar S1, etapas 1-5)
   NOTA: A fixação do grânulo ao cantilever também foi descrita anteriormente por Norman et ^al.46.
   1. Espalhar uniformemente a suspensão de esferas de resina de melamina de 5,7 μm de diâmetro em metade da área de uma lâmina de vidro e secar ao ar para evaporar o solvente (Figura suplementar S1, passo 1).
   2. Na outra metade da lâmina, usando uma ponta de 10 μL, faça uma linha fina de resina epóxi pré-misturada com um longo tempo de trabalho (Figura suplementar S1, etapa 1).
   3. Carregue a sonda cantilever na cabeça AFM de acordo com as instruções do fabricante.
   4. Monte o slide e cubra com a cabeça AFM equipada com a sonda cantilever.
      NOTA: Um cantilever SD-qp-BioT-TL-10 foi utilizado no estudo.
   5. Leve a cola de resina epóxi pré-misturada para o centro da lâmina e aproxime a cola com o cantilever com uma força baixa (defina um setpoint para 1 V para seguir este protocolo; Figura suplementar S1, etapa 2).
      NOTA: Antes de se aproximar da superfície deslizante, certifique-se de que o laser está alinhado no centro da ponta do cantilever, indicado por uma tensão de alta soma seguindo as etapas 6-8 na Seção 2, Parte 3, Calibração da constante de mola do balanço AFM.
   6. Depois que a ponta da sonda cantilever entrar em contato com a cola, mova-a logo acima da lâmina para remover o excesso de cola.
   7. Agora, retraia a ponta do cantilever do slide e mova-o para trazer um único talão no centro (Figura Suplementar S1, etapa 3). Aproxime-se do talão novamente com a sonda cantilever AFM com uma força maior (setpoint 2 V) para anexar o talão no centro da sonda cantilever e deixá-lo por pelo menos 10 s (Figura suplementar S1, etapa 4).
   8. Extraia a sonda cantilever e mantenha-a durante a noite à temperatura ambiente para endurecer a cola ou siga as instruções para a resina epóxi (Figura suplementar S1, passo 5).
2. Configurando o polarizador e o analisador
   1. Para localizar as áreas de interesse dentro das seções do fígado, configure o microscópio com o polarizador e o analisador. Alinhe seus azimutes de vibração em um ângulo entre 0° e 90° um ao outro, girando um deles em relação ao outro manualmente ou de forma automatizada para minimizar a luz transmitida e maximizar os raios extraordinários que passam através da objetiva. Certifique-se de que as fibras de colágeno apareçam brilhantes contra um fundo escuro na imagem polarizada (Figura 2), que é refletido por uma mudança no pico do histograma da imagem em direção a pixels brilhantes.

Figura 2: Imagens microscópicas representativas mostram visualização pronunciada de fibras colágenas em microscopia polarizada em comparação com imagens de campo brilhante. Cortes hepáticos de camundongos tratados com CCl₄ por 3 semanas foram submetidos a (A) microscopia de campo brilhante e (B) polarizada. As fibras colágenas birrefringentes são claramente visíveis em branco em imagens polarizadas em comparação com imagens de campo brilhante. A caixa vermelha representa a área rica em colágeno usada para a medição do AFM. As indefinições mostram exibições ampliadas da área na caixa vermelha. Barra de escala = 100 μm. Abreviaturas: AFM = microscopia de força atômica; CCl₄ = tetracloreto de carbono; CV = veia central; VP = veia porta. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

NOTA: Para este protocolo, a cabeça AFM pode ser instalada em qualquer microscópio invertido adequado com a possibilidade de inserir um polarizador e um analisador. O sistema deve ser colocado em uma unidade de isolamento para reduzir o ruído de fundo.

