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요약

형광 공명 에너지 전달(FRET)은 살아있는 세포에서 단백질 상호 작용을 감지하기 위한 이미징 기술입니다. 여기에서는 식물 조직에서 유전자 발현의 후성유전학적 조절을 위해 히스톤 변형 효소와 전사 인자를 모집하는 전사 인자의 연관성을 연구하기 위해 FRET 프로토콜이 제시됩니다.

초록

유전자 발현의 후성유전학적 조절은 일반적으로 전사 억제 또는 활성화를 위해 각각 이색성 또는 진색소 히스톤 마크를 생성하는 히스톤 변형 효소(HME)의 영향을 받습니다. HME는 전사 인자(TF)에 의해 표적 염색질에 모집됩니다. 따라서 HME와 TF 간의 직접적인 상호 작용을 감지하고 특성화하는 것은 기능과 특이성을 더 잘 이해하는 데 중요합니다. 이러한 연구는 생체 조직 내에서 생체 내에서 수행되는 경우 생물학적으로 더 관련이 있습니다. 여기에서는 형광 공명 에너지 전달 (FRET)을 사용하여 식물 히스톤 데비 퀴티 나제와 식물 전사 인자 사이의 식물 잎에서의 상호 작용을 시각화하기위한 프로토콜이 설명되며,이를 통해 서로 <10nm 이내에있는 단백질 분자 간의 복합체를 검출 할 수 있습니다. FRET 기술의 두 가지 변형이 제시됩니다 : SE-FRET(감작 방출) 및 AB-FRET(수용체 표백), 여기서 에너지는 공여체에서 수용체로 비방사성으로 전달되거나 수용체의 광표백시 공여체에 의해 방사적으로 방출됩니다. SE-FRET와 AB-FRET 접근법 모두 플란타의 다른 단백질 간의 다른 상호 작용을 발견하기 위해 쉽게 적용할 수 있습니다.

서문

식물 히스톤 데유비퀴티나제는 히스톤의 번역 후 변형에 의해, 특히 이들의 모노유비퀴틸화 마크를 삭제함으로써 유전자 발현을 조절하는 데 중요한 역할을 한다1. 지금까지 OTLD1은 애기장대 2,3에서 분자 수준에서 특징 지어지는 몇 안되는 식물 히스톤 데비 키티 나제 중 하나입니다. OTLD1은 H2B 히스톤 분자로부터 모노 유비 퀴틴 그룹을 제거하여 표적 유전자 염색질 4,5에서 H3 히스톤의 유 크로 마틱 아세틸 화 및 메틸화 변형의 제거 또는 첨가를 촉진합니다. 또한, OTLD1은 다른 염색질 변형 효소 인 히스톤 라이신 데 메틸 라제 KDM1C와 상호 작용하여 표적 유전자 6,7의 전사 억제에 영향을 미친다.

대부분의 히스톤 변형 효소는 DNA 결합 능력이 부족하여 표적 유전자를 직접 인식 할 수 없습니다. 한 가지 가능성은 이러한 효소에 결합하여 염색질 표적에 지시하는 DNA 결합 전사 인자 단백질과 협력한다는 것입니다. 구체적으로, 식물에서, 몇몇 주요 히스톤-개질 효소 (즉, 히스톤 메틸트랜스퍼라제 8,9, 히스톤 아세틸트랜스퍼라제 10, 히스톤 데메틸라제 11, 및 폴리콤 억제 복합체12,13,14)가 전사 인자에 의해 모집되는 것으로 알려져 있다. 이러한 아이디어와 일치하게, 최근에, OTLD1과 전사 인자 LSH1015의 특정 단백질-단백질 상호작용에 기초하는 표적 프로모터로의 OTLD1 모집을 위한 하나의 가능한 메커니즘이 제안되었다.

