Tratamento medicamentoso por Cateter Venoso Central em um Modelo de Camundongo de Angiotensin II Aneurisma Abdominal Induzido anótico e monitoramento por ultrassom 3D

Resumo

Este protocolo descreve a implantação consecutiva de uma bomba osmótica para induzir aneurisma aórtico abdominal por angiotensina II liberação em camundongos deficientes apolipoprotein E (ApoE) e de uma porta de acesso vascular com cateter venoso jugular para tratamento medicamentoso repetido. O monitoramento do desenvolvimento de aneurisma por ultrassom 3D é efetivamente realizado apesar dos implantes dorsais.

Resumo

Como faltam opções de tratamento farmacêutico no manejo clínico do aneurisma de ao menos abdominal (AAA), modelos animais, em particular modelos de camundongos, são aplicados para avançar na compreensão da patogênese da doença e identificar potenciais alvos terapêuticos. Testar novos candidatos a drogas para bloquear o crescimento da AAA nesses modelos geralmente requer repetida administração de drogas durante o período do experimento. Aqui, descrevemos um protocolo compilado para indução AAA, inserção de um cateter intravenoso para facilitar a terapia prolongada e monitoramento aaa serial por ultrassom 3D. Aneurismas são induzidos em camundongos deficientes de apolipoproteína E (ApoE) por liberação de angiotensina II ao longo de 28 dias de mini-bombas osmóticas implantadas subcutâneas no rato de volta. Posteriormente, é realizado o procedimento cirúrgico para cateterismo venoso jugular externo para permitir tratamento diário de medicamentos intravenosos ou amostragem repetida de sangue através de um botão de acesso vascular subcutâneo. Apesar dos dois implantes dorsais, o monitoramento do desenvolvimento de AAA é facilmente facilitado pela análise de ultrassom 3D semi-automatizada sequencial, que produz informações abrangentes sobre a expansão do diâmetro e volume aórtico e sobre morfologia do aneurisma, conforme ilustrado por exemplos experimentais.

Introdução

Um aneurisma de aorta abdominal (AAA) é uma dilatação patológica de um vaso devido a processos inflamatórios e destrutivos teciduais na parede aórtica que podem, em última análise, levar à ruptura e morte do paciente. Apesar de conquistas consideráveis na reparação cirúrgica de AAA, um tratamento medicamentoso conservador para bloquear a progressão da expansão do aneurisma e potencialmente diminuir o risco de ruptura está faltando até o momento. Modelos animais foram desenvolvidos para elucidar gatilhos e mediadores da doença e testar novas abordagens à terapia. Modelos de camundongos de AAA são amplamente aplicados e cobrem as diferentes observações do tecido humano. Devido às suas diferenças pathomecanísticas, muitas vezes mais de um modelo é aplicado para investigar a função particular de moléculas/vias ou a eficácia de potenciais drogas terapêuticas ^1,2. Entre os modelos mais utilizados de indução AAA está a administração de angiotensin-II (Ang-II) em camundongos deficientes apolipoprotein E (ApoE KO)³, que tem patogênese mais crônica em comparação com modelos que dependem da formação de aneurisma de um insulto agudo à parede aórtica ^4,5. Assim, o modelo Ang-II parece particularmente adequado para monitorar a progressão da doença e mostrou-se recentemente se assemelhar à doença humana AAA em relação às respostas metabólicas e inflamatórias⁶. Notavelmente, o modelo Ang-II apresenta não apenas o desenvolvimento AAA, mas também a formação de aneurisma torácico, bem como dissecção à aorta com formação de trombos intramuros.

Tratamentos destinados a direcionar a progressão do AAA já estabelecido em vez de prevenir o início da doença podem ter maior valor translacional, pois os pacientes apresentam uma condição pré-existente que requer tratamento ^7,8. Para um design experimental comparável, o tamanho aórtico precisa ser monitorado antes e depois da indução AAA para definir um limiar de desenvolvimento de doenças e potencialmente estratificar camundongos em grupos de tratamento.

O modo de administração de medicamentos depende da absorção e estabilidade da respectiva substância. As injeções intraperitoneais (i.p.) são mais frequentemente utilizadas devido à sua facilidade de aplicação, não necessitando de anestésico e falta de restrições de volume de injeção⁹. As farmacocinéticas devem ser consideradas, no entanto, ao escolher a rota da administração, uma vez que as substâncias administradas i.p. são absorvidas principalmente através da circulação do portal hepático e podem sofrer metabolismo hepático antes de chegar à circulação, o que pode resultar em concentrações plasmáticas variadas dependendo do efeito de primeira passagem¹⁰. A injeção intravenosa (i.v.) produz a maior biodisponibilidade de substâncias, e o desafio do acesso repetitivo pode ser contornado pelo uso de cateteres e portas de acesso vascular para a administração diária 11,12,13. Com relação ao cenário AAA, a distribuição de medicamentos em circulação facilita a exposição direta ao aneurisma em concentrações definidas.

Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho para induzir AAA no modelo de mouse Ang-II através da implantação subcutânea de uma bomba osmótica, para tratamento diário de drogas intravenosas através de uma porta de acesso vascular conectada a um cateter inserido na veia jugular externa, bem como para o monitoramento do tamanho do aneurisma via ultrassom 3D¹⁴ , apesar da presença de dois implantes dorsais.

Protocolo

Os experimentos em animais foram aprovados pelo comitê de ética local e pelo Ministério da Ciência da Áustria (BMWFW-66.009/0355-WF/V/3b/2016), em conformidade com a Diretiva Europeia 2010/63/UE sobre a proteção de animais usados para fins científicos e a Lei austríaca de Experimentos Com Animais 2012. Os pontos finais humanos foram definidos da seguinte forma: perda de ≥15% de peso corporal, evitando a ingestão de alimentos e/ou água, atividade reduzida (hipokinesia) ou dyskinesia, ou tremor prolongado, arranhões, respiração laboral ou postura curvada, apesar do gerenciamento de dor/sintoma. Se necessário, um animal é eutanizado sob anestesia profunda, ou seja, um coquetel de overdose de cetamina (aproximadamente 100 mg/kg) e xilazina (aproximadamente 5 mg/kg), ou por deslocamento cervical. Para procedimentos cirúrgicos, são utilizadas técnicas assépticas e luvas estéreis/limpas.

1. Implantação da bomba

1. Anestesia
   1. Mantenha os camundongos deficientes de ApoE (B6.129P2-Apoe^tm1Unc/J) em uma dieta normal e, preferencialmente, inclua animais machos de 12 a 14 semanas nos experimentos para representar a predominância masculina na doença humana³.
   2. 1 dia antes da cirurgia (d-1, pré-OP), prepare e encha as bombas osmóticas com a concentração desejada de angiotensina II de acordo com o peso do rato seguindo o protocolo do fabricante e incubar as bombas em soro fisiológico a 37 °C durante a noite^{de 15}.
      Exemplo: Para um mouse de 25 g, utilizando bombas osmóticas (ver Tabela de Materiais) com uma taxa de entrega de 1000 ng/kg/min e uma taxa de bomba de 0,25 μL/h por 28 dias, dissolver 1,8 mg de Ang-II em 300 μL de soro fisiológico (concentração de 6000 ng/μL para a entrega de 1500 ng/h de Ang-II). Carregue a solução com a agulha de enchimento contundente na bomba e, em seguida, insira o moderador de fluxo para fechar a bomba.
   3. Coloque o rato na câmara de anestesia em 3%-4% de isoflurane misturado com 2 L/min O₂ até inconsciente. Mova o mouse para uma mesa aquecida (37 °C) em posição propensa e mantenha a anestesia isoflurane em 1,8%-2% através de um cone de nariz.
   4. Aplique lubrificante ocular em ambos os olhos para evitar o ressecamento.
   5. Injete o mouse com 2,5% de buprenorfina em soro fisiológico a 10 μL/g de mouse subcutânea e verifique a profundidade da anestesia por uma pitada de dedo do dedo do dedo.
   6. Raspe uma pequena área no lado superior esquerdo do mouse para trás sobre a omoplata. Aplique 10% (w/v) solução povidone-iodo para desinfecção da área raspada.
2. Inserção da bomba (5-7 min, realizada sem microscópio)
   1. Verifique se o mouse está completamente anestesiado pelo dedo do dedo do dedo do dedo e faça uma incisão transversal de 1 cm na pele da parte superior das costas com um bisturi entre a linha escárula média e esquerda.
   2. Segure a pele com fórceps e use uma tesoura curvada e sem cortes para fazer um bolso subcutâneo empurrando em direção ao membro traseiro esquerdo. Abra a tesoura, puxe a tesoura aberta para fora do corte e repita para ampliar o bolso.
   3. Insira suavemente a bomba no bolso com o moderador de fluxo em direção à cauda (para minimizar a possível interferência da liberação de Ang-II pelo local da incisão).
      NOTA: O bolso não deve ser apenas largo o suficiente para a inserção da bomba, mas também para que a pele não fique apertada ao redor da bomba, e deve haver pelo menos 5 mm entre a bomba e o local da incisão para permitir a cicatrização ideal da ferida.
   4. Feche a ferida com suturas absorvíveis de 4-0.
   5. Injete o rato com 10% de glicose em soro fisiológico a 10 μL/g de camundongo subcutâneamente.
   6. Aplique spray de ferida povidone-iodo na ferida fechada e permita que o rato recupere a consciência sob uma lâmpada de aquecimento, em seguida, devolva-a à gaiola com 7,5 mg de piritramida (para o gerenciamento prolongado da dor) e 20 mL de 5% de glicose em 200 mL de água potável por 3 dias após a operação.
   7. Verifique os ratos várias vezes por dia para obter sinais de dor ou angústia.
      NOTA: Uma vez que as rupturas aórticas ocorrem a uma taxa de 20%-40% e predominantemente nos primeiros 3-10 dias pós-operação, o risco de dor ou angústia prolongadas precisa ser minimizado pelo monitoramento frequente dos animais. As principais indicações para ruptura iminente incluem: separação do grupo, postura curvada, diminuição da mobilidade (na medida da paralisia do membro traseiro) e diminuição ou não responsividade durante o manuseio.

