Ensaio cam-delam para pontuação de propriedades metastáticas quantificando a capacidade de delaminação e invasão de células cancerosas

Resumo

O ensaio cam-delam para avaliar a capacidade metastática das células cancerosas é relativamente rápido, fácil e barato. O método pode ser usado para desvendar os mecanismos moleculares que regulam a formação de metástase e para a triagem de drogas. Um ensaio otimizado para análise de amostras de tumores humanos pode ser um método clínico para tratamento personalizado do câncer.

Resumo

A principal causa de mortes relacionadas ao câncer é a formação de metástase (ou seja, quando as células cancerígenas se espalham do tumor primário para órgãos distantes e formam tumores secundários). A delaminação, definida como a degradação da lamina basal e da membrana do porão, é o processo inicial que facilita a transmigração e disseminação de células cancerígenas para outros tecidos e órgãos. Marcar a capacidade de delaminação das células cancerosas indicaria o potencial metastático dessas células.

Desenvolvemos um método padronizado, o ensaio ex ovo CAM-Delam, para visualizar e quantificar a capacidade das células cancerígenas de delaminar e invadir, sendo assim capaz de avaliar a agressividade metastática. Resumidamente, o método CAM-Delam inclui a semeadura de células cancerígenas em anéis de silicone na membrana corioallantónica do filhote (CAM) no dia 10 embrionário, seguido de incubação de horas a poucos dias. O ensaio CAM-Delam inclui o uso de uma câmara umidificada interna durante a incubação de embriões de filhotes. Essa nova abordagem aumentou a sobrevida embrionária de 10%-50% para 80%-90%, o que resolveu problemas técnicos anteriores com baixas taxas de sobrevivência de embriões em diferentes ensaios de CAM.

Em seguida, as amostras de CAM com aglomerados de células cancerosas associadas foram isoladas, fixas e congeladas. Finalmente, amostras seccionadas por criostat foram visualizadas e analisadas para danos na membrana do porão e invasão de células cancerosas usando imunohistoquímica. Ao avaliar várias linhas de células cancerígenas metastáticas e não metastáticas projetadas para expressar proteína fluorescente verde (GFP), os resultados quantitativos do CAM-Delam mostraram que os padrões de capacidade de delaminação refletem a agressividade metastática e podem ser pontuados em quatro categorias. O uso futuro deste ensaio, além de quantificar a capacidade de delaminação como indicação de agressividade metastática, é desvendar os mecanismos moleculares que controlam a delaminação, a invasão, a formação de micrometastases e mudanças no microambiente tumoral.

Introdução

Aproximadamente 90% da mortalidade em pacientes com câncer é causada pelas consequências da metástase do câncer, que é a formação de tumores secundários em outras partes do corpo de onde o câncer originou originalmente¹. É, portanto, importante identificar mecanismos metastáticos para encontrar potenciais alvos para suprimir a formação de metástases tumorais. Posteriormente, há necessidade de sistemas de modelo nos quais o processo metastático possa ser avaliado.

Durante a metástase, as células cancerígenas sofrem transição epitelial-mesenquimal (EMT), um processo celular normal no qual as células epiteliais perdem suas propriedades de adesão e polaridade e, em vez disso, adquirem um caractere mesenquimal invasivo². A delaminação faz parte do processo de EMT e envolve a degradação da laminina na membrana do porão, que é um pré-requisito para que as células cancerígenas deixem o tumor primário e invadam outros tecidos. Os principais fatores que são regulados durante a formação de metástase incluem metaloproteínas matricial (MMPs), ADAM (a disintergin e metaloproteinase), ADAM (ADAM com motivos de trombospondina) e MMPs do tipo membrana (MT-MMPs)^3,4. Esses fatores degradam moléculas como a laminina, expressa em todas as membranas do porão, para facilitar a migração celular e a invasão.

A membrana corioallantóica (CAM) de um ovo de pintinho fertilizado é um tipo de membrana do porão. Os óvulos de pintinhos fertilizados têm sido usados como modelos metastáticos, nos quais as células cancerígenas foram semeadas na CAM extraembryônica e posterior formação de metástase observada nos embriões^{filhotes 5}. Além disso, são frequentemente utilizados modelos metastáticos do rato in vivo , nos quais as células cancerígenas são implantadas nos camundongos e as metástases em vários órgãos são analisadas⁶. Essa abordagem é demorada, cara e pode causar desconforto para os animais. Para lidar com isso, desenvolvemos o ensaio CAM-Delam, um modelo mais rápido e barato para avaliar a agressividade metastática das células cancerosas. Neste modelo, a capacidade das células cancerígenas de degradar o filhote CAM (por exemplo, a capacidade de delaminação) é combinada com a possível invasão de células cancerígenas no mesenquime e usada como medida de agressividade metastática.

