새로운 항생제 테스트를 위한 새로운 고처리량 생체 외 난소 피부 상처 모델

요약

이 프로토콜은 황색포도상구균에 감염된 생체외 난소 상처 피부 모델을 설정하는 단계별 방법을 설명합니다. 이 고처리량 모델은 기존 미생물학 기술에 비해 생체 내 감염을 더 잘 시뮬레이션하고 연구자에게 새로운 항균제의 효능을 테스트할 수 있는 생리학적으로 관련된 플랫폼을 제공합니다.

초록

항균제의 개발은 성공률이 점점 낮아지는 값비싼 과정이므로 항균 발견 연구에 대한 추가 투자가 덜 매력적입니다. 항균 약물 발견 및 후속 상용화는 연구자가 약물 설계 및 제형을 더 잘 제어할 수 있는 리드 최적화 단계 내에서 페일패스트 앤 페일-싸게 접근 방식을 구현할 수 있다면 더 수익성이 높아질 수 있습니다. 이 기사에서는 황색포도상구균에 감염된 생체외 난소 상처 피부 모델의 설정에 대해 설명하며, 이는 간단하고 비용 효율적이며 처리량이 높고 재현 가능합니다. 모델의 박테리아 생리학은 박테리아 증식이 조직을 손상시키는 병원체의 능력에 의존하기 때문에 감염 동안 모방합니다. 상처 감염의 확립은 접종 원에 비해 생존 가능한 박테리아 수의 증가에 의해 확인됩니다. 이 모델은 리드 최적화 단계에서 새로운 항균제의 효능을 테스트하기 위한 플랫폼으로 사용할 수 있습니다. 이 모델의 가용성은 항균제를 개발하는 연구자들에게 실패-빠른-실패-값싼 모델을 제공하여 후속 동물 실험에서 성공률을 높이는 데 도움이 될 것이라고 주장할 수 있습니다. 이 모델은 또한 연구를 위한 동물 사용의 감소 및 개선을 촉진하고 궁극적으로 피부 및 연조직 감염에 대한 새로운 항균제를 클리닉으로 더 빠르고 비용 효율적으로 번역할 수 있도록 합니다.

서문

피부 감염은 전 세계적으로 중요한 문제이며 전 세계 의료 서비스 제공자에게 막대한 경제적 비용이 발생합니다. 병원균에 의한 다제 내성 및 생물막 형성의 발달은 치유되지 않는 상처 ^1,2,3,4의 유병률에 중요한 역할을합니다. 그 결과, 피부 및 연조직 감염은 장기 입원 및 후속^재입원의 가장 일반적인 이유 중 하나입니다5. 상처 치유의 지연은 환자와 의료 제공자 모두에게 비용이 많이 들며, 일부 추정치는 미국에서 매년 약 650 만 명의 환자가 영향을 받는다고 제안합니다. 영국에서는 피부 감염 및 관련 합병증으로 인해 매년 약 75,000 명이 사망합니다 ^2,4,6.

황색포도상구균(S. aureus)은 환자의 상처 ^2,7에서 자주 분리되는 강력한 상처 병원체입니다. 다제 내성의 출현률은 2000 년대에 급격히 증가했습니다. 이 기간 동안 급성 세균성 피부 및 피부 구조 감염의 약 60%가 메티실린 내성 S. 아우레우스¹에 대해 배양 양성이었습니다. 지난 2 년 동안 포도상 구균 및 실제로 다른 병원균 중 다제 내성 균주의 수가 증가함에 따라 내성을 극복 할 수있는 새로운 작용 방식을 가진 항생제의 신속한 개발이 시급히 필요함을 나타냅니다.

그러나 2000년대 초반부터 항생제 발견 프로그램은 개발 시간이 길어지고 성공률이 낮아져 미국에서 임상 시험에 진입한 새로운 항생제의 17%만이^{시장 승인을 획득}했습니다8. 이는 신종 항생제의 시험관 내 테스트 결과와 임상 결과 간의 차이를 시사합니다. 이러한 불균형은 주로 생체 내 감염 중 및 시험관 내 전임상 단계에서 항생제의 효능을 테스트 할 때 기존의 미생물 학적 방법 동안 박테리아 생리학의 차이 때문이라고 주장 할 수 있습니다. 따라서 항생제 발견 프로그램의 성공률을 높이기 위해 감염 중 박테리아 생리학을보다 잘 대표하는 새로운 실험실 방법이 필요합니다.