LSH10은 중앙 발달 조절자 16,17,18,19,20,21,22로 기능하는 식물 ALOG (애기장대 LSH1 및 Oryza G1) 단백질의 계열에 속합니다. ALOG 단백질 패밀리의 구성원이 DNA 결합 모티프(23)를 함유하고, 전사 조절22, 핵 국소화19, 및 동종이량체화(homodimerization)24에 대한 능력을 나타낸다는 사실은 LSH10을 포함하는 이들 단백질이 전사의 후성유전학적 조절 동안 특정 전사 인자로서 작용할 수 있다는 개념을 더욱 뒷받침한다. 생체 내에서 LSH10-OTLD1 상호 작용을 특성화하는 데 사용되는 주요 실험 기술 중 하나는 형광 공명 에너지 전달(FRET)15입니다.

FRET는 살아있는 세포 내에서 서로 <10nm 이내의 단백질25 사이의 근거리 상호 작용을 직접 검출하기위한 이미징 기술입니다. FRET 접근법26에는 감응 방출 (SE-FRET) (도 1A) 및 수용체 표백 (AB-FRET) (도 1B)의 두 가지 주요 변형이 있다. SE-FRET에서, 상호작용 단백질 - 그 중 하나는 공여체 플루오로크롬 (예를 들어, 녹색 형광 단백질, GFP)으로 태그되고 다른 하나는 수용체 형광 색소 (예를 들어, 단량체성 적색 형광 단백질, mRFP27,28)를 갖는 비-공여체로부터 수용체로 여기 상태 에너지를 전달한다. 이 전송 중에 광자가 방출되지 않기 때문에 수용체와 유사한 복사 방출 스펙트럼을 갖는 형광 신호가 생성됩니다. AB-FRET에서 단백질 상호 작용은 수용체가 광퇴색에 의해 영구적으로 비활성화되어 기증자로부터 전달된 비방사성 에너지를 수신할 수 없을 때 기증자의 상승된 복사 방출을 기반으로 검출되고 정량화됩니다(그림 1). 중요하게도, FRET 형광의 세포내 위치는 세포에서 상호작용하는 단백질의 국소화를 나타낸다.

FRET를 생체 조직에 배치하고 이러한 상호 작용 자체를 감지하는 동시에 상호 작용하는 단백질의 세포 내 위치를 결정할 수 있는 능력은 FRET를 생체 내 단백질-단백질 상호 작용의 연구 및 초기 특성화에 선택하는 기술로 만듭니다. 유사한 생체내 형광 이미징 방법론인 이분자 형광 보완(BiFC)29,30,31,32가 좋은 대안적 접근법이지만, FRET와는 달리, BiFC는 자가형광 BiFC 리포터(33)의 자발적 조립으로 인해 위양성을 생성할 수 있고, 그 데이터의 정량화는 덜 정확하다.

이 기사에서는 SE-FRET와 AB-FRET 기술을 모두 구현한 성공적인 경험을 공유하고 식물 세포에서 OTLD1과 LSH10 간의 상호 작용을 조사하기 위한 배포 프로토콜을 제시합니다.

프로토콜

본 연구에는 니코티아나 벤타미아나, 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 EHA105 또는 GV3101이 사용되었다.

