Оценка доминантно-покорного поведения взрослых крыс после черепно-мозговой травмы

Резюме

Настоящий протокол описывает крысиную модель черепно-мозговой травмы, вызванной жидкостной перкуссией, за которой следует серия поведенческих тестов для понимания развития доминирующего и покорного поведения. Использование этой модели черепно-мозговой травмы в сочетании со специфическими поведенческими тестами позволяет изучать социальные нарушения после черепно-мозговой травмы.

Аннотация

Конкуренция за ресурсы, такие как пища, территория и партнеры, существенно влияет на отношения внутри видов животных и опосредована социальными иерархиями, которые часто основаны на отношениях доминант-подчинение. Отношения «доминант-сабмиссив» — это нормальная поведенческая модель среди особей вида. Черепно-мозговая травма является частой причиной нарушения социального взаимодействия и реорганизации отношений доминанта-подчинения в парах животных. Этот протокол описывает покорное поведение у взрослых самцов крыс Sprague-Dawley после индукции черепно-мозговой травмы с использованием жидкостно-перкуссионной модели по сравнению с наивными крысами с помощью серии тестов на доминантность-подчинение, выполненных между 29 и 33 днями после индукции. Тест на доминантно-покорное поведение показывает, как черепно-мозговая травма может вызвать покорное поведение у животных, конкурирующих за пищу. После черепно-мозговой травмы грызуны были более покорными, о чем свидетельствует то, что они проводили меньше времени у кормушки и с меньшей вероятностью первыми прибывали к кормушке по сравнению с контрольными животными. Согласно этому протоколу, покорное поведение развивается после черепно-мозговой травмы у взрослых крыс-самцов.

Введение

Внутривидовая конкуренция возникает, когда представители одного и того же вида конкурируют за ограниченный ресурс в одно и то же время¹. Напротив, межвидовая конкуренция происходит между представителями двух разных видов². Внутривидовая конкуренция подразделяется на два типа, включая интерференцию (адаптированную) и эксплуатацию (конкуренцию), и возникает в зависимости от типа спорного ресурса, такого как пища и территория³.

Существование социальных иерархий невозможно без доминантно-покорных отношений (ДСР). Доминирование проявляется как «победа», а подчинение — как «проигрыш» в парах животных⁴. Однако DSR появляются не только парами, но и группами по три и более. В 1922 году Торлейф Шельдеруп-Эббе описал иерархию доминирования у домашних кур. Основными отличительными признаками между доминирующими и подчиненными животными были время, проведенное у кормушки, и агрессивное поведение. Иерархия доминирования делится на две формы: линейную и нелинейную⁵. Линейное доминирование включает в себя две группы: А и В. В этой парадигме транзитивных отношений⁶ группа А доминирует над группой В, или группа В доминирует над группой А. Нелинейное доминирование возникает, когда существует по крайней мере одно круговое отношение: А доминирует над В, В доминирует над С, а С доминирует над А⁷.

Модели оценки доминантно-покорного поведения существуют для различных видов, включая грызунов, птиц⁸, нечеловекообразных приматов 9,10,11 и людей ¹². Метод доминантно-сабмиссивного хорошо представлен в литературе и был применен в качестве модели для оценки мании и депрессии¹³, а также активности антидепрессантов¹⁴. Эта модель была использована для исследования стресса в раннем возрасте после материнского разделения у взрослых крыс¹⁵. Парадигмы DSR можно разделить на три модели: редукция модели доминантного поведения 13,16^, редукция модели^{подчиненного поведения 14} и клонидин-реверсная модель^{доминирования 17}.

Это исследование демонстрирует исследование DSR с помощью задач, основанных на пищевой конкуренции. Преимуществами этого метода являются его легкая воспроизводимость и возможность наблюдать и точно анализировать доминантно-сабмиссивное поведение. Кроме того, поведенческая задача «доминант-сабмиссив» опирается на еду, а не на территорию, в отличие от сопоставимых поведенческих задач, что делает эту поведенческую задачу более дешевой и простой, и исследователям не нужно проходить сложную подготовку для выполнения задачи и обработки данных.

Общая цель настоящего исследования - продемонстрировать развитие DSR после черепно-мозговой травмы (ЧМТ). ЧМТ связана с социальными нарушениями, депрессией и тревогой. Модель индуцирования ЧМТ представляет собой простую и эффективную стандартную модель, которая предполагает индуцирование черепно-мозговой травмы с помощью жидкостного перкуссионного устройства^18,19.