2. Cateterismo venoso jugular

NOTA: Este procedimento cirúrgico requer um microscópio com ampliação de 8x-10x.

1. Utilizando o sistema de acesso vascular (ver Tabela de Materiais), prepare o cateter cortando o lado 3Fr para o comprimento desejado (~5-7 mm antes da âncora de silicone) e empurrando o cateter sobre o conector metálico de 22 G do sistema de acesso vascular (VAS) com pelo menos 3 mm de sobreposição. Coloque a tampa de alumínio no botão para proteger a porta.
2. Prepare ligaduras de seda de 1-1,5 cm de comprimento e 6-0.
3. Coloque o rato na câmara de anestesia em 3%-4% de isoflurane misturado com 2 L/min O₂ até inconsciente.
4. Mova o mouse para uma mesa aquecida (37 °C) em posição supina e mantenha a anestesia isoflurane em 1,8%-2% através de um cone de nariz.
5. Aplique lubrificante ocular em ambos os olhos para evitar o ressecamento.
6. Injete o mouse com 2,5% de buprenorfina em soro fisiológico a 10 μL/g de mouse subcutânea.
7. Raspe a pele do lado direito do pescoço no lado ventral e no lado direito da parte superior das costas (o lado esquerdo terá a bomba osmótica implantada).
8. Aplique a solução povidone-iodo para desinfecção da área raspada.
9. Verifique se o mouse está completamente anestesiado pelo dedo do dedo do dedo do dia.
10. Preparação da veia jugular (5-10 min, realizada sob o microscópio)
    1. Faça uma incisão de pele supraclavicular transversal de 0,5 cm no lado direito do pescoço sobre a clavícula direita.
    2. Use pinças microcirúrgicas cegas para separar o tecido conjuntivo e a gordura, expondo a veia jugular externa. Evite despedaçar pequenos vasos sanguíneos na gordura.
    3. Isole pelo menos 5 mm do vaso, perto dos músculos peitorais.
    4. Tecido dissecado sem corte sob a veia usando pinças micro dobradas e passar por 2-3 das ligaduras 6-0.
       NOTA: Se algum ramo lateral for identificado na área de interesse, ou a ligadura deve ser inserida para ser caudal para o ramo lateral ou o ramo lateral deve ser permanentemente ligado, isolando e amarrando com uma ligadura 6-0.
    5. Coloque as ligaduras e adicione uma gota de soro fisiológico ao local.
11. Implantação de botão (5-7 min, realizada sem microscópio)
    1. Vire o mouse e coloque-o na posição propensa; verifique a profundidade da anestesia por uma pitada de dedo do dedo do sol e aplique a solução povidone-iodo para desinfetar a área raspada.
    2. Faça uma incisão sagital de 1 cm na parte superior das costas com um bisturi entre as linhas escárulas médias e direitas.
    3. Use uma tesoura curvada sem cortes para fazer um bolso circular apenas um pouco maior do que o tamanho do VAS ao redor do local da incisão por dissecção contundente.
    4. Use a tesoura curvada para cavar cranialmente sobre o ombro direito em direção à incisão ventral no pescoço, abrindo ligeiramente a tesoura, em seguida, puxando a tesoura aberta para fora, e repetindo a ação à medida que é empurrada para dentro.
       NOTA: O mouse pode ser ligado no lado esquerdo para esta etapa.
    5. Uma vez que o túnel tenha atingido a incisão ventral, passe através de grampos cirúrgicos do ventral para a incisão dorsal.
    6. Conecte a extremidade 3Fr do cateter ao grampo e puxe o cateter através do túnel para que ele saia da incisão do pescoço ventral e o VAS esteja no lugar na incisão dorsal.
    7. Insira o disco de feltro cirúrgico do VAS subcutâneamente na incisão na parte de trás.
    8. Desescalar o cateter e lavar com soro fisiológico ou salino tampão-de-fosfato sem cálcio e magnésio (PBS^-/-), verifique se há patency usando a extremidade do garfo da ferramenta de manuseio para remover a tampa protetora de alumínio e, em seguida, use a extremidade magnética para segurar o botão e injete com uma seringa de 1 mL presa ao injetor correspondente até que o líquido vaze da extremidade de 1Fr.
       NOTA: A descarga do cateter pode ser conduzida alternativamente na etapa 2.1.
    9. Aperte o botão caudaly no bolso e feche a pele sobre o disco de feltro do VAS, sob a flange do VAS, com pelo menos duas suturas interrompidas por 4-0 cranialmente.
       NOTA: Certifique-se de que não há tensão na pele ao redor do botão.
12. Cateterismo venoso (7-10 min, realizado sob o microscópio)
    1. Vire o mouse de volta para a posição supina, verifique a profundidade da anestesia por uma pitada de dedo do sol e adicione uma gota de soro fisiológico ao local do corte.
    2. Amarre a primeira ligadura ao redor do cateter e a veia jugular com 2-3 nós o mais longe possível para ligar a veia e ancorar o cateter para fora. Mova a segunda ligadura o mais perto possível dos músculos peitorais.
    3. Encurte o cateter até o comprimento necessário para que ~3-5 mm do cateter esteja na veia cortando com micro-tesouras em um ângulo diagonal para criar uma extremidade afiada.
    4. Fure um buraco na veia usando uma agulha de 27 G presa a uma seringa de 1 mL cheia de soro fisiológico puxando a ligadura craniana presa e empurrando a agulha paralela à veia.
       NOTA: Se o sangue da retrofluência vazar da veia, use um cotonete para aplicar pressão até que o sangramento pare.
    5. Insira o cateter na veia da mesma forma puxando a ligadura craniana fixa e deslizando o cateter na veia usando as pinças dobradas. Empurre o cateter até que esteja alinhado com a veia.
    6. Amarre a segunda ligadura sobre a região onde o cateter é inserido na veia com 2-3 nós e verifique se não há vazamento de sangue. Uma terceira ligadura e parte do tecido adiposo local podem ser usados para proteger o cateter adicionalmente.
    7. Corte a extremidade excedente de ambas as ligaduras com micro-tesouras e adicione uma gota de soro fisiológico.
    8. Feche a pele com suturas absorvíveis de 4 a 0.
    9. Injete o rato com 10% de glicose em soro fisiológico a 10 μL/g de camundongo subcutâneamente.
    10. Injete o mouse com o volume desejado de inibidor ou PBS/soro fisiológico usando a extremidade do garfo da ferramenta de manuseio para remover a tampa protetora de alumínio e, em seguida, a extremidade magnética para segurar o botão e injetar com uma seringa de 1 mL presa ao injetor.
        NOTA: Certifique-se de que não há bolhas de ar ou ar na seringa de injeção pressionando o êmbolo até que uma gota de líquido saia antes de injetar. Mantenha a pressão positiva no êmbolo enquanto desconecta a seringa com o injetor do VAS para evitar puxar sangue na ponta do cateter e causar bloqueio do cateter.
    11. Aplique um spray de ferida povidone-iodo na ferida fechada e permita que o rato recupere a consciência sob uma lâmpada de aquecimento, em seguida, devolva-a à gaiola com 7,5 mg de piritramida (para o gerenciamento prolongado da dor) e 20 mL de 5% de glicose em 200 mL de água potável por 3 dias após a operação.
    12. Verifique os ratos várias vezes por dia para obter sinais de dor ou angústia.
13. Injeções diárias (<5 min)
    1. Para injeção diária, coloque o rato na câmara de anestesia em 3%-4% de isoflurane misturado com 2 L/min O₂ até que ele esteja inconsciente e sua taxa de respiração seja desacelerada, em seguida, injete como na etapa 2.12.10. Verifique se há sinais de inchaço pós-injeção, o que indicaria que o cateter não está mais inserido na veia. Além disso, note que a injeção não será possível se o cateter estiver ocluído.
       NOTA: Uma injeção de 10 μL/g de peso do rato 1x por dia é bem tolerada pelos camundongos.