피부 감염을 연구하기 위한 현재의 방법은 살아있는 동물(예를 들어, 마우스), 생체외 피부 모델(예를 들어, 돼지), 및 3D 조직-조작된 피부 모델(예를 들어, 인간)에 대한 연구를 포함한다9,10,11,12. 살아있는 동물에 대한 연구는 엄격하게 규제되며 처리량이 상대적으로 낮습니다. 동물 모델에서 상처와 감염은 동물에게 심각한 고통을 유발하고 윤리적 문제를 제기합니다. 생체 외 또는 조직 공학적 인간 피부 모델은 윤리적 승인, 지역 및 글로벌 법률 (인체 조직법, 헬싱키 선언) 준수가 필요하며 조직 획득에 어려움이 있으며 일부 요청은^13,14를 이행하는 데 수년이 걸립니다. 두 모델 유형 모두 노동 집약적이며 실험적 성공을 보장하기 위해 상당한 전문 지식이 필요합니다. 일부 현재의 생체 외 피부 감염 모델은 감염을 가능하게 하기 위해 상처 베드에 사전 접종된 디스크와 첨가제가 필요합니다. 이러한 모델은 매우 유용하지만 첨가제가 영양 공급원으로서 상처 침대의 활용을 제한하기 때문에 감염 과정에 한계가 있습니다^10,15,16,17. 이 연구에서 설명된 모델은 상처 베드에 첨가제를 사용하지 않으므로 감염 병리 및 생존 가능한 세포 수가 상처 베드를 유일한 영양 공급원으로 직접 활용한 결과입니다.

새로운 실험실 방법의 필요성을 감안할 때, 새로운 항생제의 효능을 평가하는 데 사용하기 위한 피부 감염의 새로운 고처리량 생체 외 난소 모델이 개발되었습니다. 피부 감염 연구는 높은 비용, 윤리적 문제 및 전체 그림을 보여주지 않는 모델^20,21과 같은 많은 문제에 직면해 있습니다. 생체 외 모델과 3D 체외이식편 모델을 사용하면 질병 과정을 더 잘 시각화할 수 있으며 치료가 임상적으로 더 관련성이 높은 모델에서 미칠 수 있는 영향을 확인할 수 있습니다. 여기에서, 신규한 양 피부 모델의 설정이 설명되며, 이는 간단하고 재현 가능하며 임상적으로 관련이 있고 높은 처리량을 갖는다. 난소 피부는 생체내에서 감염에 대한 반응을 모델링하기 위해 일반적으로 사용되는 대형 포유동물 중 하나인 양으로 선택되었다. 또한 도축장에서 쉽게 구할 수 있어 연구를 위한 피부를 안정적으로 공급할 수 있으며 시체에 화상이 없어 좋은 조직 품질을 보장합니다. 이 연구는 S. 아우 레 우스를 모범 병원체로 사용했습니다. 그러나이 모델은 다른 미생물과 잘 작동합니다.

프로토콜

R.B Elliott와 Son Abattoir의 어린 양 머리는 이 프로젝트에서 피부 샘플의 소스로 사용되었습니다. 모든 어린 양은 음식으로 소비하기 위해 도살되었습니다. 머리를 버리는 대신 연구를 위해 용도가 변경되었습니다. 조직이 도축장에서 버려진 폐기물에서 공급되었기 때문에 윤리 승인이 필요하지 않았습니다.

1. 살균

1. 머리를 모으기 전에 깨끗한 집게를 취하고 200 ° C의 오븐에서 1 시간 동안 건열 살균을 수행하여 집게를 소독하십시오. 사용하기 전에 모든 유리 제품을 121 ° C에서 15 분 동안 오토 클레이브하십시오.
2. 미생물학 클래스 2 캐비닛 내에서 설명 된 모든 작업을 수행하십시오. 제조업체의 지침에 따라 모든 시약을 준비하십시오.

2. 샘플 수집

1. 도살장에서 Swaledale 양들은 전기나 포로 볼트 권총을 사용하여 기절시켜 도살하고 멸종되었습니다. 도축 후 4 시간 이내에 양고기 머리를 수집하십시오.