O presente artigo, baseado em uma publicação anterior⁷, descreve em detalhes o ensaio CAM-Delam, desde o manuseio de óvulos de pinto fertilizado, cultura celular cancerígena e semeadura, dissecção e análises de amostras de CAM, até a pontuação da capacidade de delaminação das células cancerosas em quatro categorias: intacta, alterada, danificada e invasão. Também damos exemplos de como este ensaio pode ser usado para determinar os mecanismos moleculares que regulam o processo de delaminação.

Protocolo

Resumindo, a Figura 1 resume os passos gerais do ensaio CAM-Delam. O protocolo abaixo é baseado em 30 ovos de galinha fertilizados cultivados e no uso de duas linhas diferentes de células cancerígenas semeadas separadamente em três anéis/óvulos e analisadas em quatro pontos de tempo.

1. Incubação de ovos

1. Use ovos de pintinhos fertilizados de um incubatório local, que garantem mais de 90% de fertilização
   NOTA: Os ovos não devem ter sido armazenados por mais de 4 dias em temperatura ambiente (RT). Na Suécia, a permissão ética para o uso experimental de galinhas embrionárias só é necessária a partir do dia embrionário (E) 14 e além.
2. Se necessário, limpe cuidadosamente qualquer sujeira ou penas nos ovos usando uma toalha de papel seco ou molhada na água.
3. Limpe e esterilize a incubadora de ovos com 70% de etanol antes de usar (todas as vezes).
4. Coloque o número desejado de ovos em bandejas de ovos e incubar os ovos de pintinho horizontalmente em uma incubadora de ovos a 37,5-38 °C com 70% de umidade. Considere isso como incubação dia 0 (Figura 1A).

2. Preparação de barco de pesagem, caixas plásticas e instrumentos de dissecção

1. Use 70% de etanol para esterilizar 30 barcos pesagem e 30 pequenas caixas plásticas (~0,4 L) com tampas transparentes.
2. Seque os barcos de pesagem e as caixas em um capô laminar durante a noite (ON) e armazene em uma caixa de plástico fechada até uso adicional no dia 3 de incubação.
3. Esterilizar 2 L de H₂O destilado ou desionizado por 30 ovos incubados.
4. Esterilize dois pares de tesouras e três pares de fórceps pulverizando 70% de etanol. Seque os instrumentos e depois guarde-os em uma caixa esterilizada até o dia 3 de incubação.
   NOTA: Essas ações (Etapas 2.1-2.4) podem ser feitas a qualquer dia antes do dia da incubação 3. Use luvas para evitar contaminação.

3. Abrindo os ovos e transferindo para a câmara umidificada interna

NOTA: Use luvas e máscara facial para evitar contaminação.

1. Adicione aproximadamente 50 mL de H₂O esterilizado às caixas plásticas esterilizadas. Mantenha as caixas cheias de água com tampas fechadas, para evitar contaminação, na RT até usar.
2. No dia 3 de incubação, quebre a casca de ovo usando a parte afiada da tesoura e corte uma abertura reta na casca.
3. Quebre manualmente a casca de ovo sobre um barco de pesagem e colete a clara de ovo, a gema e seu embrião saudável preso no barco de pesagem (Figura 1B). Procure um embrião intacto com um coração pulsante, gema intacta e vasos sanguíneos desenvolvidos para o experimento (>95% dos ovos incubados). Descarte ovos com um embrião malformado, um embrião sem coração batendo, uma gema de ovo quebrada ou vasos sanguíneos de gema danificados.
4. Transfira suavemente o barco de pesagem para uma câmara umidificada interna.
   NOTA: Para as etapas 3.2.-3.4., trabalhe o mais rápido possível para evitar contaminação e, se possível, use um capô laminar.
5. Incubar a câmara umidificada interna na incubadora de ovos (Figura 1C).
6. Cultura os ovos sem casca do dia 3 ao dia 10 na incubadora de ovos antes de ser usado (ver Passo 3.6.), e quando necessário, adicione água à incubadora para manter 70% de umidade.
7. Verifique as câmaras umidificadas internas através da tampa plástica transparente em busca de embriões mortos ou ovos sem casca contaminados todos os dias, e remova-as da incubadora.

4. Preparação de anéis de silicone

1. Para preparar anéis de silicone, corte um tubo de silicone com diâmetro interno e externo de 4 mm e 5 mm, respectivamente, em espessura de ~1 mm, de preferência usando um cortador de papel (Figura 1D).
2. Transfira os anéis de silicone para pequenas garrafas de vidro (Figura 1D), cubra com papel alumínio e esterilize-os usando uma autoclave ou similar.
   NOTA: Evite a repetida autoclavagem de anéis de silicone nãousados que possam estar contaminados, uma vez que tal tratamento diminui a capacidade dos anéis de silicone para anexar à membrana, com posterior vazamento da solução de célula cancerígena/colágeno/RPMI fora dos anéis.
3. Armazene os anéis de silicone estéreis na RT.
   NOTA: Esta etapa pode ser feita a qualquer dia antes do dia da incubação 10.