Ultrassom .3D 3

1. Prepare o sistema de imagem de ultrassom, a mesa de aquecimento e o aquecedor de gel, conecte o transdutor ao sistema e configure-se acima do palco em uma posição transversal (ou seja, perpendicular à coluna do rato).
2. Usando o software de ultrassom, ajuste as configurações para ganho de 30 dB, profundidade de imagem de 9,0 mm e largura de imagem de 8,08 mm.
3. Coloque o rato na câmara de anestesia em 3%-4% de isoflurane misturado com 2 L/min O₂ até inconsciente. Mova o mouse para uma mesa aquecida (37 °C) na posição supina e mantenha a anestesia isoflurane em 1,8%-2% através de um cone de nariz.
4. Aplique lubrificante ocular em ambos os olhos para evitar o ressecamento.
5. Raspe a pele no abdômen do rato. Aplique creme de depilação por 1 min, se necessário, depois limpe e limpe com gaze úmida.
6. Adicione uma gota de gel de eletrodo a cada um dos quatro eletrocardiogramas (ECG) no palco e grave as extremidades do rato a eles.
7. Espalhe gel de ultrassom quente no abdômen do camundongo e baixe o transmissor para colocá-lo em contato com o animal.
8. Identifique a aorta como um vaso pulsante circular e rápido.
   NOTA: A veia cava inferior (IVC) estará localizada ao lado da aorta, e se a sonda for pressionada firmemente, o IVC será comprimido enquanto a aorta permanecer estável. A confirmação de que o vaso analisado é a aorta em vez do IVC pode ser obtida usando a onda de pulso Doppler (modo PW), com um ângulo de 65°. A aorta terá uma alta velocidade de onda de pulso.
9. Localize a artéria renal esquerda e inspecione manualmente a área de até 12 mm cranialmente para garantir que não haja interferência na área de interesse (ou seja, aorta suprarenal). Retorne à artéria renal esquerda e coloque a sonda em 6 mm cranialmente da artéria renal esquerda.
   NOTA: O ultrassom 3D registrará o comprimento especificado (ou seja, 12 mm) a partir da metade (6 mm) caudally do ponto de origem e até o comprimento especificado (12 mm) cranialmente. As etapas de solução de problemas para interferência incluem pressionar ligeiramente para baixo com o transdutor, levantar e depois baixar o transdutor novamente, aplicar mais gel de ultrassom e inclinar o ângulo do palco.
10. Aquisição de ultrassom 3D
    1. Coloque a gating respiratória com 25% de atraso e uma janela de 50% e o gatilho ECG (T1) a 50 ms (para registrar o pico de dilatação sistólica da aorta).
       NOTA: A gating respiratória pode ser otimizada para cada animal com base na taxa respiratória e esforço para garantir que os artefatos de movimento sejam removidos.
    2. Das opções 3D, defina a distância de varredura para 11,96 mm com um tamanho de etapa de 0,076 mm, o que resulta em 157 quadros.
    3. O programa adquirirá automaticamente os 157 quadros em aproximadamente 1-2 min. Role para verificar se há qualidade de imagem, repita se subpare e salve a imagem.
11. Aquisição de diâmetro 2D
    1. Desligue o gatilho de gating respiratório e ECG e localize manualmente a área com maior diâmetro no trecho de 12 mm da aorta suprarenal.
    2. Adquira uma imagem de modo B¹⁶.
    3. Além disso, sem mover o transdutor, adquira uma imagem de visualização de kilohertz (EKV) com as configurações padrão do sistema no mesmo local.
12. Terminando o exame
    1. Limpe o gel de ultrassom do abdômen e devolva o rato para sua gaiola. Monitore o mouse até que ele se recupere completamente.