1. FRET 벡터 구성

  1. 기증자/수용체 FRET 쌍에 대한 형광 태그를 선택합니다.
    1. pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N115,28 (재료 표 참조)의 EGFP를 사용하여 공여체 벡터를 생성합니다.
    2. pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 ( 재료 표 참조)의 mRFP를 사용하여 수용체 벡터를 생성합니다.
  2. 게이트웨이 재조합 클로닝 시스템(35)과 같은 부위 특이적 재조합 클로닝 기술(34)을 사용하여 공여체/수용체 FRET 구축물을 생성한다.
    1. 관심 단백질(36 )의 코딩 서열을 증폭합니다(즉, 애기장대 OTLD1 및 LSH10)15.
      참고: 상호 작용하는 단백질 중 하나의 상동체를 나타내지만 상호 작용을 나타내지 않을 것으로 예상되는 음성 대조군을 활용하는 것도 좋은 생각입니다. OTLD1-LSH10 상호작용 연구는 OTLD1을 인식하지 못하는 LSH10, LSH4의 상동체를 사용합니다. OTLD1, LSH10, 및 LSH4 cDNA는 표 1에 열거된 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭된다.
    2. OTLD1, LSH10, 및 LSH4를 부위 특이적 재조합 클로닝 기술(34)에 의해 진입 벡터 pDONR207 내로 복제한다.
    3. 게이트웨이 LR 클로나제 II( 재료 표 참조)를 사용하여 LSH10 및 LSH4를 pDONR207에서 이진 대상 벡터 pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1로 전달하여 이원 공여 구축물 p35S:: LSH10-GFP (테스트된 구조체) 및 p35S:: LSH4-GFP (음성 대조군)를 생성합니다.
    4. 동일한 시판되는 효소(단계 1.2.3)를 사용하여 pDONR207에서 OTLD1을 이진 대상 벡터 pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1로 전달하여 이원 수용체 구축물 p35S:: OTLD1-mRFP (시험된 작제물)를 생성합니다.
    5. 표 1에 열거된 프라이머를 사용하여 pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1로부터36 mRFP를 PCR-증폭하고, 재조합 클로닝 기술에 의해 pDONR207로 클로닝한 다음, LR 클로나제 II를 사용하여 mRFP를 pPZP RCS2A-DEST-EGFP-N1로 전달하여 이원 융합 구축물 p35S::mRFP-GFP(양성 대조군)를 생성한다.
  3. 기증자 및 수용체 구조물을 아그로박테리움으로 변형시킨다.
    1. 표준 프로토콜 37을 사용하여 제조하거나 상업적으로 수득한 아그로박테리움 튜메파시엔 스 균주 EHA105 또는 GV3101의 적격 세포 배양액 100μL에 1.2.3-1.2.5단계의 각 플라스미드 1μg을 첨가하고37 °C에서 5분 동안 배양한다.
    2. 1mL의 LB 배지(1% 트립톤, 0.5% 효모 추출물 및 1% NaCl, 재료 표 참조)를 유능한 세포 혼합물에 추가하고 200rpm 및 28°C에서 1.5시간 동안 교반합니다. 실온에서 1 분 동안 3,000×g에서 원심분리하여 세포를 수집한다.
    3. 피펫팅하여 세포를 0.1mL의 LB 배지에 재현탁시키고 적절한 항생제(예: 0.01% 스펙티노마이신 및 0.005% 리팜피신, 재료 표 참조)가 보충된 LB 한천에 뿌립니다. 28 °C에서 2 일 동안 성장합니다.
    4. 개별 콜로니를 선택하고 적절한 항생제가 보충된 LB 국물 1mL에 각각을 개별적으로 접종합니다.
    5. 세포를 28°C에서 24시간 동안 성장시키고 배양물 0.2mL를 새 튜브로 옮깁니다. 실온에서 30 초 동안 10,000×g에서 원심분리하여 세포를 수집합니다.
    6. 아그로박테리움 세포 38로부터 플라스미드를 단리하기 위한 표준 프로토콜에 의해 플라스미드 DNA를 추출하고, 추출된 DNA를30 μL의 물에 재현탁시킨다. 원하는 플라스미드를 보유하고 있는 콜로니를 식별하려면 표 1에 나열된 유전자 특이적 프라이머와 함께 PCR을 위한 주형으로 2μL의 DNA 제제를 사용합니다. 확인된 배양물 0.7mL를 글리세롤 0.3mL와 혼합하고 -80°C에서 보관합니다.