5. Preparação de células cancerígenas

NOTA: Soluções como meio de cultura celular, trippsina e 1x PBS são armazenadas a 4 °C e devem ser aquecidas a 37 °C em banho-maria antes de adicionar às células. Após o aquecimento, enxágue as garrafas em 70% de etanol e seque antes do uso.

1. Cultura as linhas de interesse das células cancerígenas no meio de cultura relevante em uma incubadora de cultura celular a 37 °C na presença de 5% (v/v) CO₂.
   NOTA: Aqui, as células cancerígenas de próstata U251-GFP e PC-3U-GFP foram cultivadas em meio RPMI completo médio-RPMI complementado com 10% (v/v) soro bovino fetal (FBS) e 1% (v/v) penicilina-estreptomicina (PS).
2. Planeje a cultura das células cancerígenas para que aproximadamente 50 × 10⁶ células cancerígenas estejam prontas para a colheita no dia 10 do ensaio CAM-Delam.
3. Mude o meio de cultura celular a cada 2-3 dias, ou quando a cor média muda de rosa para laranja/amarelo.
4. Opcional: Induzir a hipóxia tratando as células cancerígenas com CoCl₂ para investigar os efeitos mecanicistas moleculares na delaminação 1 dia antes da colheita celular.
   ATENÇÃO: O CoCl₂ tem toxicidade moderada. Manuseie com cuidado em um capô de fumaça e siga as instruções do fabricante.
   1. Prepare uma solução fresca de estoque_{cocíctico de 20 mM CoCl 2} dissolvendo 0,0258 g em 10 mL de H₂0 destilado esterilizado em um tubo cônico de 15 mL embrulhado com papel alumínio para proteger da luz.
   2. Em um tubo cônico de 50 mL, misture 250 μL da solução de estoque cocíclica_{de 20 mM coccl 2} em 25 mL de meio RPMI complementado com 1% (v/v) PS (mas sem FBS) por prato de cultura celular de 15 cm de diâmetro. Vórtice suavemente.
   3. Remova o meio RPMI completo dos pratos de cultura celular.
   4. Lave as células com 1x PBS 2x esterilizados.
   5. Adicione 25 mL de meio RPMI com trippsinização de_células CoCl 2 de 200 μM (ver Passo 5.6).
5. No dia da incubação do ovo 10, prepare 1 mL de uma mistura de colágeno/RPMI (razão 1:3), contendo 250 μL de colágeno tipo I (5 mg/mL) e 750 μL de cultura celular Meio RPMI suplementado com 10% de FBS e 1% (v/v) PS. Mantenha o colágeno/RPMI-mix no gelo.
6. Trypsinize as células cancerígenas para isolar as células, removendo primeiro o meio de cultura celular e lavar 2x com 1x PBS.
7. Adicione 3 mL de solução de trippsina (0,05%) por prato de cultura celular de 15 cm de diâmetro e incubar por 2-3 min em uma incubadora de cultura celular até que as células se desprendem. Use um microscópio invertido e de mesa para ver as células separadas. Se necessário, toque suavemente na lateral do frasco para desalojar células agrupadas ou anexadas restantes.
8. Inativar trippsina adicionando 5 mL de meio RPMI completo a cada prato de cultura celular e coletar a suspensão celular de todos os pratos de cultura celular em um tubo de 50 mL.
9. Conte as células cancerígenas pelo método de exclusão Trypan Blue para distinguir as células mortas usando um contador celular. Adicione 10 μL da suspensão da célula a 10 μL de 0,4% de mancha azul trypan. Misture a amostra por pipetação para cima e para baixo algumas vezes e, em seguida, carregue 10 μL da mistura celular por câmara no slide da amostra no contador de células. Repita a contagem de células 3x para verificar o número da célula/mL.
10. Calcule e centrifufique a suspensão correta da cultura celular de volume contendo 50 x 10⁶ células cancerígenas vivas em um tubo de 50 mL a 500 × g por 5 min.
11. Descarte o supernatante e misture a pelota celular com 1 mL da mistura colágeno/RPMI. Como o colágeno é um material gelatinoso, misture as células de forma muito lenta e cuidadosa com uma pipeta de 1 mL para evitar a perda de células na formação de bolhas.
12. Mantenha a suspensão celular preparada no gelo e leve-a para a área de trabalho do ovo.
    NOTA: Evite manter as células cancerígenas preparadas no gelo por muito tempo. As células cancerígenas preparadas devem ser colocadas na CAM dentro de 15-25 min.

6. Semeando as células cancerígenas na CAM

NOTA: Use luvas e máscara facial para evitar contaminação.

