JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) - это метод визуализации для обнаружения белковых взаимодействий в живых клетках. Здесь представлен протокол FRET для изучения связи гистон-модифицирующих ферментов с факторами транскрипции, которые рекрутируют их в целевые промоторы для эпигенетической регуляции экспрессии генов в тканях растений.

Аннотация

Эпигенетическая регуляция экспрессии генов обычно зависит от гистон-модифицирующих ферментов (HME), которые генерируют гетерохроматические или эухроматические гистоновые метки для транскрипционного подавления или активации соответственно. HME набираются к их целевому хроматину с помощью факторов транскрипции (TF). Таким образом, обнаружение и характеристика прямых взаимодействий между HME и TF имеют решающее значение для лучшего понимания их функции и специфичности. Эти исследования были бы более биологически значимыми, если бы выполнялись in vivo в живых тканях. Здесь описан протокол визуализации взаимодействий в листьях растений между растительной гистоновой деубиквитиназой и фактором транскрипции растений с использованием флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET), что позволяет обнаруживать комплексы между белковыми молекулами, находящимися в пределах <10 нм друг от друга. Представлены две вариации методики FRET: SE-FRET (сенсибилизированное излучение) и AB-FRET (акцепторное отбеливание), при котором энергия передается без излучения от донора к акцептору или излучается излучительно донором при фотоотбеливании акцептора. Подходы SE-FRET и AB-FRET могут быть легко адаптированы для обнаружения других взаимодействий между другими белками в растениях.

Введение

Деубиквитиназы растительного гистона играют важную роль в контроле экспрессии генов путем посттрансляционной модификации гистонов, в частности путем стирания их моноубиквитилирования1. До сих пор OTLD1 является одним из немногих растительных гистоновых деубиквитиназ, характеризующихся на молекулярном уровне в Arabidopsis 2,3. OTLD1 удаляет моноубиквитиновые группы из молекул гистонов H2B, тем самым способствуя удалению или добавлению эухроматического ацетилирования и метилирования модификаций гистонов H3 в гене-мишени хроматин 4,5. Кроме того, OTLD1 взаимодействует с другим хроматин-модифицирующим ферментом, гистон-лизиндеметилазой KDM1C, чтобы повлиять на транскрипционное подавление генов-мишеней 6,7.

Большинство гистон-модифицирующих ферментов не обладают способностями связывания ДНК и, следовательно, не могут распознавать свои гены-мишени напрямую. Одна из возможностей заключается в том, что они сотрудничают с ДНК-связывающими белками фактора транскрипции, которые связывают эти ферменты и направляют их к своим хроматиновым мишеням. В частности, в растениях несколько основных гистон-модифицирующих ферментов (т.е. гистонметилтрансферазы 8,9, гистоновые ацетилтрансферазы10, гистондеметилазы11 и поликомбные репрессивные комплексы 12,13,14), как известно, набираются факторами транскрипции. В соответствии с этой идеей недавно был предложен один возможный механизм рекрутирования OTLD1 к промоторам-мишеням, который основан на специфических белково-белковых взаимодействиях OTLD1 с фактором транскрипции LSH1015.

LSH10 принадлежит к семейству растительных белков ALOG (Arabidopsis LSH1 и Oryza G1), которые функционируют как центральные регуляторы развития 16,17,18,19,20,21,22. Тот факт, что члены семейства белков ALOG содержат мотивы связывания ДНК23 и демонстрируют способность к транскрипционной регуляции22, ядерной локализации19 и гомодимеризации24, дополнительно подтверждает представление о том, что эти белки, включая LSH10, могут действовать как специфические факторы транскрипции во время эпигенетической регуляции транскрипции. Одним из основных экспериментальных методов, используемых для характеристики взаимодействия LSH10-OTLD1 in vivo, является флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET)15.

