Avaliação do Comportamento Dominante-Submisso em Ratos Adultos Após Traumatismo Cranioencefálico

Resumo

O presente protocolo descreve um modelo de traumatismo cranioencefálico induzido por percussão fluida em ratos, seguido por uma série de testes comportamentais para compreender o desenvolvimento do comportamento dominante e submisso. A utilização desse modelo de traumatismo cranioencefálico em conjunto com testes comportamentais específicos possibilita o estudo dos prejuízos sociais após a lesão cerebral.

Resumo

A competição por recursos como comida, território e parceiros influencia significativamente as relações dentro das espécies animais e é mediada por hierarquias sociais que muitas vezes são baseadas em relações dominantes-submissas. A relação dominante-submisso é um padrão de comportamento normal entre os indivíduos de uma espécie. O traumatismo cranioencefálico é uma causa frequente de prejuízo na interação social e na reorganização das relações dominante-submissa em pares de animais. Este protocolo descreve o comportamento submisso em ratos machos adultos da raça Sprague-Dawley após a indução de traumatismo cranioencefálico usando um modelo de percussão fluida em comparação com ratos virgens através de uma série de testes dominante-submissos realizados entre 29 dias e 33 dias após a indução. O teste de comportamento dominante-submisso mostra como a lesão cerebral pode induzir comportamento submisso em animais que competem por comida. Após o traumatismo cranioencefálico, os roedores foram mais submissos, como indicado por passarem menos tempo no comedouro e terem menor probabilidade de chegar primeiro ao cocho em comparação com os animais controle. De acordo com esse protocolo, o comportamento submisso se desenvolve após traumatismo cranioencefálico em ratos machos adultos.

Introdução

A competição intraespécie ocorre quando membros de uma mesma espécie competem por um recurso limitado ao mesmo tempo¹. Em contraste, a competição interespécies ocorre entre membros de duas espécies diferentes². A competição intraespécies é dividida em dois tipos, incluindo interferência (adaptada) e exploração (competição), e surge dependendo do tipo de recurso em disputa, como alimento e território³.

A existência de hierarquias sociais é impossível sem relações dominantes-submissas (DSRs). A dominância apresenta-se como "ganhar" e a subordinação como "perder" dentro de pares de animais⁴. No entanto, os DSRs aparecem não apenas em pares, mas também em grupos de três ou mais. Em 1922, Thorleif Schjelderup-Ebbe descreveu a hierarquia de dominância em galinhas domésticas. Os principais sinais de distinção entre os animais dominantes e subordinados foram o tempo de comedouro e o comportamento agressivo. A hierarquia de dominância é dividida em duas formas: linear e não linear⁵. A dominância linear envolve dois grupos, A e B. Nesse paradigma de relações transitivas⁶, o grupo A domina o grupo B, ou o grupo B domina o grupo A. A dominância não linear ocorre quando há pelo menos uma relação circular: A domina B, B domina C e C domina A⁷.

Existem modelos de avaliação do comportamento dominante-submisso para diferentes espécies, incluindo roedores, aves⁸, primatas não humanos 9,10,11 e humanos ¹². O método dominante-submisso está bem representado na literatura e tem sido aplicado como modelo para avaliar mania e depressão¹³, bem como a atividade de drogas antidepressivas¹⁴. Esse modelo tem sido utilizado para investigar o estresse de vida precoce após a separação materna em ratos adultos¹⁵. Os paradigmas do DSR podem ser divididos em três modelos: o modelo de redução do comportamento dominante^13,16, o modelo de redução do comportamento submisso ¹⁴ e o modelo de reversão de dominância da clonidina¹⁷.

Este estudo demonstra uma investigação da DSR por meio de tarefas baseadas na competição alimentar. As vantagens desse método são sua fácil reprodutibilidade e a capacidade de observar e analisar com precisão o comportamento dominante-submisso. Além disso, a tarefa comportamental dominante-submissa depende mais da comida do que do território, ao contrário das tarefas comportamentais comparáveis, o que torna essa tarefa comportamental mais barata e simples e os pesquisadores não precisam passar por treinamento complicado para executar a tarefa e processar os dados.

O objetivo geral do presente estudo é demonstrar o desenvolvimento de DSR após traumatismo cranioencefálico (TCE). O TCE está associado a prejuízos sociais, depressão e ansiedade. O modelo de indução de TCE é um modelo padrão simples e eficaz que envolve a indução de traumatismo cranioencefálico com dispositivo de percussão fluida^18,19.

