Um novo modelo de ferida cutânea de ovino ex vivo de alto rendimento para testar antibióticos emergentes

Resumo

O protocolo descreve um método passo-a-passo para configurar um modelo de pele ferida ovina ex vivo infectada com Staphylococcus aureus. Este modelo de alto rendimento simula melhor infecções in vivo em comparação com técnicas convencionais de microbiologia e apresenta aos pesquisadores uma plataforma fisiologicamente relevante para testar a eficácia de antimicrobianos emergentes.

Resumo

O desenvolvimento de antimicrobianos é um processo caro com taxas de sucesso cada vez mais baixas, o que torna menos atraente o investimento adicional em pesquisa de descoberta de antimicrobianos. A descoberta de medicamentos antimicrobianos e a subsequente comercialização podem se tornar mais lucrativas se uma abordagem de falhar rápido e falhar barato puder ser implementada dentro dos estágios de otimização de leads, onde os pesquisadores têm maior controle sobre o design e a formulação de medicamentos. Neste artigo, descreve-se a configuração de um modelo de pele ferida ovina ex vivo infectado com Staphylococcus aureus, que é simples, econômico, de alto rendimento e reprodutível. A fisiologia bacteriana no modelo imita que durante a infecção como proliferação bacteriana é dependente da capacidade do patógeno de danificar o tecido. O estabelecimento da infecção da ferida é verificado por um aumento na contagem bacteriana viável em comparação com o inóculo. Este modelo pode ser usado como uma plataforma para testar a eficácia de antimicrobianos emergentes no estágio de otimização de chumbo. Pode-se argumentar que a disponibilidade desse modelo fornecerá aos pesquisadores que desenvolvem antimicrobianos um modelo de falha rápida e falha barata, o que ajudará a aumentar as taxas de sucesso em testes subsequentes com animais. O modelo também facilitará a redução e o refinamento do uso de animais para pesquisa e, em última análise, permitirá uma tradução mais rápida e econômica de novos antimicrobianos para infecções de pele e tecidos moles para a clínica.

Introdução

As infecções de pele são uma questão global importante, com grandes custos econômicos para os profissionais de saúde em todo o mundo. O desenvolvimento de multirresistência e formação de biofilme por patógenos desempenha um papel fundamental na prevalência de feridas não cicatrizantes 1,2,3,4. Como resultado disso, as infecções de pele e tecidos moles são um dos motivos mais comuns para a hospitalização prolongada e posterior readmissão⁵. Atrasos na cicatrização de feridas são caros tanto para o paciente quanto para os profissionais de saúde, com algumas estimativas sugerindo que cerca de 6,5 milhões de pacientes são afetados anualmente nos EUA. No Reino Unido, infecções de pele e complicações associadas resultam em aproximadamente 75.000 mortes anuais ^2,4,6.

Staphylococcus aureus (S. aureus) é um formidável patógeno de feridas frequentemente isolado de feridas de pacientes ^2,7. A taxa de emergência de multirresistência aumentou drasticamente na década de 2000. Durante esse período, cerca de 60% das infecções bacterianas agudas da pele e da estrutura da pele foram positivas para S. aureus^resistente à meticilina 1. O crescente número de cepas multirresistentes entre os estafilococos, e de fato outros patógenos, nas últimas 2 décadas indica uma necessidade urgente de rápido desenvolvimento de antibióticos com novos modos de ação que possam superar a resistência.

No entanto, desde o início dos anos 2000, os programas de descoberta de antibióticos têm sido dominados por tempos de desenvolvimento mais longos e baixas taxas de sucesso, com apenas 17% dos novos antibióticos que entram em ensaios clínicos nos EUA alcançando aprovação no mercado⁸. Isso sugere uma disparidade entre os resultados dos testes in vitro de antibióticos emergentes e seus resultados clínicos. Pode-se argumentar que essa disparidade se deve em grande parte a diferenças na fisiologia bacteriana durante infecções in vivo e durante métodos microbiológicos convencionais ao testar a eficácia de antibióticos nos estágios pré-clínicos in vitro . Portanto, novos métodos laboratoriais que são mais representativos da fisiologia bacteriana durante a infecção são necessários para melhorar as taxas de sucesso em programas de descoberta de antibióticos.