3. Calibração da constante de mola do cantilever AFM
   1. Carregue a sonda cantilever (preparada de acordo com as etapas 1-8 da Seção 2, Parte 1, Fixação de um talão de 5,7 μm na ponta do cantilever AFM) na cabeça AFM de acordo com as instruções do fabricante.
   2. Limpe o cantilever com etanol a 70% para evitar a contaminação do cantilever durante a medição. Lave extensivamente com água destilada para remover o etanol residual da ponta.
   3. Ative o modo de contato e selecione o mapeamento de força como o método de medição.
   4. Abra todas as janelas relevantes (Z Stepper Motors, Motorized Stage Control, Data Viewer, Force Scan Map Oscilloscope, Laser Alignment e Camera window) nas guias do software clicando nos botões correspondentes.
   5. Monte uma lâmina de vidro limpa contendo 1,2 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) em uma área de aproximadamente 2 cm x 4 cm delineada com uma caneta marcador hidrofóbica. Monte a cabeça AFM no estágio do microscópio e certifique-se de que o cantilever esteja totalmente imerso em PBS.
   6. Concentre o objetivo na ponta do cantilever. Reduza a intensidade da luz transmitida no microscópio para obter uma melhor visão da posição do laser no monitor.
   7. Direcione o laser para a extremidade translúcida do cantilever (sob a qual o grânulo esférico está conectado) e alinhe o espelho usando os botões na cabeça AFM para maximizar a intensidade total do feixe de laser no detector (representado pela soma na janela Alinhamento a laser ).
   8. Alinhe o detector de fotodiodos usando os botões presentes na cabeça do AFM para posicionar o laser em seu centro.
   9. Deixe o cantilever estabilizar por 15 minutos antes de prosseguir com a calibração.
   10. Abra o Gerenciador de calibração e insira o tipo de balanço, as dimensões do balanço e as condições ambientais. Calibre a constante da mola e a sensibilidade (também conhecida como sensibilidade da alavanca óptica inversa, InvOLS) clicando em Calibrar. Confirmar a exactidão da constante de mola obtida após calibração com a declaração do fabricante. Calibrar o cantilever no modo sem contato (a calibração é realizada pelo software usando o teorema térmico derivado de Sader et ^al.58).
       NOTA: A constante de mola do cantilever representa a rigidez do cantilever e é dada pela força de resistência do cantilever à medida que se deforma de acordo com o comprimento de deformação em termos de N / m. A sensibilidade do cantilever representa o valor da resposta do fotodiodo (em volts) em resposta à deflexão do cantilever (em nanômetros) e geralmente é apresentada em termos de nm/V⁵⁹. Em um modo sem contato, o espectro de ruído térmico é gravado e equipado com a função hidrodinâmica⁶⁰ pelo software de controle AFM automaticamente após a calibração. O encaixe fornece os parâmetros de calibração, nomeadamente a constante de mola e o InvOLS. A constante de mola do cantilever SD-qp-BioT-TL-10 utilizado neste estudo foi de 0,09 N/m, conforme declarado pelo fabricante.

3. Preparação da amostra II

1. Descongelar as secções congeladas (armazenadas a -80 °C, conforme descrito na secção 1, Preparação da amostra I) à temperatura ambiente durante 2 minutos.
2. Fixar as seções com paraformaldeído gelado a 4% (PFA) em 1x PBS por 10 min a 4 °C seguido de lavagem extensiva (5x) com 1x PBS. Limpe o PBS residual ao redor da seção com um tecido e marque um limite de aproximadamente 2 cm x 4 cm ao redor da seção do fígado com uma caneta marcador hidrofóbica. Cubra a amostra com 1x PBS (certifique-se de que a área demarcada contenha ~1,2 mL de 1x PBS). Use a amostra para medições de AFM.
   NOTA: Como o PFA é um produto químico perigoso, ele deve ser manuseado com cuidado para evitar o contato com a pele ou os olhos. Para evitar seus vapores tóxicos, todos os procedimentos que envolvam PFA devem ser realizados em um exaustor químico certificado ou em outra área ventilada aprovada.