FRET - это метод визуализации для непосредственного обнаружения близких взаимодействий между белками в пределах <10 нм друг от друга25 внутри живых клеток. Существует два основных варианта подхода26 FRET: сенсибилизированное излучение (SE-FRET) (рисунок 1A) и акцепторное отбеливание (AB-FRET) (рисунок 1B). В SE-FRET взаимодействующие белки, один из которых помечен донорским фторхромом (например, зеленым флуоресцентным белком, GFP), а другой акцепторным фторхромом (например, мономерным красным флуоресцентным белком, mRFP 27,28), нерадиятивно передают энергию возбужденного состояния от донора к акцептору. Поскольку во время этой передачи не испускаются фотоны, создается флуоресцентный сигнал, который имеет спектр радиационного излучения, аналогичный спектру акцептора. В AB-FRET белковые взаимодействия обнаруживаются и количественно оцениваются на основе повышенного радиационного излучения донора, когда акцептор постоянно инактивируется фотоотбеливанием и, таким образом, не может получать нерадиационную энергию, передаваемую от донора (рисунок 1). Важно отметить, что субклеточное расположение флуоресценции FRET свидетельствует о локализации взаимодействующих белков в клетке.

Способность развертывать FRET в живых тканях и определять субклеточную локализацию взаимодействующих белков одновременно с обнаружением этого взаимодействия как такового, делает FRET методом выбора для исследований и начальной характеристики белково-белковых взаимодействий in vivo. Сопоставимая методология флуоресцентной визуализации in vivo, бимолекулярная флуоресцентная комплементация (BiFC)29,30,31,32, является хорошим альтернативным подходом, хотя, в отличие от FRET, BiFC может производить ложные срабатывания из-за спонтанной сборки автофлуоресцентных репортеров BiFC33, и количественная оценка его данных менее точна.

В данной статье рассказывается об успешном опыте внедрения методов SE-FRET и AB-FRET и представлен протокол их развертывания для исследования взаимодействий между OTLD1 и LSH10 в растительных клетках.

протокол

Для настоящего исследования использовались штамм Nicotiana benthamiana, Agrobacterium tumefaciens EHA105 или GV3101.

1. Построение вектора FRET

  1. Выберите флуоресцентные метки для пары донор/акцептор FRET.
    1. Используйте EGFP из pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N115,28 (см. Таблицу материалов) для генерации донорского вектора.
    2. Используйте mRFP из pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 (см. Таблицу материалов) для генерации акцепторного вектора.
  2. Генерация конструкций ФРЕТ донора/акцептора с использованием метода рекомбинационного клонирования34 для конкретного участка, такого как система рекомбинационного клонирования35 Шлюза.
    1. Амплифицировать кодирующие последовательности интересующих белков36 (т.е. Arabidopsis OTLD1 и LSH10)15.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Также хорошей идеей является использование отрицательного элемента управления, который представляет собой гомолог одного из взаимодействующих белков, но не должен проявлять взаимодействие; в исследовании взаимодействия OTLD1-LSH10 используется гомолог LSH10, LSH4, который не распознает OTLD1. КДНК OTLD1, LSH10 и LSH4 амплифицируются методом ПЦР с помощью праймеров, перечисленных в таблице 1.
    2. Клонирование OTLD1, LSH10 и LSH4 в вектор входа pDONR207 методомрекомбинации 34.
    3. Используйте Шлюз LR Clonase II (см. Таблицу материалов) для переноса LSH10 и LSH4 из pDONR207 в двоичный вектор назначения pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 для генерации бинарных конструкций донора p35S::LSH10-GFP (протестированная конструкция) и p35S::LSH4-GFP (отрицательный контроль).
    4. Используйте тот же коммерчески доступный фермент (шаг 1.2.3) для переноса OTLD1 из pDONR207 в двоичный вектор назначения pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 для генерации двоичной акцепторной конструкции p35S::OTLD1-mRFP (протестированная конструкция).
    5. ПЦР-амплифицировать36 mRFP из pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 с помощью праймеров, перечисленных в таблице 1, клонировать его методом рекомбинационного клонирования в pDONR207, а затем использовать LR Clonase II для переноса mRFP в pPZP RCS2A-DEST-EGFP-N1 для генерации конструкции бинарного синтеза p35S::mRFP-GFP (положительный контроль).
  3. Выполнить трансформацию донорской и акцепторной конструкций в Agrobacterium.
    1. Добавляют 1 мкг каждой плазмиды со стадий 1.2.3-1.2.5-100 мкл культуры компетентных клеток штамма Agrobacterium tumefaciens EHA105 или GV3101, приготовленной с использованием стандартных протоколов37 или полученной в коммерческих целях, и инкубируют при 37°С в течение 5 мин.
    2. Добавьте 1 мл среды LB (1% триптона, 0,5% дрожжевого экстракта и 1% NaCl; см. Таблицу материалов) в компетентную клеточную смесь и перемешайте при 200 об/мин и 28°C в течение 1,5 ч. Соберите клетки методом центрифугирования при 3000 × г в течение 1 мин при комнатной температуре.
    3. Повторно суспендируют клетки в 0,1 мл среды LB путем пипетирования и наносят их на агар LB, дополненный соответствующими антибиотиками (например, 0,01% спектиномицином и 0,005% рифампицином; см. Таблицу материалов). Растут при 28 °C в течение 2 дней.
    4. Подберите отдельные колонии и привите каждую из них отдельно в 1 мл бульона LB, дополненного соответствующими антибиотиками.
    5. Вырастите клетки при 28 °C в течение 24 ч и переложите 0,2 мл культуры в новую трубку. Собирайте ячейки центрифугированием при 10 000 × г в течение 30 с при комнатной температуре.
    6. Экстрагируют плазмидную ДНК по стандартному протоколу для выделения плазмид из клеток Agrobacterium38 и повторного суспендирования экстрагированной ДНК в 30 мкл воды. Чтобы идентифицировать колонии, содержащие желаемые плазмиды, используйте 2 мкл препарата ДНК в качестве шаблона для ПЦР с ген-специфическими праймерами, перечисленными в таблице 1. Смешайте 0,7 мл идентифицированной культуры с 0,3 мл глицерина и храните при -80 °C.