2. 농업 침투

  1. 니코 티아나 벤타미 아나 식물을 재배하십시오.
    참고 : 전체 실험에서 모든 식물은 건강해야합니다.
    1. N. benthamiana 씨앗을 고밀도의 젖은 토양이 들어있는 화분에 뿌리고 재배하십시오.
    2. 유필의 직경이 0.5cm에 도달 할 때까지 16 시간의 빛과 8 시간의 암주기로 150-170 μmol / m2s의 광도로 23 ° C로 설정된 성장 챔버에 심은 씨앗을 보관하십시오.
    3. 묘목을 더 큰 화분으로 옮기고 동일한 매개 변수로 동일한 챔버에서 자랄 수 있도록하십시오.
      참고 : 식물은 가장 큰 잎의 직경이 5-7cm 일 때 보통 4-5 주 이내에 농 침투 준비가되어 있습니다. 너무 어린 작은 식물에서는 FRET 분석에 너무 심한 농업 침투의 영향이 있습니다.
  2. 농업 침투를 위해 박테리아 세포를 준비하십시오.
    1. FRET 구축물을 함유하는 각각의 아그로박테리움 콜로니를 적절한 항생제(단계 1.3.3) 및 28°C에서 150μM 아세토시링곤이 보충된 5mL의 LB 배지에서 밤새 성장시킨다( 재료 표 참조).
    2. 실온에서 5분 동안 3,000× g 에서 세포를 원심분리합니다.
    3. 세포를 농침윤 완충액(10 mMMgCl2, 10 mM MES pH 5.6, 150 μM 아세토시링온)에OD600 =0.5로 재현탁시킨다.
    4. 적절한 구조를 보유한 세포 사이에 1 : 1 v / v 비율로 재현 된 세포를 결합합니다 (2.2.5 단계).
    5. 이중 구성 농업 침투의 경우 두 문화의 분취량을 혼합하고 단일 구성 농업 침투의 경우 동일한 배양의 분취량을 혼합합니다.
      1. 시험된 단백질: OTLD1-mRFP + LSH10-GFP(p35S::OTLD1-mRFP 및 p35S::LSH10-GFP 구축물을 보유하는 박테리아).
      2. 음성 대조군 : OTLD1-mRFP + LSH4-GFP (p35S : : OTLD1-mRFP 및 p35S :: LSH4-GFP 구축물을 보유하고있는 박테리아).
      3. 음성 대조군 : LSH10-GFP + 유리 mRFP (p35S : : LSH10-GFP 및 pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1 구축물을 보유하는 박테리아).
      4. 양성 대조군 : mRFP-GFP (p35S :: mRFP-GFP 구조체를 보유하고있는 박테리아).
    6. 세포를 28°C에서 0.5-1시간 동안 배양합니다.
  3. 농업 침투를 수행하십시오.
    1. 박테리아 배양액을 바늘 없는 주사기 1mL에 넣습니다.
    2. 부드럽게 그러나 단단히 주사기의 노즐을 완전히 확장 된 N. benthamiana 잎의 축 방향 쪽에 대고 장갑을 낀 손가락으로 잎을 축 방향으로 잡습니다.
    3. 잎에 최대 4 개의 지점, 식물 당 3 개의 잎, 각 박테리아 배양에 대해 2 개 또는 3 개의 식물에 침투합니다. 교차 오염을 방지하기 위해 샘플 사이에 장갑을 교체하십시오.
    4. 농윤 식물을 단계 2.1.2에 기재된 바와 같이 동일한 조건하에서 동일한 성장 챔버에서 24 시간 내지 36 시간 동안 유지한다. 농작물 침투 식물을 36 시간 이상 보관하면 형광 신호가 감소하므로 사용하지 마십시오.

