Investigando interações entre enzimas modificadoras de histonas e fatores de transcrição in vivo por transferência de energia de ressonância de fluorescência

Resumo

A transferência de energia por ressonância de fluorescência (FRET) é uma técnica de imagem para detectar interações proteicas em células vivas. Aqui, um protocolo FRET é apresentado para estudar a associação de enzimas modificadoras de histona com fatores de transcrição que as recrutam para os promotores alvo da regulação epigenética da expressão gênica em tecidos vegetais.

Resumo

A regulação epigenética da expressão gênica é comumente afetada por enzimas modificadoras de histonas (HMEs) que geram marcas de histonas heterocromáticas ou eucromáticas para repressão ou ativação transcricional, respectivamente. HMEs são recrutados para sua cromatina alvo por fatores de transcrição (TFs). Assim, detectar e caracterizar interações diretas entre HMEs e TFs são fundamentais para melhor compreensão de sua função e especificidade. Esses estudos seriam mais biologicamente relevantes se realizados in vivo dentro de tecidos vivos. Aqui, um protocolo é descrito para visualizar interações em folhas de plantas entre uma histona desubiquitinase vegetal e um fator de transcrição de plantas usando transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET), que permite a detecção de complexos entre moléculas de proteína que estão dentro de <10 nm uma da outra. Duas variações da técnica de FRET são apresentadas: SE-FRET (emissão sensibilizada) e AB-FRET (clareamento aceptor), em que a energia é transferida não radiativamente do doador para o aceitador ou emitida radiativamente pelo doador após o fotobranqueamento do aceitador. Ambas as abordagens SE-FRET e AB-FRET podem ser adaptadas facilmente para descobrir outras interações entre outras proteínas na planta.

Introdução

As histonas desubiquitinases vegetais desempenham um papel importante no controle da expressão gênica pela modificação pós-translacional das histonas, especificamente apagando suas marcas de monoubiquitilação¹. Até o momento, a OTLD1 é uma das poucas histonas desubiquitinases vegetais caracterizadas em nível molecular em Arabidopsis ^2,3. O OTLD1 remove os grupos monoubiquitina das moléculas de histona H2B, promovendo assim a remoção ou adição de acetilação eucromática e modificações de metilação das histonas H3 no gene alvo da cromatina ^4,5. Além disso, o OTLD1 interage com outra enzima modificadora da cromatina, a histona lisina desmetilase KDM1C, para afetar a supressão transcricional dos genes-alvo ^6,7.

A maioria das enzimas modificadoras da histona não possui capacidades de ligação ao DNA e, portanto, não pode reconhecer seus genes-alvo diretamente. Uma possibilidade é que eles cooperem com proteínas do fator de transcrição de ligação ao DNA que se ligam a essas enzimas e as direcionam para seus alvos de cromatina. Especificamente, em plantas, várias enzimas modificadoras importantes da histona (isto é, histona metiltransferases ^8,9, histonas acetiltransferases 10, histonas desmetilases 11 e complexos repressivos Polycomb^12,13,14) são conhecidas por serem recrutadas por fatores de transcrição. Consistente com essa ideia, recentemente, foi proposto um possível mecanismo de recrutamento de OTLD1 para os promotores-alvo, que se baseia em interações proteína-proteína específicas de OTLD1 com um fator de transcrição LSH10¹⁵.

O LSH10 pertence a uma família de proteínas vegetais ALOG (Arabidopsis LSH1 e Oryza G1) que funcionam como reguladores centrais do desenvolvimento 16,17,18,19,20,21,22. O fato de os membros da família de proteínas ALOG conterem motivos de ligação ao DNA²³ e exibirem as capacidades de regulação transcricional 22, localização nuclear¹⁹ e homodimerização²⁴ dá mais suporte à noção de que essas proteínas, incluindo o LSH10, podem atuar como fatores de transcrição específicos durante a regulação epigenética da transcrição. Uma das principais técnicas experimentais utilizadas para caracterizar a interação LSH10-OTLD1 in vivo é a transferência de energia por ressonância de fluorescência (FRET)¹⁵.