Protocolo

Os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados com Animais da Universidade Ben-Gurion do Neguev.Os experimentos foram realizados seguindo as recomendações das Declarações de Helsinque e Tóquio e das Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório da Comunidade Europeia. Ratos machos adultos da linhagem Sprague-Dawley, pesando entre 300 e 350 g, foram utilizados no presente estudo. Os animais foram alojados à temperatura ambiente de 22 °C ± 1 °C e umidade de 40%-60% com ciclos claro-escuro.

1. Preparo dos animais

1. Selecione aleatoriamente 30 ratos machos adultos e divida-os em dois grupos: TCE e simulação.
2. Forneça ração (consulte a Tabela de Materiais) e água ad libitum.
   NOTA: Execute todas as etapas do teste ao mesmo tempo para controlar o efeito da hora do dia no desempenho comportamental. É melhor realizar os testes de comportamento pela manhã (entre 6:00 e 12:00) para evitar distúrbios da atividade geral.
3. Realizar avaliações basais do escore de gravidade neurológica antes da lesão em ambos os grupos de ratos, conforme detalhado no passo 3 e na Tabela 1.
4. Anestesiar os ratos com isoflurano a 4% (para indução) e 1,5% (para manutenção). Injetar Buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg; SC) para analgesia preemptiva.
5. Verifique a imobilização do rato testando a falta de movimento ou reflexo pedal em resposta a um estimulante.
   NOTA: Para administração de anestesia, recomenda-se um fluxo contínuo de isoflurano.

2. Procedimento cirúrgico

NOTA: Todos os procedimentos devem ser realizados em condições assépticas. Use luvas estéreis. Troque as luvas se alguma superfície não estéril for tocada. Aplique lubrificante oftálmico em ambos os olhos para evitar o ressecamento. A lesão por percussão líquida parassagital foi realizada após relatos previamente^{publicados18,20}.

1. Infiltrar-se no couro cabeludo com bupivacaína a 0,5% (ver Tabela de Materiais), realizar incisão de 10 mm e retrair os tecidos lateralmente.
2. Realizar craniotomia^18,20 4 mm posterior e 4 mm lateral do bregma.
   NOTA: A área cirúrgica deve ser desinfetada várias vezes em movimento circular com um esfoliante à base de iodo ou clorexidina e álcool.
3. Induzir TCE^18,19 por um dispositivo de percussão fluida (ver Tabela de Materiais) ao longo de 21-23 ms através da torneira de três vias.
   NOTA: Executar TCE moderado com uma amplitude de 2,5 atm.
4. Realizar craniotomia no grupo de ratos sham-operados (Figura 1). Não induzir TCE para o grupo operado por simulação.
5. Realizar infiltração de bupivacaína a 0,1% antes do fechamento da ferida. Administrar buprenorfina (0,01-0,05 mg/kg) por via intramuscular como analgesia pós-operatória antes da suspensão do isoflurano.
   NOTA: Repetir doses de buprenorfina a cada 12 h por pelo menos 48 h.
6. Transfira o rato para a sala de recuperação e monitore seu estado respiratório (por exemplo, parada respiratória), neurológico (por exemplo, paralisia) e cardiovascular (por exemplo, mudanças na cor das pupilas, diminuição da perfusão de tecidos moles e bradicardia) por 24 horas.

3. Avaliação do escore de gravidade neurológica

OBS: A maior pontuação possível para alterações comportamentais e função motora é de 24 pontos. Um escore 0 representa o estado neurológico íntegro e um escore 24 representa disfunção neurológica grave21,22,23 (Tabela 1).

1. Avaliar o escore de gravidade neurológica (NSS) conforme previamente descrito²⁴ nos ratos TCE e sham antes da cirurgia, 48 h após a cirurgia (Figura 2A) e no 28º dia após a cirurgia (Figura 2B).

4. Estudando o comportamento dominante-submisso

1. Divida aleatoriamente os ratos em gaiolas 1 semana antes do teste.
   NOTA: Cada gaiola deve conter um rato operado simulado e um rato com TCE.
2. Realizar uma sessão de 15 minutos todos os dias durante 2 dias antes do teste para que os ratos possam se aclimatar ao protocolo.
   OBS: A tarefa dominante-submissa foi iniciada no 29º dia após a lesão (Figura 1).
3. Utilizar um aparelho (ver Tabela de Materiais) confeccionado com duas caixas de vidro acrílico transparente (30 cm x 20 cm x 20 cm, Caixa A e Caixa B, Figura 3) conectadas por um túnel delgado de 15 cm x 15 cm x 60 cm 15,19,25.
4. Encha um comedouro (Figura 3) com leite adoçado e coloque-o no centro do túnel. Use leite composto por 10% de açúcar e 3% de gordura.
5. Coloque o aparelho sobre uma mesa com altura de 80 cm acima do chão.
6. Coloque cada rato no aparelho por 15 min para habituação nos primeiros 2 dias. Inicie a tarefa após 2 dias de habituação.
7. Selecionar aleatoriamente um rato do grupo controle e um do grupo traumatismo cranioencefálico (TCE) e colocá-los a distâncias iguais do alimentador, permitindo que eles explorem por 5 min.
8. Permitir que os ratos tenham acesso à água ad libitum.
   NOTA: A tarefa durou 5 dias. A restrição alimentar foi realizada durante todo o período da tarefa. A alimentação foi fornecida diariamente por 1 h após o período de teste.
9. Limpar o equipamento com álcool a 5% antes de realizar os testes subsequentes com outros ratos.
   NOTA: A limpeza do aparelho eliminará o cheiro dos ratos anteriores. Realizar o teste em uma sala com circulação de ar adequada.