3. 컨포칼 현미경

  1. 형광 시각화를 위한 현미경 슬라이드를 준비합니다.
    1. 침투 24-36 시간 후, 면도날을 사용하여 각 농작물 침투 잎을 정맥 사이의 작은 조각 (2mm x 4mm)으로 자릅니다.
    2. 축 방향 잎 표면이 위를 향하도록 유리 슬라이드에 잎 조각을 놓습니다. 잎 조각에 물 한 방울을 놓고 커버 유리로 덮으십시오. 커버 유리를 살짝 두드려 기포를 제거합니다.
    3. 현미경과 레이저를 켭니다( 재료 표 참조). 특정 FRET 매개변수(3.2단계 및 3.3단계)에서 이미징을 위해 슬라이드를 현미경 스테이지 홀더에 놓습니다.
    4. 10x 대물 렌즈를 사용하여 관찰을 시작하여 GFP 및 mRFP 신호를 모두 나타내는 세포를 식별한 다음 후속 세부 관찰을 위해 40x 대물 렌즈를 사용합니다.
      참고: 중요한 것은 SE-FRET와 AB-FRET는 일반적으로 동일한 조직 샘플에서 수행되므로 SE-FRET와 AB-FRET 관찰에 대해 각각 켜짐/꺼짐(단계 3.2.2.3 및 3.3.1단계)을 제외하고 동일한 채널 설정(단계 3.2)을 사용할 수 있다는 것입니다.
  2. SE-FRET에 대한 매개 변수를 설정합니다(그림 1A).
    1. 다차원 수집(MDA) 도구를 엽니다.
    2. 동일한 시야에 3개의 공초점 채널 세트를 설정합니다(보충 그림 1).
      1. 405nm 여기 레이저 및 400-597nm 방출 필터를 사용하여 도너 형광 색소의 여기 및 방출을 위한 도너 채널(GFP 채널)을 설정합니다.
      2. 561nm 여기 레이저 및 400-597nm 방출 필터를 사용하여 수용체 형광 색소의 여기 및 방출을 위한 수용체 채널(mRFP 채널)을 설정합니다.
        참고: mRFP용 방출 필터는 400-597nm로 설정되어 597-617nm의 FRET 신호에서 mRFP 신호를 분리하고(단계 3.2.2.3) FRET 독립적인 mRFP 방출을 줄입니다.
      3. 405nm 여기 레이저 및 597-617nm 방출 필터를 사용하여 공여체의 여기 및 수용체 형광 색소의 방출을위한 FRET 채널을 설정합니다.
    3. 기증자 여기 강도를 최소 수준으로 설정하여 광퇴색을 피하면서 FRET를 관찰하여 SE-FRET 효율을 줄입니다.
      알림: 이 여기 강도는 광퇴색을 피하기 위해 FRET 절차를 수행하기 전에 실험적으로 선택됩니다. 잎의 굵기, 나이, 과발현 후의 시간에 따라 다릅니다.
    4. 기증자를 여기시키고 수용체의 예상 형광 신호가 포함된 세포를 스캔합니다.
    5. 관심 있는 형광 신호가 포함된 영역을 선택합니다.
    6. 스냅 버튼을 눌러 SE-FRET 이미지 시퀀스를 획득합니다.
      1. 이미지 10-15는 mRFP-GFP 구축물 (양성 대조군)을 먼저 발현하는 세포; 초점, 확대/축소 및 스마트 게인 매개변수를 조정하여 캡처할 관심 영역에 초점을 맞춥니다(보충 그림 2).
      2. 동일한 설정을 사용하여, 각각 OTLD1-mRFP, 유리 mRFP, LSH10-GFP, 또는 LSH4-GFP를 개별적으로 발현하는 10-15 세포를 이미지화한다.
        참고 :이 이미지는 수용체와 기증자에 대한 스펙트럼 블리드 스루 (SBT) 값을 결정하기 위해 FRET 데이터 분석 (3.4.1 단계)에 사용 된 ImageJ의 "PixFRET"플러그인 ( 재료 표 참조)에 의해 수집됩니다. 이러한 이미지는 OTLD1-mRFP + LSH10-GFP, OTLD1-mRFP + LSH4-GFP 및 LSH10-GFP + 유리 mRFP 단백질 쌍에 대한 SE-FRET 이미지를 생성하기 위해 소프트웨어에 의해 사용됩니다 (단계 3.2.6.3).
      3. 또한, 동일한 설정을 사용하여, 화상 10-15 세포를 공동 발현하는 OTLD1-mRFP + LSH10-GFP, OTLD1-mRFP + LSH4-GFP, 및 LSH10-GFP+ 유리 mRFP 단백질 쌍을 공동 발현한다.
  3. AB-FRET에 대한 매개 변수를 설정합니다(그림 1B).
    1. SE-FRET에 대해 설정된 도너 및 수용체 채널 매개변수를 활용하되(단계 3.2.2) FRET 채널을 끕니다.
    2. 수용체(mRFP)의 광퇴색에 대한 매개변수를 설정합니다(보충 그림 3).
      1. 5개의 이미지 후에 표백이 시작되는지 확인합니다. 각 영역 표백제에 대해 200회 반복을 허용합니다. 561nm에서 100% 레이저 강도를 유지하십시오.
      2. 45 초의 표백 기간을 유지하십시오. 400Hz에서 512 x 512 픽셀의 스캔 속도를 보장합니다.
    3. 표백 할 세포의 영역을 그립니다. 예를 들어, 핵 상호작용에 대해, 관심 영역은 세포핵(39)의 전체 영역 주위에 그려진다.
    4. 실험 시작 버튼을 눌러 표백을 활성화하십시오. 이 기능을 활성화하면 광퇴색이 수행되고 AB-FRET 이미지 시퀀스가 획득됩니다.
  4. FRET 데이터를 분석합니다.
    1. SE-FRET 데이터를 분석하려면 ImageJ 소프트웨어용 "PixFRET" 플러그인을 사용하여 SBT40 을 뺀 후 SE-FRET 효율의 수정된 이미지를 생성합니다(단계 3.2.6.2).
    2. AB-FRET 데이터를 분석하기 위해, 하기 식41을 사용하여 mRFP 광표백 후 GFP 방출의 백분율 증가로서 %AB-FRET를 계산한다: %AB-FRET = [(GFPpost - GFPpre)/GFPpre] x 100, 여기서, GFPpost는 mRFP 광퇴색 후의 GFP 방출이고, GFPpre는 mRFP 광퇴색 전의 GFP 방출이다.
    3. FRET 이미지를 검토할 때 FRET 신호의 세포하 국소화에 주의하십시오.
      참고: 많은 경우에, 이러한 세포 구획(예를 들어, 핵, 엽록체, ER 등)은 쉽게 식별될 수 있고, FRET 기술의 추가적인 이점으로서, 상호작용하는 단백질의 생물학적 기능에 대한 중요한 단서를 제공한다.