2. Агроинфильтрация

  1. Выращивайте растения Nicotiana benthamiana .
    ПРИМЕЧАНИЕ: На протяжении всего эксперимента все растения должны быть здоровыми.
    1. Сейте и выращивайте семена N. benthamiana в горшке, содержащем влажную почву высокой плотности.
    2. Держите посаженные семена в камере роста, установленной при 23 °C с 16 ч света и 8 ч темного цикла с интенсивностью света 150-170 мкмоль/м2с, пока диаметр эуфилла не достигнет 0,5 см.
    3. Перенесите рассаду в большие горшки и дайте им расти в одной камере с теми же параметрами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Растения готовы к агроинфильтрации, когда их самые крупные листья достигают 5-7 см в диаметре, обычно в течение 4-5 недель. У небольших растений, которые слишком молоды, последствия агроинфильтрации будут слишком серьезными для анализа FRET.
  2. Подготовьте бактериальные клетки к агроинфильтрации.
    1. Выращивайте каждую колонию Agrobacterium, содержащую конструкции FRET, в течение ночи в 5 мл среды LB, дополненной соответствующими антибиотиками (стадия 1.3.3) и 150 мкМ ацетозиргинона при 28 °C (см. Таблицу материалов).
    2. Центрифугируют ячейки при 3000 × г в течение 5 мин при комнатной температуре.
    3. Повторное суспендирование клеток в буфере агроинфильтрации (10 мМMgCl2, 10 мМ MES pH 5,6, 150 мкМ ацетозирингона) до OD600 = 0,5.
    4. Объедините повторно суспендированные ячейки в соотношении 1:1 в/в между ячейками, содержащими соответствующие конструкции (шаг 2.2.5).
    5. Для агроинфильтраций с двойной конструкцией смешайте аликвоты двух культур, а для агроинфильтраций с одной конструкцией смешайте аликвоты одной и той же культуры:
      1. Протестированные белки: OTLD1-mRFP + LSH10-GFP (бактерии, содержащие конструкции p35S::OTLD1-mRFP и p35S::LSH10-GFP).
      2. Отрицательный контроль: OTLD1-mRFP + LSH4-GFP (бактерии, укрывающие конструкции p35S::OTLD1-mRFP и p35S::LSH4-GFP).
      3. Отрицательный контроль: LSH10-GFP + свободный mRFP (бактерии, укрывающие конструкции p35S::LSH10-GFP и pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1).
      4. Положительный контроль: mRFP-GFP (бактерии, укрывающие конструкцию p35S::mRFP-GFP).
    6. Инкубируют клетки при 28 °C в течение 0,5-1 ч.
  3. Выполните агроинфильтрацию.
    1. Загрузите бактериальную культуру в безыгольчатый шприц объемом 1 мл.
    2. Осторожно, но плотно прижмите сопло шприца к абаксиальной стороне полностью расширенных листьев N. benthamiana , держа лист пальцем в перчатке на адаксиальной стороне.
    3. Инфильтрируют до четырех пятен на листе, по три листа на растение, по два-три растения на каждую бактериальную культуру. Меняйте перчатки между образцами, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение.
    4. Поддерживайте агроинфильтрованные растения в той же камере роста в тех же условиях, как описано на этапе 2.1.2, в течение 24-36 ч. Не храните агроинфильтрованные растения дольше 36 ч, так как это уменьшит сигнал флуоресценции.

