외상성 뇌 손상 후 성인 쥐의 우성 복종 행동 평가

요약

현재 프로토콜은 수액 타악기로 인한 외상성 뇌 손상의 쥐 모델을 설명하고 지배적이고 복종적인 행동의 발달을 이해하기 위한 일련의 행동 테스트를 설명합니다. 이 외상성 뇌 손상 모델을 특정 행동 테스트와 함께 사용하면 뇌 손상 후 사회적 장애를 연구 할 수 있습니다.

초록

음식, 영토 및 동료와 같은 자원에 대한 경쟁은 동물 종 내의 관계에 상당한 영향을 미치며 종종 지배적 인 복종 관계를 기반으로하는 사회적 계층을 통해 매개됩니다. 지배적-복종적 관계는 종의 개체 사이의 정상적인 행동 패턴입니다. 외상성 뇌 손상은 사회적 상호 작용 장애와 동물 쌍의 지배적-복종 관계의 재구성의 빈번한 원인입니다. 이 프로토콜은 유도 후 29일에서 33일 사이에 수행된 일련의 우성-복종 테스트를 통해 순진한 쥐와 비교하여 유체 타악기 모델을 사용하여 외상성 뇌 손상을 유도한 후 성인 수컷 Sprague-Dawley 쥐의 복종 행동을 설명합니다. 우성 복종 행동 테스트는 뇌 손상이 음식을 놓고 경쟁하는 동물에서 복종 행동을 유도 할 수있는 방법을 보여줍니다. 외상성 뇌 손상 후, 설치류는 피더에서 더 적은 시간을 보내고 대조군 동물에 비해 물마루에 먼저 도착할 가능성이 적다는 점에서 알 수 있듯이 더 복종적이었습니다. 이 프로토콜에 따르면, 성인 수컷 쥐의 외상성 뇌 손상 후에 복종적인 행동이 발생합니다.

서문

종내 경쟁은 같은 종의 구성원이 동시에 제한된 자원을 놓고 경쟁할 때 발생합니다¹. 대조적으로, 종간 경쟁은 서로 다른 두 종의 구성원 사이에서 발생한다². 종내 경쟁은 간섭(적응)과 착취(경쟁)의 두 가지 유형으로 나뉘며, 식량과 영토³와 같은 경합 자원의 유형에 따라 발생한다.

사회적 위계의 존재는 지배적-복종적 관계(DSR) 없이는 불가능합니다. 지배는 한 쌍의 동물 내에서 "승리"로, 종속은 "패배"로 나타난다⁴. 그러나 DSR은 쌍으로 나타날 뿐만 아니라 3개 이상의 그룹으로도 나타납니다. 1922 년 Thorleif Schjelderup-Ebbe는 국내 닭의 우성 계층을 설명했습니다. 지배적 인 동물과 종속 동물 사이의 주요 구별 징후는 피더에서 보낸 시간과 공격적인 행동이었습니다. 지배 계층은 선형과 비선형의 두 가지 형태로 나뉩니다⁵. 선형 우세는 A와 B의 두 그룹을 포함합니다. 이러한 전이적 관계⁶의 패러다임에서, 그룹 A가 그룹 B를 지배하거나, 그룹 B가 그룹 A를 지배한다. 비선형 우세는 적어도 하나의 순환 관계가 있을 때 발생한다: A는 B를 지배하고, B는 C를 지배하고, C는 A를 지배한다⁷.

우성 복종 행동을 평가하기 위한 모델은 설치류, 조류⁸, 비인간 영장류 9,10,11, 인간 ¹² 등 다양한 종에 존재한다. 우성-복종법은 문헌에 잘 나타나 있으며, 조증과 우울증¹³, 항우울제 활성을 평가하는 모델로 적용되고 있다¹⁴. 이 모델은 성인 쥐의 모성 분리 후 초기 생애 스트레스를 조사하는 데 사용되었다¹⁵. DSR 패러다임은 세 가지 모델로 나눌 수 있습니다: 우성 행동 모델의 감소(^13,16), 복종적 행동의 감소(¹⁴), 클로니딘-우성 모델의 반전(¹⁷).

본 연구는 식량 경쟁을 기반으로 한 과제를 통해 DSR에 대한 조사를 보여줍니다. 이 방법의 장점은 재현성이 쉽고 지배적 복종 행동을 관찰하고 정확하게 분석 할 수 있다는 것입니다. 또한 지배적 인 복종 행동 과제는 비교 가능한 행동 과제와 달리 영토보다는 음식에 의존하기 때문에이 행동 과제는 비용이 적게 들고 간단 해지며 연구자는 과제를 수행하고 데이터를 처리하기 위해 복잡한 훈련을받을 필요가 없습니다.