3. 머리 준비

1. 시료 부위에 약 100mL의 이산화염소 용액 200mL를 부어 양고기의 이마 부분을 소독합니다. 전기 클리퍼를 사용하여 머리의 이마 부분을 면도하고 200ppm 이산화 염소 용액 200mL로 해당 부위를 씻습니다.
2. 에탄올과 블루 롤로 해당 부위를 닦고 샘플 부위를 제모 크림으로 35분 동안 덮습니다. 긁는 도구를 사용하여 제모 크림을 부드럽게 긁어내고 샘플 영역을 평가합니다. 상당한 양의 머리카락이 남아 있으면 제모 과정을 반복하십시오.
3. 이산화염소 용액 200mL를 추가로 사용하여 해당 부위를 헹군 다음 에탄올로 헹구고 파란색 롤로 닦습니다.
4. 멸균 된 8mm 생검 펀치를 사용하여 준비된 영역에서 8mm 피부 샘플을 잘라냅니다. 멸균 집게와 15 날 메스를 사용하여 샘플을 제거하여 모든 피부 지방이 제거되도록합니다.
5. 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)로 채워진 멸균 0.5L 병에 샘플을 넣은 다음 200ppm 이산화염소 용액 50mL가 포함된 멸균 50mL 튜브로 옮기고 두 번 뒤집은 다음 30분 동안 멸균되도록 둡니다.
6. 이산화염소 용액에서 샘플을 제거하고 40mL의 멸균 PBS로 채워진 50mL 튜브에 넣어 세척합니다. 세척이 완료되면 각 개별 피부 샘플을 24웰 플레이트의 별도의 웰에 놓습니다.
7. 공기-액체 계면에서 샘플을 유지하면서 예열된 배지 350μL를 추가합니다. 배지의 조성은 다음과 같습니다 : MK 배지 (행크스 염, L- 글루타메이트 및 1.75 mg / mL 중탄산 나트륨이 포함 된 배지 199) 및 햄의 F12는 FBS (10 % v / v), EGF (10 ng / mL), 인슐린 (5 μg / mL), 페니실린-스트렙토 마이신 (100 U / mL) 및 암포 테리 신 B (2.5 μg / mL)가 첨가 된 1 : 1 비율입니다.
8. 24웰 플레이트를 가스 투과성 플레이트 씰로 밀봉하고 가습된 5%_CO2 조직 인큐베이터에서 최대 24시간 동안 37°C에서 배양합니다.

4. 피부 샘플의 유지 관리

1. 배양 후, 배양 배지를 제거하고, 샘플을 500 μL의 멸균 PBS로 헹구었다. 각 샘플에 무항생제 배지를 추가하고 가습된 5%_CO2 조직 인큐베이터에서 37°C에서 24시간 동안 배양하여 샘플의 잔류 항생제를 제거합니다.
2. 24 시간 후에 항생제가없는 배지에서 탁도 또는 곰팡이 감염이 발생하면 샘플을 폐기하십시오.

5. 접종물의 제조

1. 멸균 트립신 콩 브로스 10mL가 포함된 50mL 튜브를 준비합니다. S. aureus 의 신선한 한천 접시를 가지고 면봉을 사용하여 여러 식민지를 국물에 옮깁니다. 150 rpm에서 37°C에서 18시간 동안 배양한다.
2. 4,000 x g 에서 3분 동안 원심분리합니다. 상청액을 제거하고 세포 펠릿을 멸균 PBS 10mL에 재현탁시킨다. 세포를 적절하게 세척하기 위해 두 번 반복하십시오.
3. 접종물을 멸균 PBS에서 0.6_OD600 으로 조정한다. 수동 실행 가능한 플레이트 수를 수행하여 접종 부하를 확인합니다.

6. 피부 샘플의 감염

1. 400μL의 사전 예열된 무항생제 배지로 새로운 24웰 플레이트를 준비하고 멸균 집게를 사용하여 24웰 인서트를 추가합니다.
2. 피부 샘플로부터 배지를 제거하고, 500 μL의 멸균 PBS로 세척하고, 세척물을 제거한다. 멸균 집게를 사용하여 샘플을 우물 바닥에 부드럽게 고정하십시오.
3. 4mm 펀치 생검을 사용하여 중앙 상처 플랩을 만들고 1-2mm의 거친 깊이까지 관통합니다. 그런 다음 15날 메스와 멸균 톱니 앨리스 조직 집게를 사용하여 상처 플랩의 최상층을 제거합니다. 상처 치수의 가변성은 감염 및 종점 콜로니 형성 단위(CFU)의 결과에 영향을 미칠 수 있다.
4. 모든 샘플이 감겨지면 멸균 집게를 사용하여 24웰 인서트로 옮깁니다. 15 μL의 박테리아 접종물을 상처 베드에 피펫팅합니다. 이어서, 가습된 5%_CO2 조직 인큐베이터에서 37°C에서 24시간 동안 인큐베이션한다.
5. 더 긴 잠복기가 필요한 경우 배지를 제거하고 24시간마다 새 배지로 교체하고 동일한 조건에서 배양합니다.