3. Конфокальная микроскопия

  1. Подготовьте слайды микроскопа для флуоресцентной визуализации.
    1. Через 24-36 ч инфильтрации используйте лезвие бритвы, чтобы разрезать каждый агроинфильтрованный лист на мелкие кусочки (2 мм х 4 мм) между жилками.
    2. Поместите кусочки листьев на стеклянную горку, а абаксиальная поверхность листа обращена вверх. Поместите каплю воды на кусочки листьев и накройте их покровным стеклом. Слегка постучите по защитному стеклу, чтобы удалить пузырьки воздуха.
    3. Включите микроскоп и лазер (см. Таблицу материалов). Поместите слайд в держатель ступени микроскопа для визуализации при определенных параметрах FRET (шаги 3.2 и 3.3).
    4. Начните наблюдения с использованием 10-кратной объективной линзы для идентификации клеток, которые демонстрируют сигналы GFP и mRFP, а затем используйте объектив 40x для последующих подробных наблюдений.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно отметить, что SE-FRET и AB-FRET обычно выполняются на одном и том же образце ткани, что позволяет использовать одни и те же настройки канала (шаг 3.2), за исключением канала FRET, который включается/выключается для наблюдений SE-FRET и AB-FRET соответственно (шаги 3.2.2.3 и 3.3.1).
  2. Настройка параметров для SE-FRET (рисунок 1A).
    1. Откройте инструмент многомерного приобретения (MDA).
    2. Установите набор из трех конфокальных каналов в одном поле зрения (дополнительный рисунок 1).
      1. Установите донорский канал (канал GFP) для возбуждения и излучения донорского фторхрома с помощью лазера возбуждения 405 нм и эмиссионного фильтра 400-597 нм.
      2. Установите акцепторный канал (канал mRFP) для возбуждения и излучения акцептора фторхрома с помощью лазера возбуждения 561 нм и эмиссионного фильтра 400-597 нм.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Эмиссионный фильтр для mRFP был установлен на 400-597 нм для отделения сигнала mRFP от сигнала FRET на 597-617 нм (шаг 3.2.2.3) и, следовательно, для снижения freT-независимого излучения mRFP.
      3. Установите канал FRET для возбуждения донора и излучения акцепторных фторхромов с помощью лазера возбуждения 405 нм и эмиссионного фильтра 597-617 нм.
    3. Установите интенсивность возбуждения донора на минимальном уровне, чтобы наблюдать FRET, избегая фотоотбеливания, снижая эффективность SE-FRET.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта интенсивность возбуждения экспериментально выбирается перед проведением процедуры FRET, чтобы избежать фотоотбеливания. Он варьируется в зависимости от толщины листа, возраста и времени после переэкспрессии.
    4. Возбуждайте донора и сканируйте клетки, содержащие ожидаемый флуоресцентный сигнал акцептора.
    5. Выберите область, содержащую интересующий флуоресцентный сигнал.
    6. Получите последовательность изображений SE-FRET, нажав кнопку Snap .
      1. Изображение 10-15 клеток, экспрессирующих сначала конструкцию mRFP-GFP (положительный контроль); отрегулируйте параметры фокусировки, масштабирования и интеллектуального усиления, чтобы сфокусироваться на интересующей вас области (дополнительный рисунок 2).