FRET é uma técnica de imagem para detectar diretamente interações de curto alcance entre proteínas dentro de <10 nm umas das outras²⁵ dentro de células vivas. Existem duas variações principais da abordagem FRET²⁶: emissão sensibilizada (SE-FRET) (Figura 1A) e clareamento aceptor (AB-FRET) (Figura 1B). No SE-FRET, as proteínas que interagem - uma das quais é marcada com um fluorocromo do doador (por exemplo, proteína fluorescente verde, GFP) e a outra com um fluorocromo aceptor (por exemplo, proteína fluorescente vermelha monomérica, mRFP^27,28) - transferem sem radiatividade a energia do estado excitado do doador para o aceitador. Como nenhum fóton é emitido durante essa transferência, é produzido um sinal fluorescente que tem um espectro de emissão radiativa semelhante ao do aceitador. No AB-FRET, as interações proteicas são detectadas e quantificadas com base na elevada emissão radiativa do doador quando o aceptor é permanentemente inativado pelo fotobranqueamento e, portanto, é incapaz de receber a energia não radiativa transferida do doador (Figura 1). É importante ressaltar que a localização subcelular da fluorescência FRET é indicativa da localização das proteínas que interagem na célula.

A capacidade de implantar FRET em tecidos vivos e determinar a localização subcelular das proteínas que interagem simultaneamente com a detecção dessa interação per se, torna FRET a técnica de escolha para estudos e caracterização inicial das interações proteína-proteína in vivo. Uma metodologia de imagem de fluorescência in vivo comparável, a complementação por fluorescência bimolecular (BiFC)29,30,31,32, é uma boa abordagem alternativa, embora, ao contrário do FRET, o BiFC possa produzir falsos positivos devido à montagem espontânea dos repórteres autofluorescentes do BiFC ^33, e a quantificação de seus dados seja menos precisa.

Este artigo compartilha a experiência bem-sucedida na implementação das técnicas SE-FRET e AB-FRET e apresenta um protocolo para sua implantação para investigar as interações entre OTLD1 e LSH10 em células vegetais.

Protocolo

Nicotiana benthamiana, Agrobacterium tumefaciens cepa EHA105 ou GV3101 foram utilizadas para o presente estudo.

1. Construção do vetor FRET

1. Selecione etiquetas fluorescentes para o par FRET doador/aceitador.
   1. Use EGFP de pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1^15,28 (ver Tabela de Materiais) para gerar o vetor doador.
   2. Use mRFP de pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 (consulte Tabela de Materiais) para gerar o vetor aceitador.
2. Gerar as construções FRET doador/aceitador usando uma técnica de clonagem de recombinação específica do local³⁴, como o sistema de clonagem de recombinação Gateway³⁵.
   1. Amplificar as sequências codificadoras das proteínas de interesse³⁶ (i.e., as Arabidopsis OTLD1 e LSH10)¹⁵.
      NOTA: Também é uma boa ideia utilizar um controle negativo que represente um homólogo de uma das proteínas que interagem, mas não se espera que exiba interação; o estudo de interação OTLD1-LSH10 emprega um homólogo de LSH10, LSH4, que não reconhece OTLD1. Os cDNAs OTLD1, LSH10 e LSH4 são amplificados por PCR usando primers listados na Tabela 1.
   2. Clone OTLD1, LSH10 e LSH4 no vetor de entrada pDONR207 pela técnica de clonagem de recombinação site-specific³⁴.
   3. Use o Gateway LR Clonase II (consulte Tabela de Materiais) para transferir LSH10 e LSH4 de pDONR207 para o vetor de destino binário pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 para gerar as construções de doador binário p35S::LSH10-GFP (construção testada) e p35S::LSH4-GFP (controle negativo).
   4. Use a mesma enzima comercialmente disponível (etapa 1.2.3) para transferir OTLD1 de pDONR207 para o vetor de destino binário pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 para gerar a construção do aceitador binário p35S:: OTLD1-mRFP (construção testada).
   5. PCR-amplificar³⁶ mRFP de pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 usando primers listados na Tabela 1, cloná-lo pela técnica de clonagem de recombinação em pDONR207 e, em seguida, usar LR Clonase II para transferir mRFP para pPZP RCS2A-DEST-EGFP-N1 para gerar a construção de fusão binária p35S::mRFP-GFP (controle positivo).
3. Realizar a transformação dos edifícios doador e aceitador em Agrobactéria.
   1. Adicionar 1 μg de cada plasmídeo das etapas 1.2.3-1.2.5 a 100 μL da cultura de células competentes da estirpe EHA105 ou GV3101 de Agrobacterium tumefaciens , preparadas utilizando os protocolos padrão 37 ou obtidas comercialmente, e incubar a³⁷ °C durante 5 min.
   2. Adicione 1 mL de meio LB (triptona a 1%, extrato de levedura a 0,5% e NaCl a 1%; ver Tabela de Materiais) à mistura celular competente e agite a 200 rpm e 28°C por 1,5 h. Recolher as células por centrifugação a 3.000 × g durante 1 min à temperatura ambiente.
   3. Ressuspender as células em 0,1 mL de meio LB pipetando e espalhá-las em ágar LB suplementado com os antibióticos apropriados (por exemplo, espectinomicina a 0,01% e rifampicina a 0,005%; ver Tabela de Materiais). Crescer a 28 °C durante 2 dias.
   4. Escolha colônias individuais e inocular cada uma delas separadamente em 1 mL de caldo LB suplementado com os antibióticos apropriados.
   5. Cultivar as células a 28 °C durante 24 h e transferir 0,2 ml da cultura para um novo tubo. Recolher as células por centrifugação a 10.000 × g durante 30 s à temperatura ambiente.
   6. Extrair o DNA plasmídico por um protocolo padrão para isolar plasmídeos de células Agrobacterium 38 e ressuspender o DNA extraído em³⁰ μL de água. Para identificar as colônias que abrigam os plasmídeos desejados, utilizar 2 μL da preparação de DNA como molde para PCR com primers gene-específicos listados na Tabela 1. Misture 0,7 mL da cultura identificada com 0,3 mL de glicerol e armazene a -80 °C.