4. Análise de ultrassom

1. Análise de volume
   1. No software de análise, abra a imagem do modo 3D e, no menu Processamento de Imagens , pressione o Load em 3D, que compilará os quadros 2D 157 em uma imagem 3D (ou seja, cubo).
   2. No menu Medição de Volume , escolha Métodos Paralelos & Rotacionais e, em seguida, o software exibirá a imagem 3D em um único painel.
   3. Em Volume, pressione Iniciar e desenhe o primeiro contorno ao redor da parede interna da aorta clicando para adicionar o primeiro ponto, movendo o cursor ao redor da aorta e, em seguida, clicando com o botão direito do mouse para completar o contorno.
   4. Pule 9-10 quadros (0,75-1 mm), em seguida, desenhe outro contorno da mesma maneira. Repita estes passos até que o último quadro seja atingido. Isso deve resultar em contornos de 16-17.
      NOTA: O primeiro e último quadros devem ter contornos desenhados para que o volume correto acima de 12 mm seja calculado.
   5. Selecione o primeiro contorno no menu e escolha Refinar. Isso iniciará o algoritmo de detecção de bordas para encaixar de perto a linha na parede do vaso. Mova os pontos no contorno arrastando-os para uma nova posição para que o contorno forra com precisão a borda interna da parede da aorta.
      NOTA: No modelo Ang-II, um trombo intramural pode estar presente. Como esta é uma característica comum deste modelo, a medição de volume deve incluir o trombo.
   6. Refine todos os contornos e pressione Finalize para salvar a análise. O volume calculado será exibido no canto inferior esquerdo.
2. Análise de diâmetro
   NOTA: As medidas de diâmetro podem ser realizadas de parede interna para interna, parede externa para externa ou parede interna para externa, mas devem ser consistentes para todas as medidas. No entanto, no modelo Ang-II, pode estar presente uma multidão intramural, que deve ser incluída na análise.
   1. A partir da imagem do modo 3D: Avalie os 157 quadros para identificar o diâmetro máximo por inspeção visual. Em seguida, no menu Medição , escolha Linear e desenhe várias linhas através da aorta para determinar o maior diâmetro.
   2. A partir do modo B ou EKV (visualização kilohertz fechada por ECG) imagem: No loop cine, identifique a expansão máxima da aorta (em systole) por inspeção visual. Em seguida, no menu Medição , escolha Linear e desenhe várias linhas através da aorta para determinar o maior diâmetro.
      NOTA: O ECG pode ser usado para determinar o ciclo cardíaco, mas a identificação visual produz resultados precisos.

Resultados

Os resultados representativos mostram o desenvolvimento e a progressão dos aneurismas suprarenais monitorados pelo ultrassom na linha de base, dia 8 e dia 27 (Figura 1A). Uma mancha tricrômica (Figura 1B) do dia 27 de aorta na Figura 1A ilustra ainda mais a morfologia do aneurisma formado com dissecção de parede e trombo intramuros. O volume aórtico (mm³) foi determinado em um trecho de 12 mm¹⁴, e o diâmetro máximo da aoórtica foi adicionalmente medido a partir das imagens EKV. Foi estabelecido um limiar de crescimento de volume de 125% da linha de base para o dia 8 para a definição do desenvolvimento inicial do aneurisma. Com base em dados coletados ao longo de 2 anos (2020-2021, n = 157), apenas 9% dos animais não conseguiram formar um AAA de acordo com este corte. No entanto, 35% dos camundongos experimentaram rupturas aórticas (torácicas ou abdominais) antes da implantação do cateter no dia 9, resultando em um total de 56% dos animais remanescentes com doença AAA estabelecida amenizando a estratificação em grupos de tratamento (Figura 1C). Note-se que, entre nossos controles históricos de PBS (n = 21), os aneurismas desenvolvidos em graus variados (faixa: 128%-314%, média de 199% ± crescimento de volume aórtico de 55% de SD no dia 8). É importante ressaltar que observou-se relação inversa entre a expansão inicial e a progressão da doença, ou seja, 55% dos aneurismas de rápido progresso (crescimento de volume > 200% no dia 8) não avançaram mais até o dia 27, enquanto 80% dos outros aneurismas (>125% e crescimento de volume de <200% no dia 8) continuaram a expandir-se até o final do experimento (Figura 1D).