1. No dia 10, retire as câmaras umidificadas internas com os ovos incubados sem casca da incubadora.
   NOTA: Aproximadamente 90% do número inicial dos ovos incubados podem ser utilizados; ver Figura 2.
2. Abra a câmara umidificada interna e coloque até seis anéis de silicone na CAM usando fórceps esterilizados.
   NOTA: Evite colocar os anéis de silicone perto uns dos outros ou perto de vasos sanguíneos maiores.
3. Misture a suspensão celular cancerígena por pipetação para obter uma distribuição uniforme das células cancerosas, e adicione 20 μL (1 ×¹⁰⁶ células) da suspensão de células cancerígenas preparadas dentro de um anel de silicone (Figura 1E). Ao adicionar as células, mantenha a ponta da pipeta acima da CAM para ter certeza de não danificar a membrana.
   NOTA: De acordo com os achados anteriores⁷, diferentes células cancerígenas podem ser semeadas em anéis separados na mesma CAM.
4. Feche a câmara umidificada interna e coloque-a na incubadora de ovos.

7. Isolamento da CAM com células cancerígenas associadas

1. Após 14h, 1,5 dias, 2,5 dias e 3,5 dias de incubação, tire aproximadamente sete câmaras umidificadas internas e abra as tampas uma de cada vez.
2. Com um par de tesouras, disseca as células cancerígenas cultivadas anexadas à CAM (as chamadas amostras de CAM-Delam) cortando fora do anel de silicone (Figura 1F).
3. Transfira imediatamente a amostra isolada de CAM-Delam usando fórceps para 4% de paraformaldeído (PFA) em 0,1 M tampão fosfato (PB) em uma placa de Petri para fixação do tecido. Mantenha no gelo ou a 4 °C por 1h.
   NOTA: Armazene 4% de solução PFA a 4 °C por uma máxima de 5 dias. ATENÇÃO: A PFA é tóxica. Ao manusear soluções de pó PFA e PFA, use um capuz de fumaça e use uma máscara facial e luvas. Evite inalar vapores em pó ou solução. Siga as instruções do fabricante.
4. Decapitar os embriões de frango e descartar como resíduos biológicos em lixeiras específicas.
5. Remova a solução PFA de 4% e adicione 30% de sacarose em 0,1 M PB às amostras de CAM-Delam e equilibre a 4 °C por 1h.
6. Sob um microscópio de dissecção, remova cuidadosamente o anel de silicone usando fórceps. Com um par de tesouras, corte a amostra CAM-Delam em forma retangular com as células cancerígenas no meio (Figura 1G).
7. Com um par de fórceps, transfira as amostras cam-delam para meio de seção congelada em uma placa de Petri para remover o excesso de sacarose e, em seguida, para incorporar moldes em meio de seção congelada.
8. Sob um microscópio de dissecção, posicione a amostra CAM-Delam em forma de U em uma direção vertical nos moldes de incorporação usando qualquer instrumento semelhante a agulha (Figura 1G).
9. Congele e armazene as amostras de CAM-Delam a −80 °C.

8. Seccionando amostras de CAM-Delam

1. Seção as amostras cam-delam congeladas a 10 μm em 5-6 slides consecutivos usando criosectioning.
2. Armazene os slides com seções a −80 °C ou use diretamente para coloração imunohistoquímica.

9. Mancha de imunohistoquímica

1. Leve os slides de −80 °C para RT por 5 minutos antes de iniciar o imunoprotocol.
2. Faça uma linha com um marcador hidrofóbico nos slides onde as seções terminam. Deixe-os secar por alguns minutos.
3. Coloque os slides em uma câmara umidificada (H₂O) e cubra as seções com ~200-500 μL de solução de bloqueio (10% soro de bezerro fetal e 0,1% azida de sódio em soro tampão de tris com 0,1% Triton X-100 [TBST]) e incubar por 15-30 min.
   NOTA: A partir deste passo em diante, não deixe os slides secarem em nenhum momento.
4. Despeje a solução de bloqueio e substitua-a por 100-150 μL do anticorpo primário de interesse diluído na solução de bloqueio e incubar ON a 4 °C. De preferência use anticorpo anti-laminina-111 de coelho para definir a lamina basal juntamente com um marcador de célula cancerosa, se não estiver usando GFP ou outras linhas de células cancerígenas com marca fluorescente.
   NOTA: Aqui, um fator anti-von Willebrand de coelho também foi usado para detectar vasos sanguíneos na CAM.
5. Prepare três cuvetas de vidro cheias com tampão TBST.
6. Despeje a solução de anticorpos primárias, transfira os slides para as de vidro e lave pelo menos 3x por 5 min cada em TBST.
7. Remova o excesso de TBST da lâmina e da área de barreira hidrofóbica com um tecido de papel mole.
8. Cubra o slide com 100-150 μL de um anticorpo fluorescente secundário adequado diluído em solução de bloqueio combinada com 4',6-diamidino-2-fenilôndole, dihidrocloreto (DAPI) e incubar no escuro em RT por 1 h.
9. Despeje a solução secundária de anticorpos, transfira os slides para as cuvetas de vidro e lave pelo menos 3x por 5 min cada em TBST.
10. Remova o excesso de TBST da lâmina e da área de barreira hidrofóbica com um tecido de papel mole.
11. Monte os slides colocando 1-2 gotas de meio de montagem fluorescente no slide, e coloque suavemente uma mancha de vidro, evitando bolhas de ar.
12. Deixe os slides secarem por pelo menos 1h a 4 °C antes de analisar e armazene os slides 4 °C.