4. Medição

1. Habilite o salvamento automático acessando a guia Configuração e marcando o Salvamento Automático. Especifique o nome do arquivo e o diretório para salvar os arquivos de medição acessando a guia Configuração e clicando em Salvar configurações.
2. Carregar a amostra (preparada em conformidade com a secção 3, Preparação da amostra II). Aproxime-se da superfície do tecido com o cantilever AFM ligando o laser e clicando na tecla Approach . Depois que a ponta estiver em contato com a superfície do tecido, retraia a ponta do cantilever de modo que a ponta permaneça no foco da objetiva (clicando na tecla Retraction , que retrai o cantilever para a extremidade superior da faixa piezo). Realinhe o detector se a posição do laser for afastada de seu centro na janela Alinhamento a laser.
3. Desligue o laser e sobreponha o campo óptico do microscópio com mapas de medição AFM clicando na guia Acessórios e, em seguida, selecionando Calibração óptica de sobreposição direta. Na janela seguinte, clique em Avançar para tirar uma série de imagens do cantilever digitalizando uma área específica. Clique em Avançar novamente para ir para a próxima janela.
4. Na primeira imagem, clique no centro da ponta do cantilever manualmente para representar a posição da ponta no software. O círculo que representa a posição da ponta pode ser manipulado em tamanho, indicando seu raio para aumentar a precisão. Clique em Calibrar para detectar automaticamente a posição da ponta do cantilever em todas as imagens. Confirme a precisão da detecção de pontas passando pelas imagens.
5. Clique em Avançar e em Concluir para concluir a sobreposição óptica e salvar a série de imagens capturadas durante a calibração óptica.
6. Retraia ainda mais o cantilever para evitar sua colisão com superfícies mais altas no slide. Mova o palco para posicionar uma área rica em colágeno dentro da caixa verde visível na guia Visualizador de Dados usando a imagem polarizada. Selecione a área rica em colágeno fazendo um retângulo em torno dela usando um longo toque no botão esquerdo do mouse dentro da caixa verde especificada. Defina as dimensões, a orientação e a resolução da área selecionada na guia Grade do lado esquerdo. Clique em Confirmar nova região de varredura para definir a área selecionada como área de medição.
7. Mantenha os parâmetros IGain e PGain do loop de feedback nos valores padrão, se nenhuma instabilidade importante for apresentada na forma de supersensibilidade do sistema. Para seguir esse protocolo, defina IGain em 50 Hz e PGain em 0,001.
8. Defina o Setpoint em 1 nN.
   NOTA: Setpoint é a força da interação ponta-superfície durante o estado estacionário. Para a maioria das amostras moles (células, géis e tecidos), os valores de Setpoint na faixa de 0,5-2,0 nN são apropriados.
9. Selecione o Valor do Setpoint Relativo de acordo com as propriedades mecânicas do material estudado e a rigidez do balanço. Para este protocolo, defina o valor em 5 nN.
   NOTA: O setpoint relativo representa a força máxima de interação, quando o pico da curva força-distância é atingido e o movimento da ponta retorna à linha de base. Para materiais macios (1-50 kPa), este parâmetro é definido em unidades de nanonewtons (nN). Além disso, para um cantilever macio (com uma constante de mola de 0,05 N/m a 0,35 N/m), a força máxima que pode ser aplicada é de aproximadamente 50 nN. Ajuste os valores de Setpoint e Setpoint Relativo de acordo.
   1. Certifique-se de que o valor do setpoint dado não leve a uma profundidade de recuo maior que o raio do indenter esférico, caso contrário, a superfície de recuo não pode ser adequadamente definida no cálculo do módulo de Young. Calcular o valor médio da profundidade de recuo após a primeira execução dos recuos; consulte a Seção 5, Análise de dados, para saber como processar os dados registrados. Ajuste o valor do setpoint, se necessário.
10. Defina Ajustar Linha de Base como 5.
    NOTA: Aqui, a Linha de Base refere-se ao grau de polinômio usado para ajustar as curvas de aproximação e retração. Definir a linha de base para 5 ajusta as curvas a alta resolução e, assim, garante a captura de ruído de fundo durante as medições.
11. Selecione o comprimento do movimento do cantilever no eixo Z (comprimento Z) de acordo com a topografia superficial da amostra. Para seguir esse protocolo, defina o comprimento Z em 15 μm.
    NOTA: Um valor elevado (por exemplo, 15 μm) reduz a sensibilidade à medição, mas é geralmente necessário para amostras com uma superfície altamente irregular, como o tecido hepático fibrótico.
12. Defina o movimento Z como Duração Constante.
    NOTA: O movimento Z também pode ser definido como Velocidade constante para visualizar dados referentes ao movimento Z (Estender Velocidade e Estender Tempo) em um modo diferente.
13. Defina o Estender Tempo como 1 s. Defina Atraso de Extensão e Atraso de Retração como 0.
    NOTA: Use velocidades de extensão de >5,0 μm/s para materiais muito macios⁶¹, pois velocidades de recuo mais baixas resultarão em uma resposta mais viscosa e menos elástica de superfícies macias. Atraso de Extensão e Atraso de Retração são parâmetros que podem ser usados para estudar a interação específica entre a ponta do cantilever e o substrato (por exemplo, interações de uma proteína imobilizada na superfície do cantilever com proteínas imobilizadas na superfície deslizante).
14. Defina a taxa de amostragem como 5000 Hz.
    NOTA: A Taxa de Amostragem refere-se à frequência de pontos que são registrados em uma curva de aproximação e retração completa. Defina isso para um valor alto (por exemplo, 5000 Hz) para evitar a perda de certas regiões das curvas devido à sua transição extremamente rápida.
15. Marque o Z Closed Loop com um Tick para habilitar um sistema de loop de feedback, que garante a distância contante entre a superfície da amostra e a ponta do cantilever.
16. Desligue o estágio motorizado desmarcando Engage e Click on Approach para abordar a amostra com o balanço. Clique em Iniciar varredura para começar a coletar curvas de força-distância na área definida na etapa 6; Seção 4, Medição.

