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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET) è una tecnica di imaging per rilevare le interazioni proteiche nelle cellule viventi. Qui viene presentato un protocollo FRET per studiare l'associazione di enzimi modificanti gli istoni con fattori di trascrizione che li reclutano nei promotori bersaglio per la regolazione epigenetica dell'espressione genica nei tessuti vegetali.

Abstract

La regolazione epigenetica dell'espressione genica è comunemente influenzata dagli enzimi modificanti gli istoni (HME) che generano segni istonici eterocromatici o eucromatici rispettivamente per la repressione o l'attivazione trascrizionale. Gli HME vengono reclutati nella loro cromatina target dai fattori di trascrizione (TF). Pertanto, rilevare e caratterizzare le interazioni dirette tra HME e TF è fondamentale per comprendere meglio la loro funzione e specificità. Questi studi sarebbero biologicamente più rilevanti se eseguiti in vivo all'interno di tessuti viventi. Qui, viene descritto un protocollo per visualizzare le interazioni nelle foglie delle piante tra una deubiquitinasi istonica vegetale e un fattore di trascrizione vegetale utilizzando il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET), che consente la rilevazione di complessi tra molecole proteiche che si trovano entro <10 nm l'una dall'altra. Vengono presentate due varianti della tecnica FRET: SE-FRET (emissione sensibilizzata) e AB-FRET (sbiancamento dell'accettore), in cui l'energia viene trasferita in modo non radiativo dal donatore all'accettore o emessa radiativamente dal donatore dopo il fotosbiancamento dell'accettore. Entrambi gli approcci SE-FRET e AB-FRET possono essere adattati facilmente per scoprire altre interazioni tra altre proteine nelle piante.

Introduzione

Le deubiquitinasi istoniche vegetali svolgono un ruolo importante nel controllo dell'espressione genica mediante modificazione post-traduzionale degli istoni, in particolare cancellando i loro segni di monoubiquitilazione1. Finora, OTLD1 è una delle poche deubiquitinasi istoniche vegetali caratterizzate a livello molecolare in Arabidopsis 2,3. OTLD1 rimuove i gruppi monoubiquitina dalle molecole istoniche H2B, promuovendo così la rimozione o l'aggiunta di acetilazione eucromatica e modificazioni di metilazione degli istoni H3 nel gene bersagliocromatina 4,5. Inoltre, OTLD1 interagisce con un altro enzima modificante la cromatina, l'istone lisina demetilasi KDM1C, per influenzare la soppressione trascrizionale dei geni bersaglio 6,7.

La maggior parte degli enzimi modificanti gli istoni non hanno capacità di legame al DNA e quindi non possono riconoscere direttamente i loro geni bersaglio. Una possibilità è che cooperino con le proteine del fattore di trascrizione leganti il DNA che legano questi enzimi e li dirigono verso i loro bersagli cromatinici. In particolare, nelle piante, diversi importanti enzimi modificanti gli istoni (cioè istone metiltransferasi8,9, istone acetiltransferasi 10, istone demetilasi 11 e complessi repressivi Polycomb12,13,14) sono noti per essere reclutati da fattori di trascrizione. Coerentemente con questa idea, recentemente, è stato proposto un possibile meccanismo per il reclutamento di OTLD1 nei promotori target che si basa su specifiche interazioni proteina-proteina di OTLD1 con un fattore di trascrizione LSH1015.

LSH10 appartiene ad una famiglia di proteine vegetali ALOG (Arabidopsis LSH1 e Oryza G1) che funzionano come regolatori centrali dello sviluppo 16,17,18,19,20,21,22. Il fatto che i membri della famiglia di proteine ALOG contengano motivi leganti il DNA23 e mostrino le capacità di regolazione trascrizionale 22, localizzazione nucleare19 e omodimerizzazione24 fornisce ulteriore supporto all'idea che queste proteine, incluso LSH10, possano agire come fattori di trascrizione specifici durante la regolazione epigenetica della trascrizione. Una delle principali tecniche sperimentali utilizzate per caratterizzare l'interazione LSH10-OTLD1 in vivo è il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET)15.