      2. Используя те же настройки, изобразите 10-15 ячеек, каждая из которых экспрессирует OTLD1-mRFP, свободный mRFP, LSH10-GFP или LSH4-GFP отдельно.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Эти изображения получены с помощью плагина "PixFRET" ImageJ (см. Таблицу материалов), который использовался для анализа данных FRET (шаг 3.4.1) для определения значений спектрального пропускания (SBT) для акцепторов и доноров; эти изображения используются программным обеспечением для генерации изображений SE-FRET для пар белков OTLD1-mRFP + LSH10-GFP, OTLD1-mRFP + LSH4-GFP и LSH10-GFP + свободных белков mRFP (шаг 3.2.6.3).
      3. Кроме того, используя те же настройки, изображение 10-15 клеток, совместно экспрессирующих OTLD1-mRFP + LSH10-GFP, OTLD1-mRFP + LSH4-GFP и LSH10-GFP + свободные пары белков mRFP.
  3. Настройка параметров для AB-FRET (рисунок 1B).
    1. Используйте параметры канала донора и акцептора, заданные для SE-FRET (шаг 3.2.2), но отключите канал FRET.
    2. Задайте параметры фотоотбеливания акцептора (mRFP) (Дополнительный рисунок 3).
      1. Убедитесь, что отбеливание начинается после пяти изображений. Позвольте 200 итераций для каждой области отбеливания. Сохраняйте 100% интенсивность лазера на уровне 561 нм.
      2. Поддерживайте продолжительность отбеливания 45 с. Обеспечьте скорость сканирования 512 x 512 пикселей при частоте 400 Гц.
    3. Нарисуйте область отбеливаемой ячейки; например, для ядерных взаимодействий области, представляющие интерес, рисуются вокруг всей площади ядра клетки39.
    4. Активируйте отбеливание, нажав кнопку Начать эксперимент ; активация этой функции выполнит фотоотбеливание и получит последовательность изображений AB-FRET.
  4. Анализируйте данные FRET.
    1. Для анализа данных SE-FRET используйте плагин "PixFRET" для программного обеспечения ImageJ для генерации скорректированных изображений эффективности SE-FRET после вычитания SBT40 (шаг 3.2.6.2).
    2. Для анализа данных AB-FRET рассчитайте %AB-FRET как процент увеличения излучения GFP после фотоотбеливания mRFP, используя следующую формулу41: %AB-FRET = [(GFPpost - GFPpre) / GFPpre] x 100, где GFPpost - это излучение GFP после фотоотбеливания mRFP, а GFPpre - излучение GFP перед фотоотбеливанием mRFP.
    3. При просмотре изображений FRET обратите внимание на субклеточную локализацию сигнала FRET.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во многих случаях эти клеточные компартменты (например, ядро, хлоропласты, ER и т.д.) могут быть легко идентифицированы и, в качестве дополнительного преимущества метода FRET, обеспечивают важные ключи к биологической функции взаимодействующих белков.

Результаты

Рисунок 2 иллюстрирует типичные результаты эксперимента SE-FRET, в котором ядра клеток были одновременно записаны в трех каналах (т.е. донорский GFP, акцепторный mRFP и SE-FRET). Эти данные были использованы для создания изображений эффективности SE-FRET, закодированных в псевдоцветн...

Обсуждение

Этот протокол FRET прост и легко воспроизводится; он также требует минимальных инвестиций в поставки и использует стандартное оборудование для многих современных лабораторий. В частности, пять основных технических особенностей отличают универсальность этой процедуры. Во-первых, конст?...

Раскрытие информации

Никаких конфликтов интересов объявлено не было.