2. Agroinfiltração

1. Cultive plantas de Nicotiana benthamiana .
   NOTA: Ao longo de todo o experimento, todas as plantas devem estar saudáveis.
   1. Semeie e cultive sementes de N. benthamiana em um vaso contendo solo úmido em alta densidade.
   2. Manter as sementes plantadas em câmara de crescimento fixada a 23 °C com 16 h de ciclo claro e 8 h de ciclo escuro com intensidade luminosa de 150-170 μmol/m²s até que o diâmetro do eufilo atinja 0,5 cm.
   3. Transfira as mudas para vasos maiores e deixe-as crescer na mesma câmara com os mesmos parâmetros.
      NOTA: As plantas estão prontas para a agroinfiltração quando suas folhas maiores têm 5-7 cm de diâmetro, geralmente dentro de 4-5 semanas. Em plantas menores que são muito jovens, os efeitos da agroinfiltração serão muito graves para a análise FET.
2. Preparar células bacterianas para agroinfiltração.
   1. Cultivar cada colónia de Agrobacterium contendo os construtos de FRET durante a noite em 5 ml de meio LB suplementado com os antibióticos apropriados (passo 1.3.3) e acetosiringona de 150 μM a 28 °C (ver Tabela de Materiais).
   2. Centrifugar as células a 3.000 × g durante 5 min à temperatura ambiente.
   3. Ressuspender as células em tampão de agroinfiltração (10 mM MgCl₂, 10 mM MES pH 5,6, 150 μM de acetosiringona) para OD₆₀₀ = 0,5.
   4. Combinar as células ressuspensas numa relação de 1:1 v/v entre as células que ostentem as construções apropriadas (passo 2.2.5).
   5. Para as agroinfiltrações de dupla construção, misture as alíquotas de duas culturas e, para as agroinfiltrações de construção única, misture as alíquotas da mesma cultura:
      1. Proteínas testadas: OTLD1-mRFP + LSH10-GFP (bactérias que abrigam as construções p35S::OTLD1-mRFP e p35S::LSH10-GFP).
      2. Controle negativo: OTLD1-mRFP + LSH4-GFP (bactérias que abrigam as construções p35S::OTLD1-mRFP e p35S::LSH4-GFP).
      3. Controle negativo: LSH10-GFP + mRFP livre (bactérias que abrigam as construções p35S::LSH10-GFP e pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1).
      4. Controle positivo: mRFP-GFP (bactérias que abrigam a construção p35S::mRFP-GFP).
   6. Incubar as células a 28 °C durante 0,5-1 h.
3. Realizar agroinfiltração.
   1. Carregue a cultura bacteriana em uma seringa sem agulha de 1 mL.
   2. Pressione suavemente, mas com firmeza, o bocal da seringa contra o lado abaxial das folhas de N. benthamiana totalmente expandidas, segurando a folha com um dedo enluvado no lado adaxial.
   3. Infiltre até quatro pontos em uma folha, três folhas por planta, duas ou três plantas para cada cultura bacteriana. Troque as luvas entre as amostras para evitar a contaminação cruzada.
   4. Manter as plantas agroinfiltradas na mesma câmara de crescimento nas mesmas condições, conforme descrito na etapa 2.1.2, por 24 h a 36 h. Não mantenha as plantas agroinfiltradas por mais de 36 h, pois isso reduzirá o sinal de fluorescência.