FRET è una tecnica di imaging per rilevare direttamente interazioni a distanza ravvicinata tra proteine entro <10 nm l'una dall'altra25 all'interno di cellule viventi. Esistono due varianti principali dell'approccio FRET26: l'emissione sensibilizzata (SE-FRET) (Figura 1A) e lo sbiancamento accettore (AB-FRET) (Figura 1B). In SE-FRET, le proteine interagenti - una delle quali è marcata con un fluorocromo donatore (ad esempio, proteina fluorescente verde, GFP) e l'altra con un fluorocromo accettore (ad esempio, proteina fluorescente rossa monomerica, mRFP27,28) - trasferiscono in modo non radiativo l'energia dello stato eccitato dal donatore all'accettore. Poiché non vengono emessi fotoni durante questo trasferimento, viene prodotto un segnale fluorescente che ha uno spettro di emissione radiativa simile a quello dell'accettore. In AB-FRET, le interazioni proteiche sono rilevate e quantificate in base all'elevata emissione radiativa del donatore quando l'accettore è permanentemente inattivato dal fotosbiancamento e quindi non è in grado di ricevere l'energia non radiativa trasferita dal donatore (Figura 1). È importante sottolineare che la posizione subcellulare della fluorescenza FRET è indicativa della localizzazione delle proteine interagenti nella cellula.

La capacità di dispiegare FRET nei tessuti viventi e determinare la localizzazione subcellulare delle proteine interagenti simultaneamente con la rilevazione di questa interazione di per sé, rende FRET la tecnica di scelta per gli studi e la caratterizzazione iniziale delle interazioni proteina-proteina in vivo. Una metodologia di imaging a fluorescenza in vivo comparabile, la complementazione di fluorescenza bimolecolare (BiFC)29,30,31,32, è un buon approccio alternativo, anche se, a differenza di FRET, BiFC può produrre falsi positivi a causa dell'assemblaggio spontaneo dei reporter BiFC autofluorescenti 33 e la quantificazione dei suoi dati è meno precisa.

Questo articolo condivide l'esperienza di successo nell'implementazione di entrambe le tecniche SE-FRET e AB-FRET e presenta un protocollo per la loro distribuzione per studiare le interazioni tra OTLD1 e LSH10 nelle cellule vegetali.

Protocollo

Per il presente studio sono stati utilizzati Nicotiana benthamiana, Agrobacterium tumefaciens ceppo EHA105 o GV3101.