결과

도 2 는 세포핵이 3개의 채널(즉, 공여자 GFP, 수용체 mRFP, 및 SE-FRET)에서 동시에 기록된 SE-FRET 실험의 전형적인 결과를 도시한다. 이러한 데이터는 의사 색상 스케일로 코딩된 SE-FRET 효율의 이미지를 생성하는 데 사용되었습니다. 이 척도에서 파란색에서 빨간색으로의 전환은 0%에서 100%까지의 단백질-단백질 근접성을 측정하는 FRET 효율의 증가에 해당합니다. 본 대표적인 실험?...

토론

이 FRET 프로토콜은 간단하고 재현하기 쉽습니다. 또한 최소한의 공급 투자가 필요하며 많은 현대 실험실에 표준 장비를 사용합니다. 특히, 다섯 가지 주요 기술적 특징이이 절차의 다양성을 구별합니다. 첫째, FRET 구축물은 기존의 제한 효소 기반 클로닝에 비해 사용하기 쉽고 정확한 결과를 생성하며 시간을 절약하는 클로닝 접근 방식인 부위 특이적 재조합을 사용하여 생성됩니다. 둘째, N. ben...

공개

이해 상충은 선언되지 않았습니다.

감사의 말

V.C. 실험실에서의 작업은 NIH (R35GM144059 및 R01GM50224), NSF (MCB1913165 및 IOS1758046) 및 BARD (IS-5276-20)의 보조금으로 지원됩니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetosyringone (3′,5′-Dimethoxy-4′-hydroxyacetophenone)Sigma-Aldrich#D134406-1G
Bacto AgarBD Biosciences#214010
Bacto tryptonBD Biosciences#211705
Bacto yeast extractBD Biosciences#212750 
Confocal laser scanning microscope (CLSM)ZeissLSM900Any CLSM with similar capabilities is suitable
EHA105VWR104013-310We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
Gateway BP Clonase II Invitrogen#11789100
Gateway LR Clonase IIInvitrogen#11791020
GV3101VWR104013-296We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
ImageJhttps://imagej.nih.gov/ij/download.html
MESSigma-Aldrich#69889-10G
MgCl2Sigma-Aldrich#63068-250G
NaClSigma-Aldrich#S5886-500G
Nicotiana benthamiana seedsHerbalistics PtyRA4 or LABWe use the stock in the Citovsky seed lab stock collection
pDONR207Invitrogen#12213013
pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 N/ARefs. 15, 28
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1N/AGenerated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-C1 construct (see refs. 15, 28)
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 N/AGenerated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 construct
RifampicinSigma-Aldrich#R7382-5G
SpectinomycinSigma-Aldrich#S4014-5G
Syringes without needlesBD309659
Zen software for CLSM imagingZeissZEN 3.0 versionThe software should be compatible with the CLSM used

참고문헌

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