Благодарности

Работа в лаборатории V.C. поддерживается грантами NIH (R35GM144059 и R01GM50224), NSF (MCB1913165 и IOS1758046) и BARD (IS-5276-20) для V.C.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetosyringone (3′,5′-Dimethoxy-4′-hydroxyacetophenone)Sigma-Aldrich#D134406-1G
Bacto AgarBD Biosciences#214010
Bacto tryptonBD Biosciences#211705
Bacto yeast extractBD Biosciences#212750 
Confocal laser scanning microscope (CLSM)ZeissLSM900Any CLSM with similar capabilities is suitable
EHA105VWR104013-310We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
Gateway BP Clonase II Invitrogen#11789100
Gateway LR Clonase IIInvitrogen#11791020
GV3101VWR104013-296We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
ImageJhttps://imagej.nih.gov/ij/download.html
MESSigma-Aldrich#69889-10G
MgCl2Sigma-Aldrich#63068-250G
NaClSigma-Aldrich#S5886-500G
Nicotiana benthamiana seedsHerbalistics PtyRA4 or LABWe use the stock in the Citovsky seed lab stock collection
pDONR207Invitrogen#12213013
pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 N/ARefs. 15, 28
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1N/AGenerated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-C1 construct (see refs. 15, 28)
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 N/AGenerated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 construct
RifampicinSigma-Aldrich#R7382-5G
SpectinomycinSigma-Aldrich#S4014-5G
Syringes without needlesBD309659
Zen software for CLSM imagingZeissZEN 3.0 versionThe software should be compatible with the CLSM used