1. Costruzione vettoriale FRET

  1. Selezionare i tag fluorescenti per la coppia FRET donatore/accettore.
    1. Utilizzare EGFP da pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N115,28 (vedere la tabella dei materiali) per generare il vettore donatore.
    2. Utilizzare mRFP da pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 (vedere Tabella dei materiali) per generare il vettore accettore.
  2. Generare i costrutti FRET donatore/accettore utilizzando una tecnica di clonazione di ricombinazione specifica del sito34, come il sistema di clonazione di ricombinazione Gateway35.
    1. Amplificare le sequenze codificanti delle proteine di interesse36 (cioè Arabidopsis OTLD1 e LSH10)15.
      NOTA: È anche una buona idea utilizzare un controllo negativo che rappresenta un omologo di una delle proteine interagenti ma non ci si aspetta che mostri interazione; lo studio di interazione OTLD1-LSH10 impiega un omologo di LSH10, LSH4, che non riconosce OTLD1. I cDNA OTLD1, LSH10 e LSH4 sono amplificati mediante PCR utilizzando i primer elencati nella Tabella 1.
    2. Clonare OTLD1, LSH10 e LSH4 nel vettore di ingresso pDONR207 mediante la tecnica di clonazione di ricombinazione sito-specifica34.
    3. Utilizzare il Gateway LR Clonase II (vedere la Tabella dei Materiali) per trasferire LSH10 e LSH4 da pDONR207 nel vettore di destinazione binario pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 per generare i costrutti binari del donatore p35S::LSH10-GFP (costrutto testato) e p35S::LSH4-GFP (controllo negativo).
    4. Utilizzare lo stesso enzima disponibile in commercio (passo 1.2.3) per trasferire OTLD1 da pDONR207 nel vettore di destinazione binario pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 per generare il costrutto accettore binario p35S:: OTLD1-mRFP (costrutto testato).
    5. PCR-amplificare36 mRFP da pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 usando i primer elencati nella Tabella 1, clonarlo con la tecnica di clonazione di ricombinazione in pDONR207 e quindi utilizzare LR Clonase II per trasferire mRFP in pPZP RCS2A-DEST-EGFP-N1 per generare il costrutto di fusione binaria p35S::mRFP-GFP (controllo positivo).
  3. Eseguire la trasformazione dei costrutti del donatore e dell'accettore in Agrobacterium.
    1. Aggiungere 1 μg di ciascun plasmide dalle fasi 1.2.3-1.2.5 a 100 μL della coltura di cellule competenti di Agrobacterium tumefaciens ceppo EHA105 o GV3101, preparato utilizzando i protocolli standard 37 o ottenuto commercialmente, e incubare a37 °C per 5 minuti.
    2. Aggiungere 1 mL di terreno LB (1% triptone, 0,5% estratto di lievito e 1% NaCl; vedi Tabella dei materiali) alla miscela cellulare competente e agitare a 200 rpm e 28 ° C per 1,5 h. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 3.000 × g per 1 minuto a temperatura ambiente.
    3. Risospendere le cellule in 0,1 mL di terreno LB mediante pipettaggio e distribuirle su agar LB integrato con gli antibiotici appropriati (ad esempio, 0,01% di spectinomicina e 0,005% di rifampicina; vedere Tabella dei materiali). Crescere a 28 °C per 2 giorni.
    4. Scegli le singole colonie e inocula ciascuna di esse separatamente in 1 ml di brodo LB integrato con gli antibiotici appropriati.
    5. Far crescere le cellule a 28 °C per 24 ore e trasferire 0,2 ml di coltura in una nuova provetta. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 10.000 × g per 30 s a temperatura ambiente.
    6. Estrarre il DNA plasmidico con un protocollo standard per isolare i plasmidi dalle cellule di Agrobacterium 38 e risospendere il DNA estratto in30 μL di acqua. Per identificare le colonie che ospitano i plasmidi desiderati, utilizzare 2 μL della preparazione del DNA come modello per la PCR con primer gene-specifici elencati nella Tabella 1. Mescolare 0,7 mL della coltura identificata con 0,3 mL di glicerolo e conservare a -80 °C.