현재 연구의 전반적인 목표는 외상성 뇌 손상(TBI) 후 DSR의 발달을 입증하는 것입니다. TBI는 사회적 장애, 우울증 및 불안과 관련이 있습니다. TBI를 유도하는 모델은 유체 타악기로 외상성 뇌손상을 유도하는 것을 포함하는 간단하고 효과적인 표준 모델이다^(18,19).

프로토콜

실험은 Negev의 Ben-Gurion 대학의 동물 관리위원회에 의해 승인되었으며, 실험은 헬싱키와 도쿄 선언 및 유럽 공동체의 실험실 동물 관리 및 사용 지침의 권고에 따라 수행되었습니다. 체중 300-350g의 성인 수컷 Sprague-Dawley 쥐를 본 연구에 사용했습니다. 동물들은 22°C ± 1°C의 실온 및 40%-60%의 습도에서 명암 주기로 사육되었다.

1. 동물 준비

1. 무작위로 30 마리의 성인 수컷 쥐를 선택하고 TBI와 가짜의 두 그룹으로 나눕니다.
2. 차우( 재료 표 참조)와 물을 임의로 제공하십시오.
   알림: 하루 중 시간이 행동 수행에 미치는 영향을 제어하기 위해 테스트의 모든 단계를 동시에 수행하십시오. 일반적인 활동으로 인한 방해를 피하기 위해 아침(오전 6:00에서 오후 12:00 사이)에 행동 테스트를 수행하는 것이 가장 좋습니다.
3. 3단계 및 표 1에 자세히 설명된 바와 같이 두 그룹의 쥐에서 손상 전 신경학적 중증도 점수의 기준선 평가를 수행합니다.
4. 쥐를 4 % (유도 용) 및 1.5 % (유지 용) 이소 플루 란으로 마취하십시오. 부프레노르핀 주사(0.05-0.1 mg/kg; SC)를 선제적 진통에 사용할 수 있다.
5. 각성제에 대한 반응으로 움직임이나 페달 반사가 부족한지 테스트하여 쥐의 고정을 확인하십시오.
   참고: 마취 투여를 위해서는 이소플루란을 지속적으로 사용하는 것이 좋습니다.

2. 수술 절차

알림: 모든 절차는 무균 상태에서 수행해야 합니다. 멸균 장갑을 사용하십시오. 멸균되지 않은 표면을 만진 경우 장갑을 교체하십시오. 건조를 방지하기 위해 양쪽 눈에 안과용 윤활제를 바릅니다. parasagittal 유체 타악기 손상은 이전에 발표 된 보고서^18,20에 따라 수행되었습니다.

1. 0.5% 부피바카인으로 두피에 침투하고( 재료 표 참조) 10mm 절개를 수행하고 조직을 측면으로 수축시킵니다.
2. 개두술^18,20 4 mm 후방 및 4 mm 측면 브레그마를 수행하십시오.
   알림: 수술 부위는 요오드 기반 또는 클로르헥시딘 기반 스크럽과 알코올로 원을 그리며 여러 번 소독해야 합니다.
3. 3방향 스톱콕을 통해 18,19-21ms에 걸쳐 유체 타악기(재료 표 참조)로 TBI²³를 유도합니다.
   알림: 2.5기압의 진도로 적당한 TBI를 수행합니다.
4. 가짜 수술 쥐 그룹에 대해 개두술을 수행합니다(그림 1). 가짜 운영 그룹에 대해 TBI를 유도하지 마십시오.
5. 상처를 봉합하기 전에 0.1% 부피바카인 침윤을 시행합니다. 이소플루란을 철회하기 전에 수술 후 진통제로 부프레노르핀(0.01-0.05 mg/kg)을 근육주사합니다.
   참고: 최소 48시간 동안 12시간마다 부프레노르핀 복용량을 반복하십시오.
6. 쥐를 회복실로 옮기고 24시간 동안 호흡기(예: 호흡 정지), 신경학적(예: 마비) 및 심혈관 상태(예: 동공 색의 변화, 연조직 관류 감소 및 서맥)를 모니터링합니다.

3. 신경학적 중증도 점수 평가

참고: 행동 변화 및 운동 기능에 대한 최고 점수는 24점입니다. 0점은 온전한 신경학적 상태를 나타내고 24점은 심각한 신경학적 기능 장애를 나타냅니다(^21,22,23).