Ссылки

  1. March, E., Farrona, S. Plant deubiquitinases and their role in the control of gene expression through modification of histones. Frontiers in Plant Science. 8, 2274 (2018).
  2. Isono, E., Nagel, M. K. Deubiquitylating enzymes and their emerging role in plant biology. Frontiers in Plant Science. 5, 56 (2014).
  3. Feng, J., Shen, W. H. Dynamic regulation and function of histone monoubiquitination in plants. Frontiers in Plant Science. 5, 83 (2014).
  4. Keren, I., Citovsky, V. Activation of gene expression by histone deubiquitinase OTLD1. Epigenetics. 12 (7), 584-590 (2017).
  5. Keren, I., Citovsky, V. The histone deubiquitinase OTLD1 targets euchromatin to regulate plant growth. Science Signaling. 9 (459), 125 (2016).
  6. Krichevsky, A., Lacroix, B., Zaltsman, A., Citovsky, V. Involvement of KDM1C histone demethylase-OTLD1 otubain-like histone deubiquitinase complexes in plant gene repression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (27), 11157-11162 (2011).
  7. Keren, I., Lapidot, M., Citovsky, V. Coordinate activation of a target gene by KDM1C histone demethylase and OTLD1 histone deubiquitinase in Arabidopsis. Epigenetics. 14 (6), 602-610 (2019).
  8. Kim, S. Y., Michaels, S. D. SUPPRESSOR OF FRI 4 encodes a nuclear-localized protein that is required for delayed flowering in winter-annual Arabidopsis. Development. 133 (23), 4699-4707 (2006).
  9. Kim, S., Choi, K., Park, C., Hwang, H. J., Lee, I. SUPPRESSOR OF FRIGIDA4, encoding a C2H2-type zinc finger protein, represses flowering by transcriptional activation of Arabidopsis FLOWERING LOCUS C. The Plant Cell. 18 (11), 2985-2998 (2006).
  10. Sridhar, V. V., Surendrarao, A., Gonzalez, D., Conlan, R. S., Liu, Z. Transcriptional repression of target genes by LEUNIG and SEUSS, two interacting regulatory proteins for Arabidopsis flower development. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (31), 11494-11499 (2004).
  11. Ning, Y. Q., et al. Two novel NAC transcription factors regulate gene expression and flowering time by associating with the histone demethylase JMJ14. Nucleic Acids Research. 43 (3), 1469-1484 (2015).
  12. Hecker, A., et al. The Arabidopsis GAGA-binding factor BASIC PENTACYSTEINE6 recruits the POLYCOMB-REPRESSIVE COMPLEX1 component LIKE HETEROCHROMATIN PROTEIN1 to GAGA DNA motifs. Plant Physiology. 168 (3), 1013-1024 (2015).
  13. Xiao, J., et al. Cis and trans determinants of epigenetic silencing by Polycomb repressive complex 2 in Arabidopsis. Nature Genetics. 49 (10), 1546-1552 (2017).
  14. Yuan, W., et al. A cis cold memory element and a trans epigenome reader mediate Polycomb silencing of FLC by vernalization in Arabidopsis. Nature Genetics. 48 (12), 1527-1534 (2016).
  15. Phan, M. S. V., Keren, I., Tran, P. T., Lapidot, M., Citovsky, V. Arabidopsis LSH10 transcription factor interacts with the co-repressor histone deubiquitinase OTLD1 to recruit it to the target promoters. bioRxiv. , (2022).
  16. Zhao, L., et al. Overexpression of LSH1, a member of an uncharacterised gene family, causes enhanced light regulation of seedling development. The Plant Journal. 37 (5), 694-706 (2004).
  17. Lei, Y., Su, S., He, L., Hu, X., Luo, D. A member of the ALOG gene family has a novel role in regulating nodulation in Lotus japonicus. Journal of Integrative Plant Biology. 61 (4), 463-477 (2019).
  18. MacAlister, C. A., et al. Synchronization of the flowering transition by the tomato TERMINATING FLOWER gene. Nature Genetics. 44 (12), 1393-1398 (2012).
  19. Takeda, S., et al. CUP-SHAPED COTYLEDON1 transcription factor activates the expression of LSH4 and LSH3, two members of the ALOG gene family, in shoot organ boundary cells. The Plant Journal. 66 (6), 1066-1077 (2011).
  20. Yan, D., et al. BEAK-SHAPED GRAIN 1/TRIANGULAR HULL 1, a DUF640 gene, is associated with grain shape, size and weight in rice. Science China Life Sciences. 56 (3), 275-283 (2013).
  21. Yoshida, A., et al. TAWAWA1, a regulator of rice inflorescence architecture, functions through the suppression of meristem phase transition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (2), 767-772 (2013).
  22. Yoshida, A., Suzaki, T., Tanaka, W., Hirano, H. Y. The homeotic gene long sterile lemma (G1) specifies sterile lemma identity in the rice spikelet. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (47), 20103-20108 (2009).
  23. Iyer, L. M., Aravind, L. ALOG domains: provenance of plant homeotic and developmental regulators from the DNA-binding domain of a novel class of DIRS1-type retroposons. Biology Direct. 7, 39 (2012).
  24. Peng, P., et al. The rice TRIANGULAR HULL1 protein acts as a transcriptional repressor in regulating lateral development of spikelet. Scientific Reports. 7 (1), 13712 (2017).
  25. Day, R. N., Periasamy, A., Schaufele, F. Fluorescence resonance energy transfer microscopy of localized protein interactions in the living cell nucleus. Methods. 25 (1), 4-18 (2001).