5. Gravação do vídeo e análise dos dados

1. Posicione uma câmera e instale o software de computador recomendado (consulte a Tabela de Materiais) para capturar, salvar e processar os dados.
   NOTA: A câmera precisa ser instalada a uma altura de 290 cm do chão.
2. Grave o vídeo enquanto os ratos estão na arena.
   OBS: A câmera e o aparelho foram posicionados a 210 cm de distância. A parte da arena onde o teste é realizado deve estar visível na moldura da câmera.
3. Realizar a análise^{dos dados 23} manualmente por dois analistas cegos para os grupos.

Resultados

Avaliação do escore de gravidade neurológica
Os déficits neurológicos foram avaliados em ratos machos após TCE usando o SNE. Os ratos foram divididos em dois grupos: um grupo TCE e um grupo controle. O grupo controle foi submetido à cirurgia simulada. O SNE permitiu a avaliação da função motora e alteração do comportamento por meio de um sistema de pontos^22,23; um escore de 24 indicou disfunção neurológica grave, e um escore de...

Discussão

Estudos clínicos indicam que a lesão cerebral pode aumentar o risco de transtornos psiquiátricos^26,27. Além disso, o TCE afeta o desenvolvimento do comportamento social^28,29. Nesse protocolo, o modelo de TCE teve efeito na apresentação do comportamento dominante-submisso. O comportamento dominante-submisso manifestou-se em termos de tempo gasto no comedouro e quem chegou primeiro ao comedouro.

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2% chlorhexidine in 70% alcohol solution	SIGMA - ALDRICH	500 cc	For general antisepsis of the skin in the operatory field
4 boards of different thicknesses (1.5 cm, 2.5 cm, 5 cm and 8.5 cm)	This is to evaluate neurological defect
4-0 Nylon suture	4-00
Bottles	Techniplast	ACBT0262SU
Bupivacaine 0.1 %
Diamond Hole Saw Drill 3 mm diameter	Glass Hole Saw Kit		Optional.
Digital Weighing Scale	SIGMA - ALDRICH	Rs 4,000
Dissecting scissors	SIGMA - ALDRICH	Z265969
Ethanol 99.9 %	Pharmacy		5%-10% solution used to clean equipment and remove odors
Fluid-percussion device	custom-made at the university workshop		No specific brand is recommended.
Gauze Sponges	Fisher
Gloves (thin laboratory gloves)			Optional.
Heater with thermometer	Heatingpad-1	Model: HEATINGPAD-1/2	No specific brand is recommended.
Horizon-XL	Mennen Medical Ltd
Isofluran, USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc	NDC 66794-017	Anesthetic liquid for inhalation
Logitech Webcam Software	Logitech	2.51	Software for video camera
Operating forceps	SIGMA - ALDRICH
Operating Scissors	SIGMA - ALDRICH
PC Computer for USV recording and data analyses	Intel		Intel core i5-6500 CPU @ 3.2GHz, 16 GB RAM, 64-bit operating system
Plexiglass boxes linked by a narrow passage			Two transparent 30 cm × 20 cm × 20 cm plexiglass boxes linked by a narrow 15 cm × 15 cm × 60 cm passage
Purina Chow	Purina	5001	Rodent laboratory chow given to rats,  is a lifecycle nutrition that has been used in biomedical research
Rat cages (rat home cage or another enclosure)	Techniplast	2000P	No specific brand is recommended
Scalpel blades 11	SIGMA - ALDRICH	S2771
SPSS	SPSS Inc., Chicago, IL, USA	A 20 package
Stereotaxic Instrument	custom-made at the university workshop		No specific brand is recommended
Timing device	Interval Timer:Timing for recording USV's		Optional. Any timer will do, although it is convenient to use an interval timer if you are tickling multiple rats
Video camera	Logitech	C920 HD PRO WEBCAM	Digital video camera for high definition recording of rat behavior under dominant submissive test