3. Microscopia confocal

1. Prepare lâminas de microscópio para visualização por fluorescência.
   1. Após 24-36 h da infiltração, use uma lâmina de barbear para cortar cada folha agroinfiltrada em pequenos pedaços (2 mm x 4 mm) entre as veias.
   2. Coloque as peças foliares em uma lâmina de vidro com a superfície da folha abaxial voltada para cima. Coloque uma gota de água sobre os pedaços de folhas e cubra-os com o vidro da tampa. Bata levemente no vidro da tampa para remover as bolhas de ar.
   3. Ligue o microscópio e o laser (consulte Tabela de materiais). Colocar a lâmina no suporte do palco do microscópio para obtenção de imagens de acordo com os parâmetros FRET específicos (passos 3.2 e 3.3).
   4. Comece as observações usando uma lente objetiva de 10x para identificar células que exibem os sinais GFP e mRFP e, em seguida, use uma lente objetiva de 40x para observações detalhadas subsequentes.
      NOTA: É importante ressaltar que o SE-FRET e o AB-FRET geralmente são realizados na mesma amostra de tecido, permitindo o uso das mesmas configurações de canal (etapa 3.2), exceto para o canal FET, que é ativado/desativado para as observações SE-FRET e AB-FRE, respectivamente (etapas 3.2.2.3 e 3.3.1).
2. Configure os parâmetros para SE-FRET (Figura 1A).
   1. Abra a ferramenta MDA (Multi-Dimensional Acquisition).
   2. Estabeleça um conjunto de três canais confocais no mesmo campo de visão (Figura 1 Suplementar).
      1. Ajuste o canal doador (o canal GFP) para excitação e emissão do fluorocromo doador com o laser de excitação de 405 nm e o filtro de emissão de 400-597 nm.
      2. Ajuste o canal aceptor (o canal mRFP) para excitação e emissão do fluorocromo aceptor com o laser de excitação de 561 nm e o filtro de emissão de 400-597 nm.
         NOTA: O filtro de emissão para mRFP foi ajustado em 400-597 nm para separar o sinal mRFP do sinal FRET em 597-617 nm (etapa 3.2.2.3) e, portanto, reduzir a emissão de mRFP independente de FRET.
      3. Ajuste o canal FRET para excitação do doador e emissão dos fluorocromos aceptores com o laser de excitação de 405 nm e o filtro de emissão de 597-617 nm.
   3. Defina a intensidade de excitação do doador em um nível mínimo para observar o FET, evitando o fotobranqueamento, reduzindo a eficiência do SE-FET.
      NOTA: Esta intensidade de excitação é selecionada experimentalmente antes da realização do procedimento FRET para evitar o fotobranqueamento. Varia dependendo da espessura da folha, idade e tempo após a superexpressão.
   4. Excite o doador e procure células que contenham o sinal de fluorescência esperado do aceitador.
   5. Selecione a região que contém o sinal de fluorescência de interesse.
   6. Adquira uma sequência de imagens SE-FRET pressionando o botão Snap .
      1. Imagem 10-15 células expressando o construto mRFP-GFP (controle positivo) primeiro; ajustar os parâmetros de foco, zoom e ganho inteligente para se concentrar na área de interesse a ser capturada (Figura 2 Suplementar).
      2. Usando as mesmas configurações, imagem de 10-15 células, cada uma expressando OTLD1-mRFP, mRFP livre, LSH10-GFP ou LSH4-GFP separadamente.
         NOTA: Essas imagens são adquiridas pelo plug-in "PixFRET" do ImageJ (ver Tabela de Materiais), que foi utilizado para a análise dos dados FRET (etapa 3.4.1) para determinar os valores de sangramento espectral (SBT) para os aceitadores e os doadores; essas imagens são usadas pelo software para gerar as imagens SE-FRET para os pares de proteínas OTLD1-mRFP + LSH10-GFP, OTLD1-mRFP + LSH4-GFP e LSH10-GFP + mRFP livre (etapa 3.2.6.3).
      3. Além disso, usando as mesmas configurações, imagem 10-15 células co-expressando OTLD1-mRFP + LSH10-GFP, OTLD1-mRFP + LSH4-GFP e LSH10-GFP + pares de proteínas mRFP livres.
3. Configure parâmetros para AB-FRET (Figura 1B).
   1. Utilize os parâmetros do canal doador e do receptor definidos para SE-FRET (etapa 3.2.2), mas desligue o canal FRE.
   2. Defina os parâmetros para o fotobranqueamento do aceitador (mRFP) (Figura 3 Suplementar).
      1. Certifique-se de que o branqueamento comece após cinco imagens. Permita 200 iterações para cada alvejante da área. Mantenha 100% da intensidade do laser a 561 nm.
      2. Manter uma duração de branqueamento de 45 s. Garanta uma velocidade de digitalização de 512 x 512 pixels a 400 Hz.
   3. Desenhe a região da célula a ser branqueada; por exemplo, para interações nucleares, regiões de interesse são desenhadas em torno de toda a área do núcleo celular³⁹.
   4. Ative o branqueamento pressionando o botão Iniciar experimento ; ativando esta função irá realizar o fotobranqueamento e adquirir a sequência de imagens AB-FET.
4. Analise os dados FET.
   1. Para analisar os dados do SE-FET, use o plug-in "PixFRET" para o software ImageJ para gerar imagens corrigidas da eficiência do SE-FRET após a subtração do SBT⁴⁰ (etapa 3.2.6.2).
   2. Para analisar os dados AB-FRET, calcule %AB-FRET como o aumento percentual na emissão de GFP após o fotobranqueamento mRFP usando a seguinte fórmula⁴¹: %AB-FRET = [(GFPpost - GFPpre) / GFPpre] x 100, onde GFPpost é a emissão de GFP após o fotobranqueamento mRFP e GFPpre é a emissão GFP antes do fotobranqueamento mRFP.
   3. Ao revisar as imagens FET, preste atenção à localização subcelular do sinal FET.
      NOTA: Em muitos casos, esses compartimentos celulares (por exemplo, núcleo, cloroplastos, RE, etc.) podem ser facilmente identificados e, como um benefício adicional da técnica FET, fornecem pistas importantes para a função biológica das proteínas que interagem.