2. Agroinfiltrazione

  1. Coltiva piante di Nicotiana benthamiana .
    NOTA: Durante l'intero esperimento, tutte le piante devono essere sane.
    1. Semina e coltiva i semi di N. benthamiana in un vaso contenente terreno umido ad alta densità.
    2. Conservare i semi piantati in una camera di crescita impostata a 23 °C con 16 h di luce e 8 ore di ciclo buio con intensità luminosa di 150-170 μmol/m2s fino a quando il diametro dell'eufilla raggiunge 0,5 cm.
    3. Trasferire le piantine in vasi più grandi e lasciarle crescere nella stessa camera con gli stessi parametri.
      NOTA: Le piante sono pronte per l'agroinfiltrazione quando le loro foglie più grandi hanno un diametro di 5-7 cm, di solito entro 4-5 settimane. Nelle piante più piccole che sono troppo giovani, gli effetti dell'agroinfiltrazione saranno troppo gravi per l'analisi FRET.
  2. Preparare le cellule batteriche per l'agroinfiltrazione.
    1. Coltivare ogni colonia di Agrobacterium contenente i costrutti FRET durante la notte in 5 ml di terreno LB integrato con gli antibiotici appropriati (fase 1.3.3) e 150 μM di acetosiringone a 28 °C (vedere Tabella dei materiali).
    2. Centrifugare le celle a 3.000 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
    3. Risospendere le cellule in tampone di agroinfiltrazione (10 mM MgCl2, 10 mM MES pH 5,6, 150 μM acetosiringone) a OD600 = 0,5.
    4. Combinare le celle risospese con un rapporto v/v 1:1 tra le celle che ospitano i costrutti appropriati (passo 2.2.5).
    5. Per le agroinfiltrazioni a doppio costrutto, mescolare le aliquote di due colture e, per le agroinfiltrazioni a costruzione singola, mescolare le aliquote della stessa coltura:
      1. Proteine testate: OTLD1-mRFP + LSH10-GFP (batteri che ospitano i costrutti p35S::OTLD1-mRFP e p35S::LSH10-GFP).
      2. Controllo negativo: OTLD1-mRFP + LSH4-GFP (batteri che ospitano i costrutti p35S::OTLD1-mRFP e p35S::LSH4-GFP).
      3. Controllo negativo: LSH10-GFP + mRFP libero (batteri che ospitano i costrutti p35S::LSH10-GFP e pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1).
      4. Controllo positivo: mRFP-GFP (batteri che ospitano il costrutto p35S::mRFP-GFP).
    6. Incubare le cellule a 28 °C per 0,5-1 ora.
  3. Eseguire l'agroinfiltrazione.
    1. Caricare la coltura batterica in una siringa senza ago da 1 ml.
    2. Premere delicatamente ma con decisione l'ugello della siringa contro il lato abassiale delle foglie di N. benthamiana completamente espanse tenendo la foglia con un dito guantato sul lato adassiale.
    3. Infiltrare fino a quattro punti su una foglia, tre foglie per pianta, due o tre piante per ogni coltura batterica. Cambiare i guanti tra i campioni per evitare contaminazioni incrociate.
    4. Mantenere le piante agroinfiltrate nella stessa camera di crescita nelle stesse condizioni, come descritto al punto 2.1.2, per 24-36 ore. Non tenere le piante agroinfiltrate per più di 36 ore, in quanto ciò ridurrebbe il segnale di fluorescenza.