  26. Qian, J., Yao, B., Wu, C. Fluorescence resonance energy transfer detection methods: Sensitized emission and acceptor bleaching. Experimental and Therapeutic. 8 (5), 1375-1380 (2014).
  27. Campbell, R. E., et al. A monomeric red fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (12), 7877-7882 (2004).
  28. Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Molecular Biology. 57 (4), 503-516 (2005).
  29. Bracha-Drori, K., et al. Detection of protein-protein interactions in plants using bimolecular fluorescence complementation. The Plant Journal. 40 (3), 419-427 (2004).
  30. Citovsky, V., Gafni, Y., Tzfira, T. Localizing protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation in planta. Methods. 45 (3), 196-206 (2008).
  31. Citovsky, V., et al. Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta. Journal of Molecular Biology. 362 (5), 1120-1131 (2006).
  32. Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. The analysis of protein-protein Interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation. Plant Physiology. 145 (4), 1090-1099 (2007).
  33. Gookin, T. E., Assmann, S. M. Significant reduction of BiFC non-specific assembly facilitates in planta assessment of heterotrimeric G-protein interactors. The Plant Journal. 80 (3), 553-567 (2014).
  34. Tran, P. T., Citovsky, V. Receptor-like kinase BAM1 facilitates early movement of the Tobacco mosaic virus. Communications Biology. 4 (1), 511 (2021).
  35. Walhout, A. J., et al. GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods in Enzymology. 328, 575-592 (2000).
  36. Ashwini, M., Murugan, S. B., Balamurugan, S., Sathishkumar, R. Advances in molecular cloning. Molecular Biology. 50 (1), 1-6 (2016).
  37. Tzfira, T., et al. Transgenic Populus: a step-by-step protocol for its Agrobacterium-mediated transformation. Plant Molecular Biology Reporter. 15, 219-235 (1997).
  38. Wise, A. A., Liu, Z., Binns, A. N. Nucleic acid extraction from Agrobacterium strains. Methods in Molecular Biology. 343, 67-76 (2006).
  39. Bal, M., Zhang, J., Hernandez, C. C., Zaika, O., Shapiro, M. S. Ca2+/calmodulin disrupts AKAP79/150 interactions with KCNQ (M-Type) K+ channels. The Journal of Neuroscience. 30 (6), 2311-2323 (2010).
  40. Feige, J. N., Sage, D., Wahli, W., Desvergne, B., Gelman, L. PixFRET, an ImageJ plug-in for FRET calculation that can accommodate variations in spectral bleed-throughs. Microscopy Research & Technique. 68 (1), 51-58 (2005).
  41. Bal, M., Zhang, J., Hernandez, C. C., Zaika, O., Shapiro, M. S. Ca2+/calmodulin disrupts AKAP79/150 interactions with KCNQ (M-Type) K+ channels. Journal of Neuroscience. 30 (6), 2311-2323 (2010).
  42. Taylor, N. J., Fauquet, C. M. Microparticle bombardment as a tool in plant science and agricultural biotechnology. DNA and Cell Biology. 21 (12), 963-977 (2002).
  43. Broussard, J. A., Green, K. J. Research techniques made simple: methodology and applications of Förster resonance energy transfer (FRET) microscopy. Journal of Investigative Dermatology. 137 (11), 185-191 (2017).
  44. Kudla, J., Bock, R. Lighting the way to protein-protein interactions: recommendations on best practices for bimolecular fluorescence complementation analyses. The Plant Cell. 28 (5), 1002-1008 (2016).
  45. Bartel, P., Chien, C. T., Sternglanz, R., Fields, S., Hartley, D. A. . Cellular Interactions in Development: A Practical Approach. , 153-179 (1993).
  46. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  47. Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiological Reviews. 59 (1), 94-123 (1995).
  48. Fields, S. High-throughput two-hybrid analysis. The promise and the peril. The FEBS Journal. 272 (21), 5391-5399 (2005).
  49. Azad, T., Tashakor, A., Hosseinkhani, S. Split-luciferase complementary assay: applications, recent developments, and future perspectives. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (23), 5541-5560 (2014).
  50. Wang, L., Yu, G., Macho, A. P., Lozano-Durán, R. Split-luciferase complementation imaging assay to study protein-protein interactions in Nicotiana benthamiana. Bio-protocol. 11 (23), 4237 (2021).
  51. Grefen, C., Lalonde, S., Obrdlik, P. Split-ubiquitin system for identifying protein-protein interactions in membrane and full-length proteins. Current Protocols in Neuroscience. 41 (1), 5-27 (2007).
  52. Thaminy, S., Miller, J., Stagljar, I. The split-ubiquitin membrane-based yeast two-hybrid system. Methods in Molecular Biology. 261, 297-312 (2004).
  53. Lin, J. S., Lai, E. M. Protein-protein interactions: co-immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 1615, 211-219 (2017).
  54. Jiang, Z., Yang, M., Cao, Q., Zhang, Y., Li, D. A powerful method for studying protein-protein interactions in plants: coimmunoprecipitation (co-IP) assay. Methods in Molecular Biology. 2400, 87-92 (2022).
  55. Magori, S., Citovsky, V. Agrobacterium counteracts host-induced degradation of its F-box protein effector. Science Signaling. 4 (195), (2011).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

188HMETFFRET

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены