Auto-nanoemulsificação de óleos saudáveis para aumentar a solubilidade de drogas lipofílicas

Resumo

Os óleos usados para aplicações de administração de medicamentos podem perturbar o perfil lipídico dos pacientes, o que é indesejável em doenças cardiovasculares. Os óleos ricos em ácidos graxos ômega-3 são uma alternativa saudável aos óleos convencionais e têm um enorme potencial para sistemas de administração de medicamentos autoemulsionados.

Resumo

A baixa solubilidade aquosa de muitos medicamentos reduz sua biodisponibilidade no sangue. Os óleos têm sido usados há séculos para aumentar a solubilidade dos medicamentos; no entanto, podem perturbar o perfil lipídico dos pacientes. Neste estudo, sistemas de liberação de medicamentos auto-nanoemulsificantes de óleos ricos em ácidos graxos ômega-3 são preparados e otimizados para a entrega de medicamentos lipofílicos. A rosuvastatina, uma potente droga hipolipidêmica, foi usada como droga lipofílica modelo. O óleo de peixe apresentou uma solubilidade mais de 7 vezes maior da rosuvastatina do que outros óleos e, portanto, foi selecionado para o desenvolvimento de sistemas de liberação de medicamentos auto-nanoemulsificantes (SNEDDS). Diferentes combinações de surfactantes e co-surfactantes foram selecionadas e uma mistura de surfactante de Tween 80 (surfactante) e Capryol PGMC (cosurfactante) foi selecionada para compatibilidade com óleo de peixe e rosuvastatina. Um diagrama de fase pseudoternário de óleo, surfactante e co-surfactante foi projetado para identificar a região da emulsão. O diagrama de fase pseudoternária previu uma mistura de óleo e surfactante de 1:3 como a proporção mais estável para o sistema de emulsão. Em seguida, uma metodologia de superfície de resposta (design Box-Behnken) foi aplicada para calcular a composição ótima. Após 17 ensaios, óleo de peixe, Tween 80 e Capryol PGMC nas proporções de 0,399, 0,67 e 0,17, respectivamente, foram selecionados como formulação otimizada. Os sistemas de liberação de fármacos auto-nanoemulsificantes mostraram excelente potencial de emulsificação, robustez, estabilidade e características de liberação de fármacos. Nos estudos de liberação do medicamento, o SNEDDS liberou 100% da carga útil em cerca de 6 h, enquanto a liberação do medicamento simples foi inferior a 70%, mesmo após 12 h. Portanto, os lipídios saudáveis ricos em ácidos graxos ômega-3 têm um enorme potencial para aumentar a solubilidade de drogas lipofílicas, enquanto a autoemulsificação pode ser usada como uma abordagem simples e viável para explorar esse potencial.

Introdução

Os lipídios têm sido usados há séculos para aumentar a absorção gastrointestinal de componentes insolúveis em água de alimentos e medicamentos¹. As emulsões são as formulações mais utilizadas para uso oral, intravenoso (suplementação nutricional) e tópico². Uma variedade de lipídios (gorduras e óleos) é usada na fabricação de emulsões farmacêuticas e sistemas de administração de medicamentos auto-nanoemulsificantes à base de lipídios (SNEDDS). As técnicas de autoemulsificação são amplamente adotadas nas ciências farmacêuticas para a administração transmucosa de medicamentos. Ao contrário das emulsões, os SNEDDS consistem em uma mistura de óleo e surfactante que se autoemulsifica em meio aquoso do estômago para formar gotículas de emulsão³. Eles podem carregar drogas lipofílicas na fase oleosa e evitar que se degradem no ambiente estomacal⁴. O SNEDDS demonstrou aumentar efetivamente a fração biodisponível de drogas lipofílicas (quatro a seis vezes), aumentando a solubilidade e a permeabilidade ^5,6. A ausência de uma fase aquosa no SNEDDS oferece vantagens significativas em termos de facilidade de fabricação e estabilidade em comparação com emulsões que são dispersões metaestáveis propensas à degradação química⁷. Muitas combinações de excipientes lipídicos estão disponíveis comercialmente devido às suas características desejáveis ^8,9.

Os distúrbios cardiovasculares são uma das principais causas de mortalidade em todo o mundo¹⁰ e a hiperlipidemia faz com que os vasos sanguíneos obstruam o fluxo sanguíneo devido ao espessamento dos vasos sanguíneos¹¹. O aumento da ingestão de lipídios na dieta e um estilo de vida sedentário são os principais fatores de risco para o desenvolvimento de hiperlipidemia. Além disso, os lipídios também demonstraram danificar diretamente o miocárdio do coração, levando à insuficiência cardíaca não isquêmica¹². A rosuvastatina é uma potente droga hipolipidêmica que pertence à classe das estatinas e inibe a síntese de colesterol, levando à redução dos níveis lipídicos para o tratamento da hiperlipidemia/dislipidemia¹³. A rosuvastatina é um sistema de classificação biofarmacêutica (BCS) classe II com baixa solubilidade aquosa (0,01796 mg/mL)¹⁴. Avanços recentes na pesquisa farmacêutica reconheceram que os lipídios usados na administração de medicamentos podem perturbar o perfil lipídico dos pacientes. O papel das emulsões no aumento das lipoproteínas de baixa e alta densidade e do colesterol livre foi demonstrado no final do século XX¹⁵. Além disso, os sistemas de administração de medicamentos à base de lipídios demonstraram aumentar os triglicerídeos¹⁶ e outros metabólitos lipídicos no sangue¹⁷. Portanto, há uma extrema necessidade de desenvolver formulações farmacêuticas de óleos que sejam incapazes de perturbar o perfil lipídico de pacientes cardiovasculares e hiperlipidêmicos.

O óleo de peixe é uma fonte rica em ácidos graxos ômega-3, como o ácido eicosapentaenóico e o ácido docosahexaenóico. O óleo de peixe mostrou muitos efeitos na saúde com evidências substanciais de seu papel benéfico nos sistemas cardiovascular e nervoso¹⁸. O objetivo do estudo foi utilizar o óleo de peixe como alternativa aos óleos convencionais para formular SNEDDS para a administração de um medicamento lipofílico, a rosuvastatina. Nenhum estudo anterior empregou óleo de peixe como transportador para formular sistemas de administração de medicamentos. Parâmetros apropriados de formulação e processamento foram selecionados e a otimização foi realizada usando software especialista em design.

Protocolo

1. Triagem dos óleos, surfactantes e cosurfactantes

1. Triagem dos óleos, surfactantes e co-surfactantes quanto à solubilidade do medicamento
   1. Misture 100 mg de rosuvastatina separadamente em 1 mL de diferentes óleos ricos em ácidos graxos ômega-3 (óleo de peixe, azeite, óleo de gergelim e óleo de linhaça) e 1 mL de surfactantes e cosurfactantes (Tween 80, Capryol PGMC, PEG 400 e etanol) por vórtice por 5 min a uma velocidade fixa de 2.500 rpm. Em seguida, colocar em banho-maria agitada durante 48 h a 50 °C.
   2. Após agitar, deixe a mistura repousar por pelo menos 6 h em temperatura ambiente para que o medicamento não dissolvido seja precipitado. Tome 0,1 mL de sobrenadante usando uma micropipeta e dilua até 1 mL com metanol.
   3. Analisar com um espectrofotómetro UV-visível a 242 nm e calcular a concentração adicionando a absorção à equação linear da curva de calibração^19,20.
      NOTA: Estabeleça a curva de calibração preparando uma solução estoque de 100 μg / mL e fazendo diluições seriadas de até 0,5 μg / mL. A absorbância é tomada para todas as diluições e um gráfico é traçado entre absorbância e concentração em uma planilha. A equação linear (y = mx + b) do gráfico é reorganizada de modo que o valor da absorbância (y) possa ser usado para calcular a concentração desconhecida (x) ^{19 , 20} .
2. Triagem do surfactante e co-surfactantes para miscibilidade com óleo
   1. Misture o surfactante e o co-surfactante (Smix) na proporção de 3:1. Adicione Smix e óleo em diferentes proporções; misture e aqueça até 50 °C para garantir a homogeneização.
   2. Pegue 0,1 mL de cada mistura e dilua com 25 mL de água destilada em um tubo de ensaio de vidro.
   3. Inverta o tubo de ensaio; O número de inversões nas quais uma emulsão é formada representa a eficácia da emulsificação e a facilidade da emulsificação. Medir a transparência (T%) medindo a emulsão a 650 nm com um espectrofotómetro UV-visível utilizando água destilada como branco²¹.

2. Construção do diagrama de fases pseudo-ternário

1. Misture os surfactantes e os co-surfactantes em várias proporções de volume (1:0, 1:1, 1:2, 1:3,1:4 e 1:5) para formar misturas de surfactantes (Smix). Adicione óleo ao Smix em frascos separados em várias proporções de volume de 1: 1,1: 2,1: 3,1: 4,1: 5,1: 6,1: 7, 1: 8, 1: 9, 2: 8, 3: 7, 4: 6, 5: 5, 6: 4, 7: 3, 8: 2 e 9: 1 e misture por vórtice.
2. Adicione óleo e misturas de Smix em um frasco de vidro de 10 mL e aqueça até 50 °C com agitação constante a 300 rpm para uma mistura ideal.
3. Arrefecer a mistura a 37 °C e transferir 1 ml para um copo de água de 250 ml e adicionar gota a gota a água destilada pré-aquecida (37 °C) sob agitação suave a 50 rpm. Examine a dispersão visualmente e a mistura que forma uma nanoemulsão transparente azulada é considerada como SNEDDS²¹.
4. Construa o gráfico pseudoternário em diferentes proporções Smix (Tabela Suplementar 1) por meio de software (por exemplo, Triplot).

3. Otimização via software usando uma metodologia de superfície de resposta (RSM)

1. Selecione três variáveis independentes como óleo (A), surfactante (B) e co-surfactante, e execute o software para otimização e triagem. Em seguida, selecione o design flexível escolhendo 'NÃO' para uma seleção difícil de alterar.
   1. Observe o efeito desses fatores criticamente em variáveis dependentes, como tamanho de partícula (Y1, nm), potencial zeta (Y2, mV), tempo de emulsificação (Y3, s), bem como eficiência de aprisionamento (Y4, %) conforme mencionado na Tabela 2.
      NOTA: As execuções foram aumentadas até que os sinais de alerta desaparecessem e o próprio software selecionasse o design Box-Benhken para otimização.
2. Selecione os valores mais altos e mais baixos como -1 identificando o valor mais baixo da variável, enquanto +1 representa o valor mais alto. O valor médio representava o valor médio. O projeto Box-Benhken sugeriu um total de 17 corridas com cinco pontos centrais como medida para reduzir o erro.
3. Registre as respostas a ensaios individuais e ajuste aos modelos lineares, 2F1 e quadráticos para garantir o modelo mais adequado. Gere equações polinomiais e utilize para fazer a inferência com base na magnitude dos sinais numéricos correspondentes do coeficiente.
4. Exiba dados de regressão polinomial como gráficos 3D. Avalie o modelo de dados mais bem ajustado comparando o valor ajustado de R² e o valor previsto de R^{2 22}.
   NOTA: Os critérios de seleção exigidos da formulação foram baseados em eficiência máxima de aprisionamento, menor tamanho de partícula, maior potencial zeta e período mínimo de emulsificação.
   Y = β₀ + β₁A + β₂B + β₃C + β₁₂AB + β₁₃AC + β₂₃BC + β₁₁A₂ + β₂₂B₂ + β₃₃C₂ Eq. (1)
   Aqui, β₀ apareceu como interceptação, Y como resposta, ad β₁, β₂ e β₃ como coeficientes lineares. Β₁₁, β₂₂ e β₃₃ como termos quadráticos e coeficientes quadrados, enquanto β₁₂, β₁₃ e β₂₃ como coeficientes de interação. A, B e C foram empregadas como variáveis independentes que foram selecionadas a partir dos resultados do estudo preliminar.

4. Caracterização

1. Estudos de estabilidade termodinâmica
   1. Armazene o SNEDDS diluído a 4 ° C em uma geladeira e transfira-o para uma incubadora a 50 ° C. Realize seis desses ciclos, sendo cada ciclo igual ou superior a 48 h.
   2. Examinar a formulação da separação de fases²³.
2. Teste de centrifugação
   1. Centrifugue o SNEDDS diluído por 30 min a 3.500 rpm a -4 °C.
   2. Examine o SNEDDS à temperatura ambiente para separação de fases ou sedimentação do medicamento²⁴.
3. Teste de dispersibilidade para eficácia de autoemulsificação
   1. Adicionar 1 ml da formulação gota a gota a 500 ml de água bidestilada mantida a 37 °C e 50 rpm. Observe o tempo em que uma emulsão homogênea clara é formada por inspeção visual.
   2. Realize uma avaliação visual de acordo com o seguinte sistema de classificação²⁵.
      Grau 1: uma emulsão azulada clara com tempo de emulsificação <1 min
      Grau 2: uma emulsão branco-azulada com tempo de emulsificação <1 min
      Grau 3: aparência leitosa com tempo de emulsificação <2 min
      Grau 4: óleo de aparência cinza e branca no topo com tempo de emulsificação >2 min
      Grau 5: falha de emulsificação com gota de óleo maior no topo.
      NOTA: O tempo necessário para a emulsificação ou taxa de emulsificação é vital para a eficácia da emulsificação. O teste é realizado em um aparelho de dissolução USP tipo II.
4. Robustez a diluições
   1. Dilua a formulação SNEDDS otimizada 50, 100 e 1.000 vezes com diferentes transportadores, como água destilada, HCl 0,1 N (pH 1,0) para imitar o pH gástrico e tampão fosfato (pH 6,8) para imitar o pH intestinal.
   2. Misture bem as misturas diluídas e reserve por 12 h.
   3. Examine visualmente as formulações para precipitação de medicamentos, separação de fases e qualquer outro problema de estabilidade ^26,27.

5. Estudos de dissolução in vitro

1. Realize a liberação do medicamento do SNEDDS e da suspensão pura do medicamento usando um banho de agitação com água mantido a 37 ° C e 50 rpm.
2. Mergulhe as membranas de diálise na respectiva solução de meio por 24 horas antes do ensaio de dissolução do medicamento para obter boa integridade e ativação. Encha a suspensão do medicamento (em água) e SNEDDS equivalente a 10 mg de rosuvastatina na membrana de diálise; amarre e coloque em copos separados (50 mL).
3. Colher 1 ml da amostra a intervalos específicos e encher o copo com meios frescos (1 ml) após cada amostra.
4. Filtrar as amostras colhidas e analisar utilizando um espectrofotómetro UV-visível a 242 nm 21,28,29,30.

Resultados

Aqui, a nanoformulação de óleo de peixe rico em ácidos graxos ômega-3 é preparada e otimizada por autoemulsificação com diferentes surfactantes e co-surfactantes. A Figura 1 mostra a solubilidade da rosuvastatina em diferentes óleos, surfactantes e co-surfactantes. Com base na solubilidade, o óleo de peixe foi selecionado como óleo, Tween 80 como surfactante e Capryol PGMC como co-surfactante nos estudos a seguir. A Tabela 1 mostra a triagem de Smix em diferentes ...

Discussão

Este estudo foi projetado para explorar o potencial do óleo rico em ácidos graxos ômega-3, como óleo de peixe, óleo de gergelim, azeite de oliva e óleo de linhaça para atuar como transportadores de medicamentos. A auto-nanoemulsificação foi selecionada como uma técnica preferida para fabricar o sistema de entrega que carece de água, tornando-o mais estável do que os sistemas de emulsão clássicos³². Os óleos ricos em ácidos graxos ômega-3 são conhecidos por seus efeitos benéficos...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ammonium acetate	Sigma-Aldrich, Germany	A1542	Analytical grade
Capryol PGMC	Gattefossé, France	RT9P9S09QI	Analytical grade
Design Expert Software	StatEase, United States	Version 12.0.3.0	Analytical software (freely available for subscription)
Dialysis tubing (12,000 Daltons MWCO)	Visking, UK	12000.02.30	Pure regenerated natural cellulose membranes with 12,000 Daltons MWCO
Dissolution apparatus	Memmert, Germany	SV 1422	USP type II dissolution apparatus
Ethanol	Honeywell, Germany	24194	Analytical grade
Fish oil	Wilshire Labs Pvt(Ltd), Pakistan	not applicable	Received as gift sample.
Hydrochloric acid	BDH Laboratories Ltd, UK	BDH3036-54L	Analytical grade
Methanol	Honeywell, Germany	34966	Analytical grade
Refrigerator (Pharmaceutical)	Panasonic, Pakistan	MPR-161 DH-PE	Refrigerator for storage at 4 °C
Rosuvastatin calcium	Searle Pharmaceuticals Pvt(Ltd) Pakistan	not applicable	Received as gift sample.
Sodium Hydroxide	Honeywell, Germany	38215	Analytical grade
Span 80	BDH Laboratories Ltd, UK	MFCD00082107	Analytical grade
Triplot Software	MS Excel spreadsheet developed by Tod Thompson	Triplot Ver. 4.1.2	Analytical software (freely available)
Tween-80	Sigma-Aldrich, Germany	P1754-500ML	Analytical grade
UV-Vis spectrophotometer	Dynamica, UK	Halo DB-20	Double beam spectrophotometer
Water Bath	Memmert, Germany	WNB 7	Water batch for heating up to 70 °C