Como relatado recentemente^14,17, os métodos descritos foram estabelecidos, validados e implementados com sucesso, por exemplo, para documentar o efeito terapêutico de um inibidor de citrulinação histona (GSK484, para a inibição da formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos) no bloqueio da progressão do AAA estabelecido. Os camundongos deficientes de ApoE receberam Ang-II a 1000 ng/kg/min por bombas osmóticas subcutâneas implantadas ao longo de 28 dias. Os animais foram estratificados 1:1 a GSK484 (0,2 μg/g/dia) ou tratamento PBS com base no volume aórtico medido no dia 8 e submetidos ao procedimento de cateterismo vesícula jugular no dia 9. As injeções medicamentosas foram realizadas diariamente em um volume de 10 μL/g de peso do rato até o final do estudo¹⁷. A Figura 2 mostra resultados exemplares (n = 2/grupo) de ultrassom (curso de tempo de expansão de volume absoluto e relativo ou diâmetro), revelando que o tratamento GSK484 inibiu a progressão do AAA, enquanto os aneurismas continuaram a aumentar em camundongos de controle.

Figura 1: Formação e progressão AAA no modelo de camundongo ang-II detectado pelo ultrassom 3D. (A) A aorta suprarenal foi monitorada por ultrassom 3D na linha de base (BL), dia 8 (d8) e dia 27 (d27) após implantação da bomba Ang-II. O volume foi medido em um trecho de 12 mm da aorta suprarenal (157 quadros) com base em uma imagem reconstruída em 3D. O diâmetro máximo da aoórtica foi determinado a partir de imagens EKV. (B) Mancha tricrômica de uma seção transversal do dia 27 aorta após sacrifício de camundongos e coleta de órgãos. A presença de uma dissecção de aorta é indicada por L1/L2 (lúmen 1 e lúmen 2), e o trombo intramural é denotado por * em A e B. (C) Taxa de incidência de AAA (crescimento de volume aórtico de > 125% de BL) no dia 8 e rupturas aórticas nos primeiros 9 dias (torácica ou abdominal) a partir de um conjunto de dados coletados ao longo de 2 anos (n = 157). (D) Frequência de progressão do dia 8 ao dia 27 de crescimento inicialmente rápido do volume (>200% de crescimento do volume aórtico de BL para o dia 8) versus crescimento moderado (>125% e crescimento de volume aórtico de < 200% de BL para o dia 8) em camundongos tratados com controle da PBS (n = 21). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Resultados exemplares da inibição da citrulinação histona para bloquear a progressão AAA no modelo Ang-II por injeção intravenosa de GSK484 ou PBS via botão de acesso vascular. (A) Volume aórtico (mm³) medido ao longo de um trecho de 12 mm da aorta suprarenal. (B) Crescimento calculado do volume aórtico a partir da linha de base (BL = 100%). (C) Diâmetro aórtico máximo determinado a partir de imagens EKV. (D) O crescimento calculado do diâmetro aórtico dos dados bl. GSK484 foi extraído de um estudo publicado anteriormente¹⁷. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

O modelo Ang-II é um dos modelos de mouse mais usados do AAA devido às suas baixas demandas técnicas e características particulares semelhantes à doença humana ^3,6. O tempo de cirurgia é de cerca de 10 minutos por animal, e a implantação da bomba subcutânea é bem tolerada pelos camundongos se o bolso subcutâneo for suficientemente largo e colocado baixo nas costas do animal, longe do local da incisão, de modo a não interferir na cicatrização da ferida. Quando a pele está apertada ao redor da bomba, pode ocorrer irritação tecidual, o que pode causar inflamação e escamos e potencialmente interromper o mecanismo de liberação da bomba por pressão osmótica. Medir o volume de Ang-II restante na bomba no momento do sacrifício animal dá uma ideia se o Ang-II foi lançado com sucesso ao longo dos 28 dias.

O modelo Ang-II foi recentemente proposto para ser bem adequado para estudar aneurisma aórtico e progressão de dissecção, pois exibe semelhança com características humanas de ambos^{os 6}. É importante ressaltar que testar candidatos a medicamentos para bloquear a expansão aórtica e influenciar a remodelagem corresponderia à demanda clínica atual. Em nosso cenário experimental, foi definido um corte para a formação de aneurisma antes do início do tratamento com base no crescimento de 125% do volume no dia 8 em relação à linha de base, que explica a variação natural do tamanho absoluto da aorta em camundongos. O limiar e o ponto de tempo foram derivados de um curso inicial de tempo que confirmou a destruição da parede de aorta na histologia (dados não mostrados) e resultou em rupturas de 35% e 56% observaram AAAs antes da implantação do cateter. Embora tenha sido aplicado um limiar mínimo de doença estabelecida para inclusão no estudo, observou-se posteriormente que uma alta extensão da expansão inicial da aorta também pode limitar a aplicabilidade experimental. Os aneurismas que progrediram rapidamente para > 200% do volume até o dia 8 não cresceram mais além desse tamanho em 55% dos casos (Figura 1D). Isso deve ser levado em conta durante o desenho experimental e o cálculo do tamanho da amostra, pois poderia mascarar o verdadeiro efeito de um tratamento. Outra faceta deste modelo são as frequentes rupturas aórticas (torácicas ou abdominais), ocorrendo a taxas de 20%-40% e principalmente nos primeiros 10 dias após a implantação da bomba Ang-II ^3,18,19. Assim, ao escolher o início do tratamento para ser o dia 9, foi alcançada uma alta taxa de aneurismas estabelecidas, e o cateterismo venoso jugular foi essencialmente realizado em camundongos que deveriam sobreviver até o final do experimento (apenas 3/24 ratos em nosso grupo de controle histórico romperam após o dia 9), assim conservando tempo, esforço, e custo.

Além das rupturas de aorta, que constituem uma condição grave, a implantação simultânea do cateter com botão de acesso vascular e da bomba osmótica foi bem tolerada pelos camundongos, sem efeito notável na mobilidade ou comportamento pós-recuperação da cirurgia. O procedimento de cateterismo venoso jugular deve levar cerca de 30 minutos para pesquisadores treinados. A duração da exposição à anestesia (isoflurane) deve ser mantida ao mínimo, e a taxa de respiração animal deve ser monitorada de perto para evitar a depressão respiratória, o que pode levar a um desfecho fatal se não for resolvido²⁰. A perda de sangue após perfurar a veia jugular para inserção de cateter - levando à morte de animais se maior - poderia potencialmente ocorrer quando a veia jugular não está adequadamente ligada cranialmente ou um ramo lateral que se alimenta na área isolada do vaso não é fechado. Nesse caso, a pressão com um cotonete deve ser aplicada no local da punção até que o vazamento de sangue diminua ou pare, então a inserção e ligadura do cateter deve ser feita o mais rápido possível; um pequeno pedaço do curativo da ferida de colágeno pode ser temporariamente utilizado para ajudar com hemostasia.

A patência do cateter é um dos fatores mais importantes, pois a desconexão do cateter da veia ou o botão de acesso resulta na entrega inadequada da droga onde a droga vaza para o espaço subcutâneo. Seguindo a recomendação do fabricante de uma sobreposição mínima de 3 mm entre o cateter e o conector metálico, apenas um caso de desconexão do cateter no lado do botão (indicado pelo vazamento líquido injetado do local da incisão no botão) foi registrado ao longo de 3 anos neste modelo (2020-2021, n = 73), que foi fixado pela abertura da ferida e restabelecimento da conexão na cirurgia. Além disso, uma taxa de falha de patency de cateter de cerca de 10% em nosso grupo histórico de controle de PBS (2/21) foi experimentada devido à oclusão do cateter (tornando impossível injetar), desconexão do cateter da veia (indicada por inchaço aparente no pescoço durante a injeção) ou complicações de cicatrização de feridas. Esses problemas podem estar ligados a lesões auto-infligidas, ou seja, arranhões ou mordidas de rato. Notavelmente, tratamentos medicamentosos que interferem na cicatrização de feridas podem aumentar as taxas de falha. As etapas de solução de problemas para melhorar a taxa de patência incluem o aumento do comprimento do cateter inserido na veia, a garantia de que as ligaduras sejam firmemente atadas ao redor do cateter e da veia, e a aplicação da técnica de pressão positiva seguindo a recomendação do fabricante, conforme descrito na etapa 2.12.10., durante a injeção. A patência do cateter deve, além disso, ser verificada no momento do sacrifício animal por dissecção e inspeção visual sob o microscópio. Note-se que o volume diário da solução de medicamentos injetados deve ser cuidadosamente considerado. Como o volume de plasma regula a pressão arterial, o volume de injeção pode afetar a expansão do AAA e, portanto, os animais de controle precisam receber o procedimento falso com volume portador. Com base em nossa experiência (e observações inéditas), uma quantidade diária de até 250 μL de PBS parece ser bem tolerada. Finalmente, semelhante à implantação da bomba, a irritação da pele pode ocorrer ao redor do botão de acesso vascular implantado. Se for observada inflamação acompanhada de tecido desvitalizado ou necrotico, o debridamento da ferida deve ser realizado removendo tecido não viável (o tecido necrosado muitas vezes se separará naturalmente da ferida), e a pele deve ser suturada se necessário; se a inflamação e a necrose forem extensas, o bem-estar do animal e os pontos finais humanos devem ser considerados de acordo com as diretrizes.