10. Pontuação de imagem e delaminação de microscopia

1. Fotografe as seções usando um microscópio de epifluorescência equipado com uma câmera digital, de preferência a 10x de ampliação (Figura 1H).
2. Analise as seções utilizando as seguintes categorias de pontuação CAM-Delam (Figura 3):
   1. Procure por lâmina basal intacta sem alterações visíveis.
   2. Procure por lamina basal alterada, mas intacta.
   3. Procure por lamina basal danificada sem invasão de celular.
   4. Procure por lamina basal danificada com invasão de celular.

Resultados

A Figura 1 apresenta passos-chave no ensaio CAM-Delam⁷. O uso de câmaras umidificadas internas (Figura 1C) melhorou significativamente a taxa de sobrevivência dos embriões filhotes de <50% até 90% no dia 10 de incubação e de ~15% até 80% no dia da incubação 13 (Figura 2).

Figura 1: Passos-chave do ensaio CAM-Delam. (A) Incubar ovos de galinha fertilizados horizontalmente sem rotação. (B,C) No terceiro dia de incubação, quebre os ovos e coloque-os em barcos de pesagem estéreis (B), e posicione os barcos em uma câmara umidificada interna para posterior incubação (C). (D) Prepare anéis de silicone. (E) No dia 10 da incubação, coloque os anéis de silicone na CAM, e sementes 1 x 10⁶ células cancerígenas dentro dos anéis usando uma pipeta. (F,G) Em diferentes pontos de tempo (horas a dias), disseque a CAM com células cancerígenas anexadas, (F) fixação em PFA, tratar com sacarose, posição em meio de seção congelada, (G) e congelar em −80 °C. (H) Um exemplo de uma CAM seccionada com células cancerígenas GFP⁺ associadas (verde) e mancha imunohistoquímica de laminina (vermelho). Barras de escala = 2 mm (E,F), 1 mm (G) e 100 μm (H). Este número é de Palaniappan et ^al.7. Abreviaturas: CAM = membrana corioallantónica; PFA = paraformaldeído; GFP = proteína fluorescente verde. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Sobrevida embrião de frango em relação ao método de incubação. (A,B) No dia 10, a sobrevida do embrião de frango em HCs interna dobrou (valor médio 89,33; N = 105) em comparação com a incubação em placas de Petri (A; valor médio 40; N = 64) e câmaras não umidificadas (B; valor médio 48,67; N = 46). (C,D) No dia 13, observou-se alta taxa de sobrevivência utilizando-se o HC (valor médio de 81,67; N = 105), enquanto uma grande diminuição na sobrevida embrionária foi notada utilizando DP (C; valor médio 11,33; N = 64) e N-HC (D; valor médio 18,33; N = 46). A significância estatística foi testada por meio de um teste t de duas caudas não não verificado. As barras de erro indicam o desvio padrão. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Este número foi modificado a partir de Palaniappan et ^al.7. Abreviaturas: HC = câmara umidificada; PD = Placas de Petri; N-HC = câmara não umidificada; E X = Dia de Incubação X. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Análises de diferentes linhas de células cancerígenas expressando GFP (U251 glioblastoma, próstata PC-3U, cólon SW620 e pulmão A549) utilizando este protocolo foram relatadas anteriormente por Palaniappan et ^al.7. Os resultados do ensaio CAM-Delam incluem diferenças na morfologia da lamina basal, detectada por laminina, e invasão de células cancerosas, definidas como células que cruzaram a camada de lamina basal do filhote na camada mesodérmica do filhote (Figura 3). Esses resultados mostram que a capacidade das células cancerígenas de degradar a lamina basal e invadir o mesenquime pode ser pontuada em uma das quatro categorias: 1) lamina basal intacta sem alterações visíveis (Figura 3B), 2) lamina basal alterada, mas não danificada (Figura 3C), 3) lamina basal danificada sem invasão celular (Figura 3D) e 4) lamina basal danificada com invasão celular (Figura 3E ). Outra observação foi que, quando as células cancerígenas causaram uma lamina basal alterada ou danificada, a CAM também foi espessada com um aumento da formação de vasos sanguíneos, definido pela coloração de anticorpos contra o Fator von Willebrand, que é sintetizado nos vasos sanguíneos⁸ (Figura 4C-H). Estes dois fenótipos, uma CAM espessa e aumento da formação de vasos sanguíneos, não foram observados quando a CAM estava intacta (Figura 4A,B).