Resultados

A Figura 2 ilustra os resultados típicos de um experimento SE-FET, no qual os núcleos celulares foram registrados simultaneamente em três canais (ou seja, GFP doador, mRFP aceitador e SE-FRET). Esses dados foram utilizados para gerar imagens de eficiência SE-FRET codificadas em uma escala de pseudo-cores. Nesta escala, a transição do azul para o vermelho corresponde a um aumento na eficiência do FET, uma medida da proximidade proteína-proteína de 0% a 100%. Neste experimento represe...

Discussão

Este protocolo FRET é simples e fácil de reproduzir; também requer um investimento mínimo de fornecimento e utiliza equipamentos padrão para muitos laboratórios modernos. Especificamente, cinco características técnicas principais distinguem a versatilidade deste procedimento. Primeiro, as construções FRET são geradas usando recombinação site-specific, uma abordagem de clonagem que é fácil de usar, produz resultados precisos e economiza tempo em comparação com a clonagem tradicional baseada em enzimas de ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetosyringone (3′,5′-Dimethoxy-4′-hydroxyacetophenone)	Sigma-Aldrich	#D134406-1G
Bacto Agar	BD Biosciences	#214010
Bacto trypton	BD Biosciences	#211705
Bacto yeast extract	BD Biosciences	#212750
Confocal laser scanning microscope (CLSM)	Zeiss	LSM900	Any CLSM with similar capabilities is suitable
EHA105	VWR	104013-310	We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
Gateway BP Clonase II	Invitrogen	#11789100
Gateway LR Clonase II	Invitrogen	#11791020
GV3101	VWR	104013-296	We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
ImageJ			https://imagej.nih.gov/ij/download.html
MES	Sigma-Aldrich	#69889-10G
MgCl2	Sigma-Aldrich	#63068-250G
NaCl	Sigma-Aldrich	#S5886-500G
Nicotiana benthamiana seeds	Herbalistics Pty	RA4 or LAB	We use the stock in the Citovsky seed lab stock collection
pDONR207	Invitrogen	#12213013
pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1	N/A		Refs. 15, 28
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1	N/A		Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-C1 construct (see refs. 15, 28)
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1	N/A		Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 construct
Rifampicin	Sigma-Aldrich	#R7382-5G
Spectinomycin	Sigma-Aldrich	#S4014-5G
Syringes without needles	BD	309659
Zen software for CLSM imaging	Zeiss	ZEN 3.0 version	The software should be compatible with the CLSM used