протокол

Эксперименты были одобрены Комитетом по уходу за животными Университета Бен-Гуриона в Негеве.Эксперименты проводились в соответствии с рекомендациями Хельсинкской и Токийской деклараций и Руководства по уходу за лабораторными животными и их использованию Европейского сообщества. В настоящем исследовании использовались взрослые самцы крыс Sprague-Dawley весом 300-350 г. Животные содержались при комнатной температуре от 22 ° C ± 1 ° C и влажности 40-60% с циклами света и темноты.

1. Подготовка животных

1. Выберите наугад 30 взрослых крыс-самцов и разделите их на две группы: ЧМТ и фиктивные.
2. Обеспечьте чау-чау (см. Таблицу материалов) и воду ad libitum.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все этапы теста одновременно, чтобы контролировать влияние времени суток на поведенческие показатели. Лучше всего проводить поведенческие тесты утром (с 6:00 до 12:00), чтобы избежать помех от общей активности.
3. Проведите исходную оценку неврологической тяжести до травмы в обеих группах крыс, как подробно описано в шаге 3 и таблице 1.
4. Обезболивают крыс 4% (для индукции) и 1,5% (для поддержания) изофлураном. Инъекционно бупренорфин (0,05-0,1 мг/кг; SC) для упреждающей анальгезии.
5. Проверьте иммобилизацию крысы, проверив отсутствие движения или педального рефлекса в ответ на стимулятор.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для введения анестезии рекомендуется непрерывный поток изофлурана.

2. Хирургическое вмешательство

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры должны выполняться в асептических условиях. Используйте стерильные перчатки. Меняйте перчатки при прикосновении к какой-либо нестерильной поверхности. Нанесите офтальмологическую смазку на оба глаза, чтобы предотвратить высыхание. Парасагиттальное водно-перкуссионное повреждение было выполнено по ранее опубликованным сообщениям^18,20.

1. Проникните в кожу головы 0,5% бупивакаином (см. Таблицу материалов), сделайте разрез 10 мм и втяните ткани в боковом направлении.
2. Выполняют^{трепанацию черепа 18,20} 4 мм сзади и 4 мм латерально брегмы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Операционную область необходимо продезинфицировать несколько раз круговыми движениями скрабом на основе йода или хлоргексидина и спиртом.
3. Индуцировать ЧМТ^18,19 жидкостно-ударным устройством (см. Таблицу материалов) в течение 21-23 мс через трехходовой запорный кран.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните умеренную ЧМТ с амплитудой 2,5 атм.
4. Проведите трепанацию черепа на группе фиктивно оперированных крыс (рис. 1). Не вызывайте ЧМТ в группе, прооперированной с фиктивной операцией.
5. Перед закрытием раны проводят 0,1% инфильтрацию бупивакаином. Вводят внутримышечно бупренорфин (0,01-0,05 мг / кг) в качестве послеоперационной анальгезии перед отменой изофлурана.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Повторяйте дозы бупренорфина каждые 12 ч в течение не менее 48 ч.
6. Переведите крысу в послеоперационную палату и наблюдайте за ее респираторным (например, остановка дыхания), неврологическим (например, паралич) и сердечно-сосудистым состоянием (например, изменением цвета зрачков, снижением перфузии мягких тканей и брадикардией) в течение 24 часов.

3. Оценка неврологической степени тяжести

ПРИМЕЧАНИЕ: Максимально возможный балл за поведенческие изменения и двигательную функцию составляет 24 балла. Оценка 0 представляет собой интактный неврологический статус, а оценка 24 представляет тяжелую неврологическую дисфункцию^21,22,23 (таблица 1).

1. Оцените оценку неврологической тяжести (NSS), как описано ранее:²⁴ на ЧМТ и фиктивных крысах до операции, через 48 ч после операции (рис. 2A) и на 28-й день после операции (рис. 2B).

4. Изучение доминантно-сабмиссивного поведения

1. Случайным образом разделите крыс на клетки за 1 неделю до теста.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В каждой клетке должна содержаться одна фиктивная крыса и одна крыса с ЧМТ.
2. Выполняйте один 15-минутный сеанс каждый день в течение 2 дней перед тестированием, чтобы крысы могли акклиматизироваться к протоколу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Задача «доминант-сабмиссив» была начата на 29-й день после травмы (рис. 1).
3. Используйте аппарат (см. Таблицу материалов), изготовленный из двух прозрачных акриловых стеклянных коробок (30 см х 20 см х 20 см, коробка А и коробка Б, рис. 3), соединенных тонким туннелем 15 см х 15 см х 60 см ^15,19,25.
4. Наполните кормушку (рис. 3) подслащенным молоком и поместите ее в центр туннеля. Используйте молоко, состоящее из 10% сахара и 3% жирности.
5. Поставьте аппарат на стол высотой 80 см над полом.
6. Поместите каждую крысу в аппарат на 15 минут для привыкания в первые 2 дня. Приступайте к выполнению задания через 2 дня привыкания.
7. Случайным образом выберите одну крысу из контрольной группы и одну из группы черепно-мозговой травмы (ЧМТ) и установите их на равном расстоянии от кормушки, что позволит им исследовать их в течение 5 минут.
8. Обеспечьте крысам доступ к воде ad libitum.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Задание длилось 5 дней. Ограничение в еде выполнялось на весь период выполнения задания. Пищу давали каждый день в течение 1 ч после периода тестирования.
9. Очистите оборудование 5% спиртом перед проведением последующих тестов с другими крысами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чистка аппарата устранит запах предыдущих крыс. Проводите тест в помещении с правильной циркуляцией воздуха.

5. Запись видео и анализ данных

1. Установите камеру и установите рекомендуемое компьютерное программное обеспечение (см. Таблицу материалов) для сбора, сохранения и обработки данных.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Камеру необходимо устанавливать на высоте 290 см от пола.
2. Запишите видео, пока крысы находятся на арене.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Камера и аппарат были расположены на расстоянии 210 см друг от друга. Часть арены, где проводится тест, должна быть видна в кадре камеры.
3. Выполните анализ^{данных 23} вручную двумя аналитиками, слепыми к группам.

Результаты

Оценка неврологической степени тяжести
Неврологический дефицит оценивали у самцов крыс после ЧМТ с использованием НСС. Крысы были разделены на две группы: одну группу ЧМТ и одну контрольную группу. Контрольная группа была подвергнута фиктивной операции. NSS позволял оценить ...

Обсуждение

Клинические исследования показывают, что черепно-мозговая травма может увеличить риск психических расстройств^26,27. Более того, ЧМТ влияет на развитие социального поведения^28,29. В этом протоколе модель ЧМТ влияла на предста?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2% chlorhexidine in 70% alcohol solution	SIGMA - ALDRICH	500 cc	For general antisepsis of the skin in the operatory field
4 boards of different thicknesses (1.5 cm, 2.5 cm, 5 cm and 8.5 cm)	This is to evaluate neurological defect
4-0 Nylon suture	4-00
Bottles	Techniplast	ACBT0262SU
Bupivacaine 0.1 %
Diamond Hole Saw Drill 3 mm diameter	Glass Hole Saw Kit		Optional.
Digital Weighing Scale	SIGMA - ALDRICH	Rs 4,000
Dissecting scissors	SIGMA - ALDRICH	Z265969
Ethanol 99.9 %	Pharmacy		5%-10% solution used to clean equipment and remove odors
Fluid-percussion device	custom-made at the university workshop		No specific brand is recommended.
Gauze Sponges	Fisher
Gloves (thin laboratory gloves)			Optional.
Heater with thermometer	Heatingpad-1	Model: HEATINGPAD-1/2	No specific brand is recommended.
Horizon-XL	Mennen Medical Ltd
Isofluran, USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc	NDC 66794-017	Anesthetic liquid for inhalation
Logitech Webcam Software	Logitech	2.51	Software for video camera
Operating forceps	SIGMA - ALDRICH
Operating Scissors	SIGMA - ALDRICH
PC Computer for USV recording and data analyses	Intel		Intel core i5-6500 CPU @ 3.2GHz, 16 GB RAM, 64-bit operating system
Plexiglass boxes linked by a narrow passage			Two transparent 30 cm × 20 cm × 20 cm plexiglass boxes linked by a narrow 15 cm × 15 cm × 60 cm passage
Purina Chow	Purina	5001	Rodent laboratory chow given to rats,  is a lifecycle nutrition that has been used in biomedical research
Rat cages (rat home cage or another enclosure)	Techniplast	2000P	No specific brand is recommended
Scalpel blades 11	SIGMA - ALDRICH	S2771
SPSS	SPSS Inc., Chicago, IL, USA	A 20 package
Stereotaxic Instrument	custom-made at the university workshop		No specific brand is recommended
Timing device	Interval Timer:Timing for recording USV's		Optional. Any timer will do, although it is convenient to use an interval timer if you are tickling multiple rats
Video camera	Logitech	C920 HD PRO WEBCAM	Digital video camera for high definition recording of rat behavior under dominant submissive test