5. Análise dos dados

1. Analise os dados adquiridos usando o software de código aberto "AtomicJ" (que pode ser baixado de https://sourceforge.net/projects/jrobust/).
   NOTA: Ele suporta arquivos coletados da Agilent Technologies, JPK Instruments ou microscópios de força atômica Bruker.
2. Carregue as curvas de força no programa clicando no ícone de curvas de força de processo e mapas no AtomicJ (Figura Suplementar S2A, x). No assistente de processamento, adicione os mapas a serem analisados clicando no botão Adicionar (Figura suplementar S2A, y). Clique em Avançar depois que os mapas forem carregados (Figura suplementar S2A, z).
3. Especifique as configurações de processamento na próxima janela de acordo com as etapas descritas abaixo (correspondentes às etapas na Figura Suplementar S2B, etapas 1-11):
   1. Estimar o ponto de contato entre a amostra e o cantilever manualmente por cálculo ou automaticamente usando um conjunto de parâmetros de curva de ajuste. Para seguir este protocolo, utilize a estimativa automática do ponto de contacto.
   2. Determine o ponto de contato entre o cantilever e a amostra pelo método clássico de grade focada.
   3. Selecione o método de estimativa para obter a melhor determinação do ponto de contato com base na qualidade das curvas de força medidas, que precisa ser determinada empiricamente durante a otimização da análise dos dados. Para seguir esse protocolo, use o método independente de modelo.
   4. Ajuste a curva de recuo de força usando um modelo clássico (use L2 clássico para ajustar o modelo para seguir este protocolo).
      NOTA: O ajuste do modelo e o estimador de contato são parâmetros que governam como as curvas são ajustadas pelo software e como o ponto de contato é estabelecido na curva ajustada, respectivamente. Para essas medidas, foi utilizada a opção clássica, que utiliza regressão de mínimos quadrados. Isso processa cada ponto de baixa força na curva como um ponto de contato de teste e ajusta um polinômio à região antes do ponto de contato de teste. Em seguida, ele ajusta o modelo de contato apropriado aos dados de recuo de força coletados. O ponto que dá a menor soma de quadrados é assumido como o ponto de contato. Outros métodos podem ser utilizados com base na qualidade das curvas de força obtidas^62,63.
   5. Defina o ajuste do modelo para a curva Retirar .
   6. Defina a proporção de Poisson como 0,45, conforme recomendado para tecidos moles, como o fígado²⁴.
   7. Defina o ajuste da curva usando um grau de linha de base de 3 e um grau de contato de 1. Alterar o grau de ajuste polinomial com base na escala de desvios das curvas do modelo.
   8. Selecione o modelo usado para ajustar as curvas de retirada. Use o modelo de Sneddon , que calcula o módulo de Young com base na equação (1) e na equação (2):
      (1)
      δ = (2)
      onde F é a força, E é o módulo de Young, v é a razão de Poisson da amostra, δ é a profundidade de recuo, a é o raio de contato e R é o raio da esfera^62,63.
   9. Preencha o raio da ponta esférica em micrômetros (2,9 μm neste protocolo).
   10. Carregue a constante Spring e InvOLS dos arquivos de dados habilitando a leitura (marque as caixas).
   11. Clique em Concluir.
       NOTA: Os dados analisados são apresentados na forma de mapas de deflexão vertical, altura, adesão, força de contato, deformação, força de adesão, valores de R² , inclinação, módulo de Young, recuo de transição, força de transição e posição de contato calculados para cada curva de força (Figura Suplementar S3, canto superior esquerdo). Duas janelas adicionais exibem curvas de força e valores brutos (Figura Suplementar S3, painéis superior direito e inferior, respectivamente).
4. Exclua curvas de força em que o cantilever se aproximou incorretamente da superfície da seção do fígado. Para identificá-las, procure curvas com alto ruído, formas aberrantes e/ou abordagem incompleta, conforme demonstrado na Figura 3 e discutido em detalhes em outro lugar⁴⁶.