3. Microscopia confocale

  1. Preparare vetrini da microscopio per la visualizzazione della fluorescenza.
    1. Dopo 24-36 h di infiltrazione, utilizzare una lametta per tagliare ogni foglia agroinfiltrata in piccoli pezzi (2 mm x 4 mm) tra le vene.
    2. Posizionare i pezzi di foglia su un vetrino con la superficie della foglia abassiale rivolta verso l'alto. Mettere una goccia d'acqua sui pezzi di foglie e coprirli con il vetro di copertura. Picchiettare leggermente il vetro di copertura per rimuovere le bolle d'aria.
    3. Accendere il microscopio e il laser (vedere Tabella dei materiali). Posizionare il vetrino nel supporto del palco del microscopio per l'imaging sotto i parametri FRET specifici (passaggi 3.2 e 3.3).
    4. Iniziare le osservazioni utilizzando una lente obiettivo 10x per identificare le cellule che mostrano entrambi i segnali GFP e mRFP, quindi utilizzare una lente obiettivo 40x per le successive osservazioni dettagliate.
      NOTA: È importante sottolineare che SE-FRET e AB-FRET di solito vengono eseguiti sullo stesso campione di tessuto, consentendo l'uso delle stesse impostazioni del canale (fase 3.2) ad eccezione del canale FRET, che viene attivato / disattivato per le osservazioni SE-FRET e AB-FRET, rispettivamente (passaggi 3.2.2.3 e 3.3.1).
  2. Impostare i parametri per SE-FRET (Figura 1A).
    1. Aprire lo strumento MDA (Multi-Dimensional Acquisition).
    2. Stabilire un insieme di tre canali confocali nello stesso campo visivo (Figura supplementare 1).
      1. Impostare il canale donatore (il canale GFP) per l'eccitazione e l'emissione del fluorocromo donatore con il laser di eccitazione 405 nm e il filtro di emissione 400-597 nm.
      2. Impostare il canale accettore (il canale mRFP) per l'eccitazione e l'emissione del fluorocromo accettore con il laser di eccitazione 561 nm e il filtro di emissione 400-597 nm.
        NOTA: Il filtro di emissione per mRFP è stato impostato a 400-597 nm per separare il segnale mRFP dal segnale FRET a 597-617 nm (passo 3.2.2.3) e, quindi, ridurre l'emissione mRFP indipendente dal FRET.
      3. Impostare il canale FRET per l'eccitazione del donatore e l'emissione dei fluorocromi accettori con il laser di eccitazione da 405 nm e il filtro di emissione 597-617 nm.
    3. Impostare l'intensità di eccitazione del donatore a un livello minimo per osservare la FRET evitando il fotosbiancamento, riducendo l'efficienza SE-FRET.
      NOTA: Questa intensità di eccitazione viene selezionata sperimentalmente prima di eseguire la procedura FRET per evitare il fotosbiancamento. Varia a seconda dello spessore della foglia, dell'età e del tempo dopo la sovraespressione.
    4. Eccitare il donatore ed eseguire la scansione per le cellule contenenti il segnale di fluorescenza atteso dell'accettore.
    5. Selezionare la regione che contiene il segnale di fluorescenza di interesse.
    6. Acquisire una sequenza di immagini SE-FRET premendo il pulsante Snap .
      1. Immagine 10-15 celle che esprimono prima il costrutto mRFP-GFP (controllo positivo); regolare i parametri di messa a fuoco, zoom e guadagno intelligente per mettere a fuoco l'area di interesse da acquisire (Figura supplementare 2).
      2. Utilizzando le stesse impostazioni, visualizzare separatamente 10-15 celle, ognuna delle quali esprime OTLD1-mRFP, mRFP libero, LSH10-GFP o LSH4-GFP separatamente.
        NOTA: Queste immagini vengono acquisite dal plug-in "PixFRET" di ImageJ (vedi Tabella dei materiali), che è stato utilizzato per le analisi dei dati FRET (passo 3.4.1) per determinare i valori di bleed-through spettrale (SBT) per gli accettori e i donatori; queste immagini vengono utilizzate dal software per generare le immagini SE-FRET per le coppie di proteine OTLD1-mRFP + LSH10-GFP, OTLD1-mRFP + LSH4-GFP e LSH10-GFP + mRFP libere (passo 3.2.6.3).
      3. Inoltre, utilizzando le stesse impostazioni, immagine 10-15 cellule co-esprimendo coppie proteiche OTLD1-mRFP + LSH10-GFP, OTLD1-mRFP + LSH4-GFP e LSH10-GFP + mRFP libere.
  3. Impostare i parametri per AB-FRET (Figura 1B).
    1. Utilizzare i parametri del canale donatore e accettore impostati per SE-FRET (passaggio 3.2.2) ma spegnere il canale FRET.
    2. Impostare i parametri per il fotosbiancamento dell'accettore (mRFP) (Figura supplementare 3).
      1. Assicurati che lo sbiancamento inizi dopo cinque immagini. Consentire 200 iterazioni per ogni area candeggina. Mantenere l'intensità laser del 100% a 561 nm.
      2. Mantenere una durata di sbiancamento di 45 s. Garantire una velocità di scansione di 512 x 512 pixel a 400 Hz.
    3. Disegnare la regione della cella da sbiancare; Ad esempio, per le interazioni nucleari, le regioni di interesse sono disegnate attorno all'intera area del nucleo cellulare39.
    4. Attivare lo sbiancamento premendo il pulsante Avvia esperimento ; attivando questa funzione si eseguirà il photobleaching e si acquisirà la sequenza di immagini AB-FRET.
  4. Analizzare i dati FRET.
    1. Per analizzare i dati SE-FRET, utilizzare il plug-in "PixFRET" per il software ImageJ per generare immagini corrette dell'efficienza SE-FRET dopo aver sottratto SBT40 (passaggio 3.2.6.2).
    2. Per analizzare i dati AB-FRET, calcolare %AB-FRET come aumento percentuale delle emissioni di GFP dopo il fotosbiancamento mRFP utilizzando la seguente formula41: %AB-FRET = [(GFPpost - GFPpre) / GFPpre] x 100, dove GFPpost è l'emissione di GFP dopo il fotosbiancamento mRFP e GFPpre è l'emissione di GFP prima del fotosbiancamento mRFP.
    3. Quando si esaminano le immagini FRET, prestare attenzione alla localizzazione subcellulare del segnale FRET.
      NOTA: In molti casi, questi compartimenti cellulari (ad esempio, nucleo, cloroplasti, ER, ecc.) possono essere facilmente identificati e, come ulteriore vantaggio della tecnica FRET, forniscono importanti indizi sulla funzione biologica delle proteine interagenti.