Os métodos atuais para o estudo de infecções de pele incluem estudos em animais vivos (por exemplo, camundongos), modelos de pele ex vivo (por exemplo, suínos) e modelos de pele 3D projetados por tecidos (por exemplo, humanos)9,10,11,12. Estudos em animais vivos são estritamente regulamentados e têm rendimento relativamente baixo. Em modelos animais, ferimentos e infecções causam sofrimento significativo aos animais e levantam preocupações éticas. Os modelos de pele humana, ex vivo ou de engenharia de tecidos, requerem aprovação ética, conformidade com a legislação local e global (Lei de Tecidos Humanos, Declaração de Helsinque) e há dificuldade em adquirir tecidos, com algumas solicitações levando anos para serem atendidas^13,14. Ambos os tipos de modelos são trabalhosos e exigem conhecimentos significativos para garantir o sucesso experimental. Alguns modelos atuais de infecção cutânea ex vivo requerem discos pré-inoculados e aditivos para o leito da ferida para permitir a infecção; embora esses modelos sejam incrivelmente úteis, há limitações no processo de infecção, pois os aditivos limitam a utilização do leito da ferida como fonte de nutrientes^10,15,16,17. O modelo descrito neste estudo não utiliza aditivos para o leito da ferida, o que garante que a patologia da infecção e a contagem de células viáveis sejam resultado da utilização direta do leito da ferida como única fonte de nutrientes.

Dada a necessidade de novos métodos laboratoriais, foi desenvolvido um novo modelo ovino ex vivo de alto rendimento de infecções de pele para uso na avaliação da eficácia de antibióticos emergentes. Os estudos de infecção cutânea enfrentam muitos desafios - altos custos, preocupações éticas e modelos que não mostram um quadro completo^20,21. Modelos ex vivo e modelos explante 3D permitem uma melhor visualização do processo da doença e do impacto que os tratamentos podem ter a partir de um modelo clinicamente mais relevante. Aqui, a configuração de um novo modelo de pele ovina é descrita, que é simples, reprodutível e clinicamente relevante e tem alto rendimento. A pele ovina foi escolhida porque as ovelhas são um dos grandes mamíferos comumente usados para modelar respostas a infecções in vivo. Além disso, eles estão prontamente disponíveis nos matadouros, garantindo um suprimento constante de pele para pesquisa, e suas carcaças não são escaldadas, garantindo uma boa qualidade do tecido. Este estudo utilizou S. aureus como patógeno exemplar; no entanto, o modelo funciona bem com outros microrganismos.

Protocolo

Cabeças de cordeiro do matadouro R.B Elliott e Son foram utilizadas como fonte de amostras de pele neste projeto. Todos os cordeiros foram abatidos para consumo como alimento. Em vez de descartar as cabeças, estas foram reaproveitadas para pesquisa. A aprovação ética não foi necessária, pois o tecido era proveniente de resíduos descartados de matadouros.

1. Esterilização

1. Desinfetar a pinça antes da recolha das cabeças, tomando pinças limpas e realizando esterilização a seco a quente num forno a 200 °C durante 1 h. Autoclave todos os artigos de vidro a 121 °C durante 15 minutos antes da utilização.
2. Realizar todo o trabalho descrito dentro de um gabinete de classe 2 de microbiologia. Prepare todos os reagentes de acordo com as instruções do fabricante.

2. Coleta de amostras

1. No matadouro, os cordeiros Swaledale eram abatidos por atordoamento usando eletricidade ou uma pistola de parafuso cativo e exsanguinados. Recolher cabeças de borrego não mais de 4 h após o abate.

3. Preparação das cabeças

1. Desinfetar a secção da testa do borrego derramando aproximadamente 100 ml de solução de dióxido de cloro a 200 ppm na área da amostra. Raspe a seção da testa da cabeça usando cortadores elétricos e lave a área com 200 mL de solução de dióxido de cloro de 200 ppm.
2. Limpe a área com etanol e rolo azul e cubra a área da amostra com creme de depilação por 35 min. Raspe suavemente o creme de depilação usando uma ferramenta de raspagem e avalie a área da amostra. Se uma quantidade significativa de pelos permanecer, repita o processo de depilação.
3. Use mais 200 mL de solução de dióxido de cloro para enxaguar a área e, em seguida, enxaguar com etanol e limpar com um rolo azul.
4. Usando um punch de biópsia estéril de 8 mm, corte amostras de pele de 8 mm da área preparada. Remova as amostras usando pinça estéril e um bisturi de 15 lâminas, garantindo que toda a gordura cutânea seja removida.
5. Coloque as amostras em um frasco estéril de 0,5 L preenchido com solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) e, em seguida, transfira-as para tubos estéreis de 50 mL com 50 mL de solução de dióxido de cloro de 200 ppm, inverta duas vezes e deixe esterilizar por 30 min.
6. Retire as amostras da solução de dióxido de cloro e lave-as colocando-as num tubo de 50 ml preenchido com 40 ml de PBS estéril. Uma vez lavado, coloque cada amostra de pele individual em um poço separado de uma placa de 24 poços.
7. Adicionar 350 μL de meio pré-aquecido, mantendo a amostra na interface ar-líquido. A composição do meio é a seguinte: MK (Meio 199 com sais de Hanks, L-glutamato e 1,75 mg/mL de bicarbonato de sódio) e F12 de Ham, na proporção de 1:1, com adição de FBS (10% v/v), EGF (10 ng/mL), insulina (5 μg/mL), penicilina-estreptomicina (100 U/mL) e anfotericina B (2,5 μg/mL).
8. Selar as placas de 24 poços com uma vedação de placa permeável a gás e incubar a 37 °C em uma incubadora de tecido de CO₂ a 5% umidificada por até 24 h.

4. Manutenção de amostras de pele

1. Após a incubação, retirar o meio de cultura e enxaguar as amostras em 500 μL de PBS estéril. Adicionar meios isentos de antibióticos a cada amostra e incubar a 37 °C numa incubadora de tecido de CO₂ a 5% humidificada durante 24 h para remover os antibióticos residuais da amostra.
2. Se turbidez ou infecção fúngica se desenvolverem no meio livre de antibióticos após 24 h, descarte a amostra.

5. Preparação do inóculo

1. Prepare um tubo de 50 mL com 10 mL de caldo de soja tríptico estéril. Pegue um prato de ágar fresco de S. aureus e use um cotonete para transferir várias colônias para o caldo. Incubar durante 18 h a 37 °C a 150 rpm.
2. Centrífuga a 4.000 x g por 3 min. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 10 mL de PBS estéril. Repita duas vezes para garantir a lavagem adequada das células.
3. Ajustar o inóculo para 0,6 OD₆₀₀ em PBS estéril. Confirme a carga de inóculo realizando uma contagem manual de placas viáveis.

6. Infecção de amostras de pele

1. Prepare uma placa fresca de 24 poços com 400 μL de meio pré-aquecido livre de antibióticos e adicione as inserções de 24 poços usando pinça estéril.
2. Remova o meio das amostras de pele, lave com 500 μL de PBS estéril e remova a lavagem. Use pinças estéreis para segurar suavemente a amostra no fundo do poço.
3. Use uma biópsia por punção de 4 mm para fazer um retalho central da ferida, perfurando até uma profundidade aproximada de 1-2 mm. Em seguida, use um bisturi de 15 lâminas e pinças de tecido allis dentadas estéreis para remover a camada superior do retalho da ferida. A variabilidade nas dimensões da ferida pode afetar o desfecho da infecção e as unidades formadoras de colônias (UFC) do desfecho.
4. Uma vez que todas as amostras tenham sido feridas, transfira-as para as inserções de 24 poços usando pinça estéril. Pipetar 15 μL do inóculo bacteriano para o leito da ferida. Em seguida, incubar por 24 h a 37 °C em uma incubadora de tecido de CO₂ a 5% umidificada.
5. Se forem necessários períodos de incubação mais longos, remova o meio e substitua-o por um meio fresco a cada 24 horas e incube nas mesmas condições.

7. Determinação da carga bacteriana

1. Remova a mídia do fundo dos poços. Com pinça estéril, transfira cada amostra para um tubo separado de 50 mL preenchido com 1 mL de PBS estéril.
2. Use um homogeneizador de ponta fina para homogeneizar a superfície da amostra. Tome cuidado para garantir que o leito da ferida esteja em contato direto com a ponta do homogeneizador.
3. Homogeneizar cada amostra por 35 s em médio/alto. O homogeneizador desprende as bactérias da superfície do leito da ferida para permitir a enumeração da carga bacteriana.
4. Uma vez que todas as amostras são processadas, vórtice cada amostra, por sua vez, antes da pipetagem. Isso é para garantir que o homogeneizado bacteriano seja misturado.
5. Pipetar 20 μL de homogeneizado vórtice para o poço correspondente de uma placa de 96 poços contendo 180 μL de PBS estéril.
6. Diluir serialmente cada homogeneizado da amostra para 1 x 10⁻⁷ e pipetar 10 μL do homogeneizado diluído para uma placa tríptica de ágar soja em triplicat.
7. Incubar a placa de ágar durante 18 h a 37 °C. Em seguida, conte o número de colônias para determinar a UFC para cada amostra.

Resultados

A identificação de uma via para esterilizar a pele antes da configuração do modelo de infecção da ferida foi um desafio. O desafio estava em esterilizar a pele sem danificar as diferentes camadas da pele, que podem então ter consequências não intencionais no resultado da infecção. Para identificar um regime de esterilização adequado, diferentes tratamentos foram tentados por diferentes períodos de tempo, conforme descrito na Tabela 1. A contaminação foi registrada como o desenvolvimento d...

Discussão

O desenvolvimento de antimicrobianos é um empreendimento importante, mas caro, que é estimado em cerca de US $ 1 bilhão e leva cerca de 15 anos para ser concluído. Mais de 90% da descoberta de medicamentos antimicrobianos e estudos pré-clínicos de eficácia de medicamentos antimicrobianos são realizados por pesquisadores acadêmicos e pequenas e médias empresas com tipicamente menos de 50 funcionários²². Essas equipes são muito limitadas financeiramente, o que torna calamitosa a falha da...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 Well Companion Plate	SLS	353504
4 mm Biopsy Punch	Williams Medical	D7484
50 ml centrifuge tubes	Fisher Scientific	10788561
8 mm Biopsy Punch	Williams Medical	D7488
Amphotericin B solution, sterile	Sigma	A2942
Colour Pro Style Cordless Hair Clipper	Wahl	9639-2117X	Hair Clippers
Dual Oven Incubator	SLS	OVe1020	Sterilising oven
Epidermal growth factor	SLS	E5036-200UG
Ethanol	Honeywell	458600-2.5L
F12 HAM	Sigma	N4888
Foetal bovine serum	Labtech International	CA-115/500
Forceps	Fisher Scientific	15307805
Hair Removal Cream	Veet	Not applicable
Heracell VIOS 160i	Thermo Scientific	15373212	Tissue culture incubator
Heraeus Megafuge 16R	VWR	521-2242	Centrifuge
Homogenizer 220, Handheld	Fisher Scientific	15575809
Homogenizer 220, plastic blending cones	Fisher Scientific	15585819
Insert Individual 24 well 0.4um membrane	VWR International	353095
Insulin, recombinant Human	SLS	91077C-1G
Medium 199 (MK media)	Sigma	M0393
Microplate, cell culture Costar 96 well	Fisher Scientific	10687551
Multitron	Infors	Not applicable	Bacterial incubator
PBS tablets	Sigma	P4417-100TAB
Penicillin-Streptomycin	SLS	P0781
Plate seals	Fisher Scientific	ESI-B-100
Safe 2020	Fisher Scientific	1284804	Class II microbiology safety cabinet
Scalpel blade number 15	Fisher Scientific	O305
Scalpel Swann Morton	Fisher Scientific	11849002
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761-1KG
Toothed Allis Tissue Forceps	Rocialle	RSPU500-322
Tryptic Soy Agar	Merck Life Science UK Limited	14432-500G-F
Tryptic Soy Broth	Merck Life Science UK Limited	41298-500G-F
Vimoba Tablets	Quip Labs	VMTAB75BX