Figura 3: Exemplos de curvas representativas de deslocamento de força. (A,B) Curvas de força interpretáveis representativas para mais rígidas (A; E = 10,5 kPa) e mais suave (B; E = 1,78 kPa) áreas adequadas para análise. (C-F) Gráficos representativos ininterpretáveis que precisam ser excluídos da análise devido à abordagem incorreta (C-E) ou (F) ruído mais alto. Como indicado na legenda fornecida em (A), as curvas vermelhas mostram a aproximação do balanço, e as curvas verdes mostram a retração do balanço. Linhas pretas mostram o ajuste da curva de retirada do balanço. A inclinação das linhas pretas corresponde ao módulo de Young. Os pontos vermelho e azul correspondem ao ponto de contacto e ao ponto de transição, respetivamente. O ponto de contato é o último ponto de contato entre o cantilever e o substrato durante a retração, enquanto o ponto de transição descreve a transição do cantilever da aproximação para a retração. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

Cortes hepáticos levemente fixos de 30 μm de espessura obtidos de camundongos controle e de camundongos com fibrose leve ou avançada (induzida pela injeção de CCl₄ por 3 semanas ou 6 semanas, respectivamente⁴⁹) foram sondados com AFM, conforme descrito neste protocolo. Fibras colágenas próximas às veias centrais foram selecionadas para a mensuração dos mapas de rigidez. Áreas próximas às veias centrais, que correspondem às áreas onde geralmente se formam fibras colágenas em animais tratados com CCl₄, foram analisadas em fígados controle (Figura 4A). A distribuição dos módulos de Young foi reprodutível em diferentes fígados controle e áreas ricas em colágeno dentro de uma única seção hepática (Figura 4B: gráfico de violino esquerdo).

Em animais tratados com CCl 4, os mapas de rigidez correspondentes às áreas pericentrais dos depósitos de colágeno mostraram valores significativamente mais altos dos módulos de Young em comparação com áreas equivalentes em camundongos controle (Figura 4B: 1,9 kPa vs. 2,6 kPa mediana dos valores do módulo de Young para controle vs. 3 semanas de camundongo tratado com CCl 4; p = 0,07; 1,9 kPa vs. 5,1 kPa mediana dos valores do módulo Young para controle vs. 6 semanas CCl₄ -rato tratado; p = 0,02). Além disso, houve um aumento significativo nos valores dos módulos de Young com o tratamento CCl 4 mais longo (Figura 4B; 2,6 kPa vs. 5,1 kPa mediana dos valores do módulo de Young para camundongo tratado com CCl₄ semanas vs. 3 semanas vs.₆ semanas; p = 0,04). Isso mostra um enrijecimento gradual dos depósitos de colágeno com progressão da fibrose e que as medições de AFM refletem a fibrogênese.

Para avaliar o efeito do armazenamento prolongado de cortes hepáticos embebidos em OCT sobre as propriedades mecânicas das fibras colágenas, medimos a rigidez das fibras colágenas em cortes de camundongos tratados com CCl₄, que foram armazenados a -80 °C por 2 semanas ou 3 meses na lâmina após o corte (Figura 5). As medidas de AFM mostraram valores significativamente mais baixos de módulos de Young em áreas ricas em colágeno para seções armazenadas por 3 meses em comparação com aquelas obtidas de seções medidas dentro de 2 semanas após o corte da amostra (Figura 5; 4,7 kPa vs. 3,6 kPa mediana dos valores do módulo de Young por 2 semanas vs. 3 meses de armazenamento; p < 0,001). Assim, é importante medir as propriedades mecânicas do tecido hepático logo após as seções serem preparadas a partir dos lobos hepáticos incorporados à OCT.