A implantação dorsal única e dupla da bomba osmótica e/ou do VAS não interferiu no sinal de ultrassom nem com a fixação do mouse em uma posição adequada no estágio de ultrassom. A aquisição automatizada de 157 quadros acima de 12 mm para renderizar uma imagem 3D da aorta para medição de volume é um procedimento simples e rápido¹⁴, o que requer apenas garantir que a aorta esteja livre de interferência sobre a área de interesse. Uma armadilha neste contexto é aplicar muita pressão com o transdutor ao tentar limpar a imagem de interferência, o que pode interromper a medição automatizada se a taxa de respiração for afetada pela compressão das costelas quando imagens da extremidade craniana da aorta abdominal são registradas. O diâmetro é tradicionalmente medido em imagens adquiridas utilizando o modo B pelo operador que procura manualmente a área de diâmetro máximo durante a realização da análise do ultrassom. Um avanço nas imagens do modo B são as imagens EKV, que podem resolver pequenos movimentos aórticos para produzir uma imagem de alta qualidade e desacelerada da aorta pulsante. Além disso, o diâmetro máximo do aórtico pode ser determinado a partir dos quadros 3D adquiridos, onde as 157 imagens oferecem uma visão geral abrangente da aorta tirada no systole (devido ao gatilho ECG definido).

Em conclusão, o protocolo compilado apresentado fornece um fluxo de trabalho confiável e reprodutível para a administração de medicamentos i.v. em um modelo de mouse de ANG-II induzido AAA e para monitorar o tamanho da aoórtica por ultrassom 3D. Os pontos de tempo de monitoramento e operação podem ser ajustados às necessidades específicas, e o cateterismo venoso jugular pode ser realizado separadamente para qualquer configuração experimental que exija a entrega de substâncias específicas através de injeções intravenosas. O VAS pode ser usado alternativamente para amostragem sanguínea repetida se uma solução de bloqueio de cateter for usada para evitar a coagulação. O procedimento de ultrassom 3D descrito pode ser adaptado para medir a aorta infrarenal, onde aneurismas se desenvolvem após insulto agudo em modelos de camundongos baseados em Elastase ou CaCl₂ de AAA. Embora a aquisição de ultrassom 3D tenha a vantagem de dar uma visão geral da região da aorta afetada e da morfologia do aneurisma, a aquisição de imagens é mais demorada e, portanto, pode ser mais intensiva em custos. Outra limitação do protocolo que deve ser reconhecido é a necessidade de os animais serem anestesiados brevemente para injeções intravenosas, enquanto a administração intraperitoneal é geralmente realizada em camundongos conscientes.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 Polysorb sutures	Covidien	GL-46-MG	Braided absorbable suture CV-23 Taper
6-0 Silk sutures	Ethicon	639H	PERMA-HAND Silk
ALZET 2004 osmotic pumps	DURECT Corp	298	Osmotic mini pumps
Angiotensin-II	Bachem	4006473.0100	Angiotensin II acetate
Aquasonic Clear Ultrasound Transmission Gel	Parker Labs	PUSG-0308	Ultrasound gel
Betadona Wound Spray	Mundipharma		Wound disinfectant spray (povidone-iodine spray)
Betaisodona Solution	Mundipharma	15973	Wound disinfectant solution (povidone-iodine solution)
Catheter for mouse femoral vein/artery	Instech Laboratories Inc	C10PU-MFV1301	1 to 3Fr, 10.5 cm, collar @1.2 cm. Fits 22 G
Hair removal cream
Handling tool	Instech Laboratories Inc	VABMG	Handling tool for magnetic mouse Vascular Access Buttons
HYLO NIGHT Eye Oinment	URSAPHARM	538922	Eye lubricant cream
Needles and syringes of various sizes			1 mL and 5 mL syringes, 27 G and 30 G needles
Olympus SZ51 Stereo microscope	Olympus Corporation		Dissection and inspection microscope
PinPort injectors	Instech Laboratories Inc	PNP3M-50	Injector for vascular access button
Protective aluminum cap	Instech Laboratories Inc	VABM1C	Protective aluminum cap for magnetic 1 channel mouse VAB
Signa Electrode Ultrasound Gel	Parker Labs	PE-1560	Electrode gel
Small electric shaver
Surigcal and microsurgical equipment
Suprasorb C	Lohmann & Rauscher	20482	Collagen wound dressing
Vascular access button (VAB)	Instech Laboratories Inc	VABM1B/22	Vascular Access Button for mouse, magnetic, 1 channel 22 G, injector
Vevo 3100 Imaging System	FUJIFILM VisualSonics Inc	51073-51	Ultrasound system
Vevo Lab 5.6.1 software	FUJIFILM VisualSonics Inc		Ultrasound analysis software
Vevo MX550D transducer	FUJIFILM VisualSonics Inc		Linear Array Transducer For Vevo 3100 system
Vevo Mouse Handling Table	FUJIFILM VisualSonics Inc	11436	Mouse heating, mouse core temperature capture and ECG pads for physiological monitoring