7. 박테리아 부하의 결정

1. 우물 바닥에서 미디어를 제거하십시오. 멸균 집게를 사용하여 각 샘플을 멸균 PBS 1mL로 채워진 별도의 50mL 튜브로 옮깁니다.
2. 미세한 팁 균질화를 사용하여 샘플 표면을 균질화하십시오. 상처 베드가 균질화기의 팁과 직접 접촉하도록주의하십시오.
3. 중간/높음에서 35초 동안 각 샘플을 균질화합니다. 균질화기는 박테리아 부하의 열거를 허용하기 위해 상처 베드의 표면에서 박테리아를 분리합니다.
4. 모든 샘플이 처리되면 피펫팅 전에 각 샘플을 차례로 와동시킵니다. 이것은 박테리아 균질액이 혼합되도록 하기 위한 것입니다.
5. 20 μL의 볼텍싱된 균질액을 180 μL의 멸균 PBS를 함유하는 96-웰 플레이트의 상응하는 웰 내로 피펫팅한다.
6. 각 샘플 균질액을 1 x ^10-7 로 연속 희석하고 희석된 균질액 10 μL를 트립신 대두 한천 플레이트에 3배로 피펫팅합니다.
7. 한천 플레이트를 37°C에서 18시간 동안 인큐베이션한다. 그런 다음 콜로니 수를 계산하여 각 샘플에 대한 CFU를 결정합니다.

결과

상처 감염 모델을 설정하기 전에 피부를 살균하는 경로를 식별하는 것은 어려웠습니다. 문제는 다른 피부층을 손상시키지 않고 피부를 살균하는 데 있었으며, 이는 감염의 결과에 의도하지 않은 결과를 초래할 수 있습니다. 적절한 멸균 요법을 확인하기 위해, 표 1에 요약된 바와 같이, 다양한 기간 동안 상이한 처리가 시도되었다. 오염은 피부 샘플을 유지하기 위해 사용된 MK 배지에?...

토론

항균제 개발은 중요하지만 비용이 많이 드는 벤처로 약 10억 달러의 비용이 들고 완료하는 데 약 15년이 걸릴 것으로 추정됩니다. 항균제 발견 및 항균제 효능에 대한 전임상 연구의 90% 이상이 학술 연구자 및^{일반적으로 직원이} 50명 미만인 중소기업에 의해 수행됩니다22. 이 팀은 재정적으로 매우 제한되어 있어 번역 연구의 후기 단계에서 납 분자의 실패를 재앙으로 만듭니다. 항...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 Well Companion Plate	SLS	353504
4 mm Biopsy Punch	Williams Medical	D7484
50 ml centrifuge tubes	Fisher Scientific	10788561
8 mm Biopsy Punch	Williams Medical	D7488
Amphotericin B solution, sterile	Sigma	A2942
Colour Pro Style Cordless Hair Clipper	Wahl	9639-2117X	Hair Clippers
Dual Oven Incubator	SLS	OVe1020	Sterilising oven
Epidermal growth factor	SLS	E5036-200UG
Ethanol	Honeywell	458600-2.5L
F12 HAM	Sigma	N4888
Foetal bovine serum	Labtech International	CA-115/500
Forceps	Fisher Scientific	15307805
Hair Removal Cream	Veet	Not applicable
Heracell VIOS 160i	Thermo Scientific	15373212	Tissue culture incubator
Heraeus Megafuge 16R	VWR	521-2242	Centrifuge
Homogenizer 220, Handheld	Fisher Scientific	15575809
Homogenizer 220, plastic blending cones	Fisher Scientific	15585819
Insert Individual 24 well 0.4um membrane	VWR International	353095
Insulin, recombinant Human	SLS	91077C-1G
Medium 199 (MK media)	Sigma	M0393
Microplate, cell culture Costar 96 well	Fisher Scientific	10687551
Multitron	Infors	Not applicable	Bacterial incubator
PBS tablets	Sigma	P4417-100TAB
Penicillin-Streptomycin	SLS	P0781
Plate seals	Fisher Scientific	ESI-B-100
Safe 2020	Fisher Scientific	1284804	Class II microbiology safety cabinet
Scalpel blade number 15	Fisher Scientific	O305
Scalpel Swann Morton	Fisher Scientific	11849002
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761-1KG
Toothed Allis Tissue Forceps	Rocialle	RSPU500-322
Tryptic Soy Agar	Merck Life Science UK Limited	14432-500G-F
Tryptic Soy Broth	Merck Life Science UK Limited	41298-500G-F
Vimoba Tablets	Quip Labs	VMTAB75BX