Figura 4: As medidas de AFM revelam enrijecimento progressivo de áreas ricas em colágeno, correlacionando-se com o tratamento prolongado com CCl₄. (A) Seções hepáticas de camundongos controle e camundongos tratados com CCl₄ por 3 semanas ou 6 semanas foram usadas para medir as propriedades mecânicas de áreas ricas em colágeno. As áreas encaixotadas das seções hepáticas mostradas nas imagens de microscopia polarizada (à esquerda) são áreas de varredura ricas em colágeno (ou regiões correspondentes no fígado controle) selecionadas para medições de AFM (30 μm x 100 μm, 10 pixels x 36 pixels). Os mapas de módulo de Young com escalas de cores correspondentes a essas áreas encaixotadas são mostrados à direita, incluindo histogramas dos valores de módulo de Young a partir desses mapas; gráficos de dispersão embutidos mostram valores >10 kPa para cada condição. O enrijecimento do fígado é visualizado como um deslocamento gradual para a direita na distribuição do histograma e uma maior frequência de pontos no gráfico de dispersão inserido. Barra de escala = 20 μm. (B) Os gráficos de violino mostram a distribuição dos módulos elásticos a partir de três áreas medidas para cada condição (esquerda) e valores resumidos de módulos elásticos de todos os três mapas (direita). Os gráficos para violino mostram a mediana (linha vermelha),^percentil 25 e percentil 75 (linhas pretas); os pontos representam os valores médios de mapas individuais das áreas 1-3. Os valores de p apresentados foram calculados por meio do teste t de Student realizado em médias. Abreviaturas: AFM = microscopia de força atômica; CCl₄ = tetracloreto de carbono. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: O armazenamento prolongado de seções hepáticas leva a uma diminuição na rigidez das áreas ricas em colágeno. Seções hepáticas (preparadas a partir de camundongos tratados com CCl₄ por 2 semanas) armazenadas a -80 °C por 2 semanas ou 3 meses foram usadas para medir o módulo de Young. Imagens de microscopia polarizada (à esquerda) com caixas indicando as áreas ricas em colágeno usadas para medição de AFM (30 μm x 100 μm, 10 pixels x 36 pixels). O módulo de Young correspondente mapeia com escalas de cores (à direita). Os histogramas mostram os valores do módulo de Young coletados de 4-6 áreas em cada amostra; gráficos de dispersão embutidos mostram valores >10 kPa para cada condição. Barra de escala = 20 μm. Abreviaturas: AFM = microscopia de força atômica; CCl₄ = tetracloreto de carbono. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar S1: Método para modificar o cantilever com um microcordão de resina de melamina. (A) O esquema desenhado ilustra a fixação de um grânulo esférico à ponta do balanço. Para uma descrição gradual, consulte a Seção 2, Parte 1, Anexação de um talão de 5,7 μm à ponta do cantilever AFM. (B) Imagem microscópica de um grânulo esférico de 5,7 μm ligado à ponta do cantilever mostrada de cima (esquerda) e vista lateral (direita). Barras de escala = 20 μm. Abreviaturas: AFM = microscopia de força atômica; RT = temperatura ambiente. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar S2: Análise dos dados em AtomicJ. (A) A sequência de passos a serem seguidos para a abertura de mapas de rigidez em AtomicJ. Um único clique com o botão esquerdo do mouse nas curvas de força do processo e nos mapas (x) abre o assistente de processamento. Os arquivos podem ser carregados no assistente de processamento clicando em adicionar (y) e selecionando os arquivos necessários. Clique em Avançar (z) para prosseguir para a próxima etapa. (B) Parâmetros para ajuste da curva, modelo de mecânica de contato apropriado e configurações de AFM usadas durante a medição. As etapas 1 a 11 referem-se aos subpontos correspondentes detalhados na etapa 3 do protocolo, Seção 5, Análise de dados. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar S3: Esboço dos dados analisados em AtomicJ. A visualização dos dados analisados mostra mapas de rigidez (janela superior esquerda), curvas de força (janela superior direita) e dados brutos (janela inferior). Abreviação: AFM = microscopia de força atômica. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