1. 수술 전 TBI 및 가짜 쥐, 수술 후 48시간(그림 2A) 및 수술 후²⁸ 일(그림 2B)에 대해 이전에 설명한 대로 신경학적 중증도 점수(NSS)를 평가합니다.

4. 지배적-복종적 행동 연구

1. 시험 1 주일 전에 쥐를 무작위로 새장으로 나눕니다.
   알림: 각 케이지에는 가짜 쥐 1마리와 TBI 쥐 1마리가 있어야 합니다.
2. 쥐가 프로토콜에 적응할 수 있도록 테스트하기 전에 2일 동안 매일 15분 세션을 수행합니다.
   참고: 우성-복종 작업은 부상 후 29일째에 시작되었습니다(그림 1).
3. 두 개의 투명 아크릴 유리 상자(30cm x 20cm x 20cm, 상자 A 및 상자 B, 그림 3)로 만든 장치(재료 표 참조)를 15cm x 15cm x 60cm 터널^15,19,25로 연결합니다.
4. 피더(그림 3)에 가당 우유를 채우고 터널 중앙에 놓습니다. 설탕 10 %와 지방 3 %로 구성된 우유를 사용하십시오.
5. 바닥에서 높이 80cm의 테이블 위에 장치를 놓습니다.
6. 처음 2 일 동안 습관화를 위해 각 쥐를 15 분 동안 장치에 넣으십시오. 2 일 습관화 후에 작업을 시작하십시오.
7. 대조군에서 쥐 한 마리와 외상성 뇌 손상(TBI) 그룹에서 쥐 한 마리를 무작위로 선택하고 피더에서 같은 거리에 설정하여 5분 동안 탐색할 수 있도록 합니다.
8. 쥐가 임의로 물에 접근할 수 있도록 합니다.
   참고: 작업은 5일 동안 지속되었습니다. 전체 작업 기간 동안 음식 제한이 수행되었습니다. 시험기간 후 1시간 동안 매일 음식을 제공하였다.
9. 다른 쥐와 후속 테스트를 수행하기 전에 5% 알코올로 장비를 청소하십시오.
   알림: 장치를 청소하면 이전 쥐의 냄새가 제거됩니다. 공기 순환이 적절한 실내에서 테스트를 수행하십시오.

5. 비디오 및 데이터 분석 녹화

1. 카메라를 배치하고 권장 컴퓨터 소프트웨어( 재료 표 참조)를 설치하여 데이터를 캡처, 저장 및 처리합니다.
   참고: 카메라는 바닥에서 290cm 높이에 설치해야 합니다.
2. 쥐가 경기장에 있는 동안 비디오를 녹화합니다.
   참고: 카메라와 장치는 210cm 떨어져 있었습니다. 테스트가 수행되는 경기장 부분이 카메라 프레임에 표시되어야 합니다.
3. 그룹에 대해 눈이 먼 두 명의 분석가가 수동으로 데이터 분석(²³ )을 수행합니다.

결과

신경학적 중증도 점수 평가
NSS를 사용하여 TBI 후 수컷 쥐에서 신경학적 결손을 평가했습니다. 래트를 두 그룹으로 나누었다: TBI 그룹 1개와 대조군 1개. 대조군은 가짜 수술을 받았다. NSS는 포인트 시스템^22,23에 의한 운동 기능 및 행동 변화의 평가를 허용했습니다. 24점은 심각한 신경학적 기능 장애를 나타내고 0점은 온전한 신경학적 상?...

토론

임상 연구에 따르면 뇌 손상은 정신 질환의 위험을 증가시킬 수 있습니다^26,27. 또한, TBI는 사회적 행동의 발달에 영향을 미친다^28,29. 이 프로토콜에서 TBI 모델은 지배적-복종적 행동의 표현에 영향을 미쳤습니다. 지배적 인 복종적인 행동은 피더에 소요 된 시간과 피더에 처음 온 사람의 관점에서 나타납니다.<...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2% chlorhexidine in 70% alcohol solution	SIGMA - ALDRICH	500 cc	For general antisepsis of the skin in the operatory field
4 boards of different thicknesses (1.5 cm, 2.5 cm, 5 cm and 8.5 cm)	This is to evaluate neurological defect
4-0 Nylon suture	4-00
Bottles	Techniplast	ACBT0262SU
Bupivacaine 0.1 %
Diamond Hole Saw Drill 3 mm diameter	Glass Hole Saw Kit		Optional.
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Fluid-percussion device	custom-made at the university workshop		No specific brand is recommended.
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Gloves (thin laboratory gloves)			Optional.
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Scalpel blades 11	SIGMA - ALDRICH	S2771
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