Risultati

La Figura 2 illustra i risultati tipici di un esperimento SE-FRET, in cui i nuclei cellulari sono stati registrati simultaneamente in tre canali (cioè GFP del donatore, accettore mRFP e SE-FRET). Questi dati sono stati utilizzati per generare immagini di efficienza SE-FRET codificate in una scala pseudo-cromatica. Su questa scala, il passaggio dal blu al rosso corrisponde ad un aumento dell'efficienza FRET, una misura della vicinanza proteina-proteina dallo 0% al 100%. In questo esperimento...

Discussione

Questo protocollo FRET è semplice e facile da riprodurre; Richiede anche un investimento minimo di fornitura e utilizza attrezzature standard per molti laboratori moderni. Nello specifico, cinque caratteristiche tecniche principali contraddistinguono la versatilità di questa procedura. In primo luogo, i costrutti FRET sono generati utilizzando la ricombinazione sito-specifica, un approccio di clonazione che è facile da usare, produce risultati accurati e consente di risparmiare tempo rispetto alla tradizionale clonazi...

Divulgazioni

Non sono stati dichiarati conflitti di interesse.

Riconoscimenti

Il lavoro nel laboratorio di V.C. è supportato da sovvenzioni da NIH (R35GM144059 e R01GM50224), NSF (MCB1913165 e IOS1758046) e BARD (IS-5276-20) a V.C.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetosyringone (3′,5′-Dimethoxy-4′-hydroxyacetophenone)Sigma-Aldrich#D134406-1G
Bacto AgarBD Biosciences#214010
Bacto tryptonBD Biosciences#211705
Bacto yeast extractBD Biosciences#212750 
Confocal laser scanning microscope (CLSM)ZeissLSM900Any CLSM with similar capabilities is suitable
EHA105VWR104013-310We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
Gateway BP Clonase II Invitrogen#11789100
Gateway LR Clonase IIInvitrogen#11791020
GV3101VWR104013-296We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
ImageJhttps://imagej.nih.gov/ij/download.html
MESSigma-Aldrich#69889-10G
MgCl2Sigma-Aldrich#63068-250G
NaClSigma-Aldrich#S5886-500G
Nicotiana benthamiana seedsHerbalistics PtyRA4 or LABWe use the stock in the Citovsky seed lab stock collection
pDONR207Invitrogen#12213013
pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 N/ARefs. 15, 28
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1N/AGenerated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-C1 construct (see refs. 15, 28)
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 N/AGenerated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 construct
RifampicinSigma-Aldrich#R7382-5G
SpectinomycinSigma-Aldrich#S4014-5G
Syringes without needlesBD309659
Zen software for CLSM imagingZeissZEN 3.0 versionThe software should be compatible with the CLSM used

Riferimenti

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