Figura 3: PONTUAÇÃO CAM-Delam. (A-E) Um exemplo de pontuação CAM-Delam baseado na integridade da lamina basal CAM, visualizada por anti-laminina (vermelho), e potencial invasão de células cancerígenas que expressam GFP (verde). (A) Controle cam sem células cancerosas. (B-E) Nas respostas às células cancerosas, quatro categorias que descrevem a morfologia da lamina basal podem ser pontuadas: (B) laminina intacta, (C) laminina alterada, mas não danificada (indicada por um asterisco), (D) laminina danificada, mas sem invasão de células cancerosas (setas), laminina danificada com invasão celular (pontas de flecha). Barra de escala = 100 μm (A-E). Este número é de Palaniappan et ^al.7. Abreviaturas: CAM = membrana corioallantónica; GFP = proteína fluorescente verde. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Avaliação do espessamento da CAM e formação de vasos sanguíneos. (A-H) Um exemplo de visualização do espessamento cam e formação de vasos sanguíneos, detectado pelo anti-Von Willebrand Factor (vermelho), em resposta à lamina de vários tipos de células cancerosas. (A,B) Controle cam sem células cancerosas. (C,D) Em resposta a uma linha de células cancerígenas não metastáticas (pontuada como Intacta), não foi detectado nenhum espessamento evidente do mesenquime ou aumento da formação de vasos sanguíneos. (E-H) Em resposta às células cancerígenas metastáticas que resultam em Laminina alterada ou danificada, o mesenquime foi engrossado (indicado por pontas de flecha dupla) e observou-se aumento da formação dos vasos sanguíneos (indicado por setas). Barra de escala = 100 μm. Este número foi modificado a partir de Palaniappan et ^al.7. Abreviaturas: CAM = membrana corioallantónica; GFP = proteína fluorescente verde. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Células cancerígenas de glioblastoma U251 e PC-3U são dois exemplos de linhas de células cancerígenas com capacidades de delaminação completamente diferentes (Figura 5). As células PC-3U induziram laminina danificada após 1,5 dias, com invasão clara após 2,5 dias (Figura 5A). Em contraste, as células U251 só induziram pequenas alterações de laminina após 1,5-3,5 dias, mas nunca causaram danos visíveis à laminina (Figura 5B).

Figura 5: Visualização da capacidade de delaminação das células cancerígenas de próstata (PC-3U) e glioblastoma (U251). (B) As células U251 causaram pequenas alterações de laminina após 1,5-3,5 dias. Os painéis certos mostram gráficos representando a pontuação cam-delam. O eixo y indica o número de amostras, e o eixo x indica os pontos de tempo da cultura. Barra de escala = 100 μm (A,B). Este número foi modificado a partir de Palaniappan et ^al.7. Abreviaturas: CAM = membrana corioallantónica; GFP = proteína fluorescente verde. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O ensaio CAM-Delam pode ser usado para definir mecanismos moleculares que regulam o processo de delaminação. Um exemplo é o uso do tratamento CoCl₂ para induzir a hipóxia com ou sem a combinação de inibição de metaloproteínas matricial (MMP) utilizando o amplo inibidor de MMP GM6001 (Figura 6). Após o tratamento do CoCl₂ , as células cancerígenas não metastáticas U251 adquiriram a capacidade de induzir delaminação e células invasivas, que foi suprimida quando o tratamento cocl₂ foi combinado com o inibidor de MMP GM6001 (Figura 6). Assim, o ensaio CAM-Delam pode ser útil na definição de moléculas e vias moleculares que afetam o processo de delaminação.

Figura 6: Padrões de delaminação em resposta às células U251 expostas apenas ao CoCl₂ ou juntamente com um inibidor de MMP. (A-C) Células U251 cultivadas por 3,5 dias na CAM durante várias condições. (A) As células U251 cultivadas sozinhas não induziram nenhum dano à laminina. (B) Células U251 cultivadas pré-expostas a CoCl₂ (24 h) antes da lavagem e semeadura celular no dano de laminina induzido cam e invasão celular. (C) Pré-tratamento com um inibidor de MMP de amplo espectro GM6001 (por 1 h), seguido de exposição de CoCl₂ (24 h) antes de lavar e semear células U251 na CAM, suprimiu o efeito do tratamento cocl₂, e nenhum dano óbvio de laminina ou invasão de células cancerígenas foi detectado. Barra de escala = 100 μm (A-C). Os painéis (B) e (C) são de Palaniappan et ^al.7. Abreviaturas: CAM = membrana corioallantónica; GFP = proteína fluorescente verde; CoCl₂ = cloreto de cobalto; MMP = metaloproteinase matricial. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Este artigo descreve o ensaio CAM-Delam para avaliar a agressividade metastática das células cancerosas, determinada pela pontuação de modulações basais de lamina e potencial invasão celular no mesenquime dentro de um período de horas a poucos dias. Um problema técnico anterior para vários ensaios cam tem sido a baixa sobrevivência de embriões de filhotes. Essa questão foi resolvida com a introdução do uso de uma câmara umidificada interna durante a incubação de embriões, o que aumentou a sobrevida embrionária de 10%-50% para 80%-90%⁷. O uso de uma câmara umidificada interna pode, portanto, ser valioso em ensaios cam em geral, bem como em outros experimentos ex-ovo chick.

Os pontos de pontuação apresentados em 14h, 1,5 dias, 2,5 dias e 3,5 dias após a semeadura de 1 x 10⁶ células cancerígenas na CAM baseiam-se no rigoroso desenvolvimento de métodos utilizando seis linhas celulares cancerígenos diferentes e são suficientes para distinguir o alcance da não nomeação às capacidades de delaminação com invasão de linhas celulares cancerígenas. Sugere-se um uso mínimo de quatro ovos com três anéis em cada ponto de tempo e por linha celular, e isso deve ser repetido pelo menos uma vez ou de acordo com projetos experimentais e requisitos estatísticos. Uma vantagem do ensaio CAM-Delam é obter resultados informativos sobre a capacidade de delaminação das células cancerosas dentro de poucos dias para estimar a agressividade das células cancerosas e o risco potencial de formação de metástases. A rápida entrega dos resultados é facilitada pelo monitoramento da degradação da lamina basal devido às células cancerígenas invasoras e aos microtumors/tumores subsequentes e metástases de órgãos. Tradicionalmente, modelos CAM têm sido usados para analisar a formação de metástases de órgãos, que leva cerca de 2 semanas para ser determinada⁹. Usando sete diferentes linhas de células cancerígenas, verificamos anteriormente⁷ que a pontuação de delaminação está ligada à capacidade das células cancerígenas de formar metástases em modelos de roedores 10,11,12,13,14, o que suporta o valor preditivo do ensaio CAM-Delam. Além disso, os modelos de mouse requerem um tempo ainda maior, várias semanas até meses, antes que as metástases possam ser examinadas^15,16. Resumindo, este ensaio CAM-Delam desenvolvido, focado em pontuação capacidade de delaminação e não em examinar a formação de tumores posteriores no embrião de filhotes, é, portanto, um bom complemento aos modelos de invasão cam de frango existente e modelos de tumor de rato.

Uma limitação no ensaio CAM-Delam pode ser a visualização incerta da lamina basal se as próprias células cancerígenas expressam laminina. Se assim for, outros marcadores que indicavam a lamina basal, como e-cadherin, poderiam ser^{usados 7}. Outros estudos de invasão cam têm usado colágeno tipo IV para visualizar a CAM e pan-citokeratina e vimentina para identificar células cancerígenas invasoras e a formação de microtumors/botões tumorais^17,18.

A delaminação é um processo celular normal, tanto durante o desenvolvimento quanto mais tarde na vida, o que torna possível que as células deixem um epitélio e migrem para outros tecidos. Exemplos de células delaminantes durante o desenvolvimento são a crista neural e os neurônios pioneiros olfativos^19,20; mais tarde na vida, a cicatrização de feridas depende da delaminação²¹. Durante o câncer, esse processo é regulado nas células erradas e/ou na hora errada. Assim, o método CAM-Delam pode ser útil para desvendar os mecanismos moleculares que regulam a delaminação, o que seria de importância tanto para o conhecimento biológico básico quanto para a doença. Tais estudos de delaminação incluiriam adicionar fatores de interesse às células cancerosas semeadas na CAM ou estudar células cancerígenas geneticamente modificadas. Um exemplo apresentado aqui é o pré-tratamento cocl₂ da linha celular não metastática U251 para induzir a hipóxia, o que leva à indução de uma capacidade agressiva metastática que poderia ser suprimida por um inibidor de MMP de amplo espectro. Assim, encontrar moléculas-chave que controlam a delaminação aumenta a possibilidade de projetar inibidores para suprimir esse processo. Em relação a isso, outro uso potencial para o protocolo CAM-Delam está na triagem de drogas para a supressão da delaminação e invasão celular. Além disso, na clínica, a avaliação da gravidade do câncer é um componente crítico para o diagnóstico, planejamento do tratamento e cuidado. Atualmente, o sistema de estadiamento TNM (T, tamanho do tumor; N, nó-se-se o câncer se espalhou para os linfonodos; M, metástase distante) é usado para avaliar a gravidade do câncer²². O ensaio CAM-Delam define uma abordagem inovadora para avaliar a agressividade das células cancerosas e o risco potencial para a formação de metástases e pode ser um complemento útil para o sistema de encenação TNM. Notável é que o estadiamento de TNM é baseado nas análises de amostras de tecidofixado, enquanto uma abordagem clínico potencial cam-Delam examinaria tecido fresco ou fresco congelado em combinação com técnicas para reviver células congeladas²³.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
EQUIPMENT
Centrifuge	Rotanta 480 R, Hettich zentrifugen
Countess II FL Automated Cell Counter	Invitrogen
Cryostat	HM 505 E, Microm
Digital camera	Nikon DS-Ri1
Dissection Microscope	Leica M10		For CAM-sample dissection and positioning in molds
Egg incubator	Fiem		Many other sources are available. Must be cleaned and sterilized with 70 % ethanol before each use
Epifluorescence microscope	Nikon Eclipse, E800		Equiped with a digital camera, for scoring delamination and cell invasion.
Fine forceps	Many sources are available		Must be sterilized before use
Freezer -80 °C	Thermo Fisher Scientific	8600 Series	Model 817CV
Inverted microscope	Nikon Eclipse TS100		For cell culture work
Scissors (small)	Many sources are available		Must be sterilized before use
MATERIALS
anti-Laminin-111	Sigma-Aldrich	L9393	Primary anti-rabbit antibody (1:400)
anti-rabbit Cy3	Jackson Immuno Research	111-165-003	Secondary antibody (1:400)
anti-von Willebrand Factor	DAKO	P0226	Primary antibody (1:100)
Cobalt(II) chloride	Sigma-Aldrich	232696-5G	CAUTION: moderate toxicity chemical. Handle with care only in fume hood. Follow manufacturers instructions
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-10MG	4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (1:400)
Fertilized chicken eggs	Strömbäcks Ägg, Vännäs, Sweden		Any local egg supplyer
Fetal bovine serum	Life Technologies	10500-064
Fluorescence mounting medium	Allent Technologie	S302380-2	Avoid bubble formation when mounting. Allow to dry at +4 °C
Glass chambers for silicon rings	Many sources are available		We used 15 mL glass chambers. Around 20 silicon rings fit in one chamber. Avoid crowding, since the rings may stick together and aggravate work.
Glass coverslips	VWR International	631-0165
GM6001 MMP Inhibitor	Sigma-Aldrich	CC1010
Microscope slides for immunohistochemistry	Fisher Scientific	10149870
NEG-50 frozen medium	Cellab	6506
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	30525-89-4	CAUTION: highly toxic. Handle with care only in fume hood, follow manufacturers instructions. Use all protective clothing.
Peel-A-Way Embedding Molds	Polysciences	18985
Penicillin–streptomycin	Gibco	15070063
Petri dishes	Sarstedt	83.3903	15 cm in diameter for cell culture
Plastic box	Esclain
PureCol EZ Gel Collagen	Cellsystems	5074-35ML	5 mg/mL. Gelatinous material. Pipette very slowly and carefully to avoid cells being lost in the bubble formations.
RPMI medium	Thermo Fisher Scientific	21875034
Silicon rings	VWR International	228-1580	Inner/outer diameter: 4/5 mm. Should be sterilized before use. Avoid repeated autoclaving of unused rings.
Trypan blue	Fisher Scientific	T10282
Trypsin	Life Technologi	15400054	0.50%
Weighing boats	VWR International	611-0094
SOLUTIONS
Collagen-RPMI media mixture (1 mL)			Compelete RPMI Media 750 µL
			PureCol EZ Gel Collagen 250 µL
			Mix and use immediately
Complete RPMI media (500 mL)			RPMI Media 445 mL
			FBS 50 mL
			Penicillin–streptomycin 5mL
			Store at 4 °C
PB (0.2 M; 1 000 mL)			Na2HPO4 (MW 141.76) 21.9 g
			NaH2PO4 (MW 137.99) 6.4 g
			add deionized water up to final volume of 1000ml
			Store in RT
PFA (4 %) in 0.1 M PB (100 mL)			Deionized water 50 mL
			0.2 M PB 50 mL
			Paraformaldehyde (PFA) 4g
			heat to 60 °C in water bath
			add 5 M NaOH 25 µL
			Stir to dissolve the PFA powder
			Store at 4 °C
TBST (1 000 mL)			50mM Tris pH 7,4 50 mL
			150mM NaCI 30 mL
			0,1% Triton X-100 10 mL
			H2O (MQ) 900 mL
Trypsin (0.05 %; 10 mL)			1x PBS 9 mL
			10x Trypsin (0.5 %) 1 mL
			10 mL in total, Store at 4 °C