O protocolo apresentado fornece um método reprodutível passo-a-passo para a medição da AFM do tecido hepático normal e fibrótico do rato. A microscopia de polarização acoplada fornece alta precisão espacial e permite a visualização de fibras de colágeno devido à sua birrefringência. Além disso, uma descrição detalhada da análise das curvas de força obtidas é fornecida. A medição da rigidez da AFM pode ser realizada no nível celular, o que permite que as alterações locais nas propriedades mecânicas do tecido hepático devido ao desenvolvimento de doença fibrótica sejam monitoradas. A fibrose hepática não é um processo homogêneo que afeta todo o órgão. Pelo contrário, áreas de septos fibróticos ricos em colágeno são intercaladas com áreas de baixos ou nenhum depósito de colágeno. Assim, as alterações de rigidez são específicas do microambiente local e afetam apenas as células localmente em contato com áreas danificadas por lesões. Essa microescala de heterogeneidade de rigidez também é aparente nos detalhes dos mapas de módulos do AFM Young, onde pontos de alta rigidez margeiam as áreas de rigidez quase normal. Essa variação mostra que mesmo a área do tecido cicatricial do colágeno não é mecanicamente homogênea e requer que a medida da AFM seja caracterizada em nível celular (Figura 4).

O protocolo apresentado permite a mensuração da rigidez hepática por AFM independentemente da coleção hepática, pois todos os lobos hepáticos embutidos na OCT podem ser armazenados por um período prolongado a -80 °C. No entanto, uma vez que o tecido é seccionado, recomendamos medir as amostras dentro de ~ 2 semanas, pois observamos um amolecimento gradual das seções de tecido armazenadas por longos períodos de tempo (Figura 5).

O AFM equipado com microscopia de polarização permite localizar com precisão a área de interesse dentro da estrutura do lóbulo hepático. No entanto, também possui algumas limitações que precisam ser consideradas na interpretação dos resultados. Os valores de rigidez aqui obtidos foram medidos à temperatura ambiente. Assumimos que os efeitos da temperatura sobre as propriedades mecânicas dos tecidos moles serão pequenos; no entanto, esta pode ser uma das razões para diferenças entre os valores relatados in vivo de propriedades mecânicas dos tecidos hepáticos e os valores deste estudo.

Além disso, este protocolo permite a análise AFM do tecido hepático por até 3 h, o que requer uma fixação leve do tecido. A fixação leve das seções teciduais, bem como o ciclo de congelamento-descongelamento, provavelmente afetarão os valores absolutos do módulo de Young. Assim, os valores relatados dos módulos de Young podem diferir dos valores in vivo. Mais estudos são necessários para otimizar o protocolo de mensuração dos valores absolutos do módulo de Young a partir de cortes hepáticos, o que pode ser alcançado por um método diferente para fixação do tecido hepático⁶⁴.

No entanto, observamos um aumento da rigidez de áreas ricas em colágeno nos fígados de camundongos tratados com CCl₄ por 3 semanas em comparação com 6 semanas. Tais alterações correspondem à progressão da fibrose durante a lesão prolongada (Figura 4) e mostram que diferenças relativas podem ser investigadas entre os diferentes tratamentos utilizando o protocolo apresentado. Isso está de acordo com as observações de Calò et al., que mostraram que cortes hepáticos levemente fixos mostram diferenças semelhantes nos valores de rigidez entre áreas ricas em colágeno e sem colágeno como no tecido fresco²⁵.

Utilizamos o cantilever SD-qp-BioT-TL-10 (constante teórica de mola ~0,09 N/m) modificado com uma ponta esférica de 5,7 μm de diâmetro para minimizar a ruptura mecânica do tecido hepático durante as medições. Um talão de 5,7 μm permitiu o recuo suficiente da amostra para sondar sua rigidez, preservando sua integridade. Um grânulo com um diâmetro menor pode ser usado, após várias otimizações, para obter maior resolução nos mapas de rigidez, mas pode levar a uma maior superestimação dos valores do módulo de Young (para mais detalhes, ver Crichton et ^al.65). Usando o conjunto de contas de balanço especificado, fomos capazes de caracterizar a rigidez da amostra em uma ampla faixa, de dezenas de unidades de Pa a ~100 kPa.

O modelo de Sneddon foi utilizado para derivar o módulo de Young a partir de curvas de força, pois permite a análise de reentrâncias profundas com sondas coloidais⁶². O modelo de Sneddon, ao contrário do modelo de Hertz, não sofre da restrição de que o raio de contato deve ser muito menor do que o raio da esfera. Assume, ainda, que a espessura da amostra é várias vezes maior que a profundidade de recuo ^30,66. No presente estudo, o recuo foi de ~2 μm com um tamanho de grânulo de 5,7 μm e uma espessura de amostra de 30 μm em áreas ricas em colágeno; assim, o modelo de Sneddon era apropriado. Outros modelos⁶³ considerando a força de adesão entre ponta e substrato podem ser utilizados para diferentes tipos de tecidos.

A análise em AtomicJ implementa correções para a espessura finita das amostras para minimizar a contribuição de um substrato enquanto se deriva o módulo de Young^62,67. Na análise das curvas de força obtidas, utilizou-se uma única razão de Poisson de 0,45, que já foi previamente recomendada para órgãos de partes moles²⁴. Esta aproximação não tem um efeito significativo sobre os valores calculados do módulo de Young, uma vez que a mudança no valor da razão de Poisson de 0,4 para 0,5 resulta apenas em uma diminuição de 0,893x nos valores do módulo de Young calculados de acordo com a equação de Sneddon. Dadas as diferenças múltiplas no módulo de Young entre as diferentes durações dos tratamentos com CCl₄, os erros produzidos pela aproximação da razão de Poisson são apenas marginais.

Utilizamos curvas de retirada para calcular os valores de rigidez, pois estávamos interessados na resposta elástica do tecido à carga fornecida pelo cantilever e não na resposta plástica ao recuo⁶⁸. Devido à resposta viscoelástica do tecido mole, as curvas de retirada de ajuste podem superestimar o módulo de Young, o que deve ser mantido em mente. Além disso, observamos que a análise de dados com curvas de aproximação produz tendências semelhantes nos valores de rigidez entre as áreas fibrótica e de controle, embora os valores absolutos sejam correspondentemente menores (dados não mostrados).

Ao otimizar o protocolo, identificamos várias etapas críticas para a reprodutibilidade das medições. Primeiro, é importante garantir que o talão esteja aproximadamente no centro da ponta translúcida enquanto se conecta ao balanço. Isso evita possíveis desequilíbrios mecânicos durante o recuo. Em segundo lugar, durante a fixação hepática com PFA, é necessário seguir rigorosamente os limites de tempo para descongelamento e fixação. Alterar o tempo desta etapa pode afetar severamente as propriedades mecânicas das seções de tecido. Em terceiro lugar, o cantilever deve ser repetidamente calibrado com monitoramento contínuo e entrada de valores de temperatura simultânea para evitar que quaisquer artefatos ocorram em valores de rigidez devido a flutuações de temperatura. Por último, uma única secção de fígado não deve ser medida por mais de 3 h a partir da preparação, uma vez que a PBS sobreposta pode evaporar durante períodos mais longos. Os leitores podem consultar a tabela de solução de problemas (Tabela 3) para resolver problemas encontrados durante a medição do AFM, também discutida em extensão em Norman et ^al.46.

Tabela 3: Guia de solução de problemas. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

O protocolo apresentado permite a sondagem reprodutível de AFM do tecido hepático. Tem o potencial de revelar informações sobre o desenvolvimento e eventual regressão da doença hepática fibrótica em nível microscópico e pode contribuir para o desenvolvimento de terapias direcionadas a regiões de cicatrizes fibróticas formadas durante a progressão da doença hepática crônica.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
AFM head	Bruker	JPK nanowizard 3
Cameras	Andor	Zyla 5.5 USB (sCMOS, water cooled)
	The Imagingsource	S/N:12310015
Cantilever	SD-qp-BioT-TL-10, Nanosensors	S/N:73750F05
Cryotome	Leica	CM1950
Epoxy resin glue (Long working time )	Bison epoxy universal
Melamine beads; diameter, 5.7 um	Microparticles, GmbH	MF-R-5.7
Microscope	Olympus	IX81
Hydrophobic  slide marker	SuperHT	PAP PEN
Software	JPK nanowizard  v6.1.151
	AtomicJ v2.3.1
Superfrost slides	Thermoscientific	ref no. J1800AMNZ
System	Ubuntu 14.04.5 LTS
Vibration isolation control unit	Tablestable	AVI-200-S