Um modelo de dor inflamatória modificado para estudar o efeito analgésico em camundongos

Resumo

Aqui, apresentamos um modelo de dor inflamatória modificado com a injeção de carragenina de ambas as patas traseiras para avaliar o efeito analgésico.

Resumo

O teste da placa quente é amplamente utilizado para avaliar os efeitos analgésicos na dor inflamatória em camundongos. Um modelo comumente usado de dor inflamatória foi induzido com uma injeção intraplantar de carragenina em uma pata traseira. No entanto, os resultados de nosso laboratório mostraram que camundongos com uma injeção de carragenina na pata traseira única levantaram as patas para evitar a nocicepção térmica durante o teste da placa quente. Devido a essa resposta, o método de injeção anterior não pode refletir com precisão o limiar de dor térmica. Assim, investigamos um novo método para evitar esse problema. No presente estudo, modificamos o método anterior injetando carragenina em ambas as patas traseiras para estabelecer o modelo de dor inflamatória. Os resultados demonstraram que a injeção de carragenina em ambas as patas traseiras foi sensível e um método melhor para induzir dor inflamatória ao usar o teste da placa quente do que a injeção de pata traseira única. Com base nessas descobertas, projetamos outros experimentos nos quais camundongos com injeção de carragenina na pata traseira ou na pata traseira única foram tratados por via intragástrica com celecoxibe (30 mg / kg). Os resultados do teste da placa quente mostraram que o celecoxibe aumentou o limiar de dor térmica em camundongos com injeção de carragenina nas patas traseiras, mas não em camundongos com injeção de carragenina nas patas traseiras simples. Em resumo, desenvolvemos um método superior para induzir um modelo de dor inflamatória para avaliar o efeito analgésico.

Introdução

A dor é um problema de saúde pública em todo o mundo. É desencadeada por estimulação térmica, mecânica ou química nociva. É difícil realizar estudos de dor em humanos por causa de preocupações éticas. Portanto, o uso de modelos de dor animal é uma abordagem fundamental para entender os mecanismos da dor e pesquisar tratamentos¹. O teste da placa quente tem sido amplamente utilizado para a avaliação da nocicepção térmica e hiperalgesia². Atualmente, o modelo de dor inflamatória utilizado para o teste da placa quente é induzido com uma injeção intraplantar de carragenina em uma pata traseira. Por exemplo, para investigar o efeito antinociceptivo de microesferas carregadas de rotigotina, um modelo animal de dor inflamatória foi preparado por uma injeção de pata traseira única³. Para avaliar os efeitos dos inibidores da catecol-o-metil-transferase na nocicepção térmica em camundongos, a carragenina foi administrada na região plantar da pata traseira direita⁴. Para investigar o papel analgésico do extrato de Posidonia oceanica (L.) Delile, um modelo de dor inflamatória foi preparado em camundongos por injeção intraplantar de carragenina na pata traseira direita⁵. No entanto, os resultados de nosso laboratório mostraram que um camundongo com a injeção de carragenina na pata traseira única levantaria a pata para evitar a nocicepção térmica, o que estende de forma imprecisa a resposta do animal a um estímulo térmico no teste da placa quente. Assim, levantamos a hipótese de que o modelo de dor inflamatória com a injeção de carragenina na pata traseira única não poderia refletir com precisão o limiar térmico de dor. Portanto, otimizamos o método injetando carragenina em ambas as patas traseiras para estabelecer um modelo de dor inflamatória modificado.

Os camundongos submetidos à injeção de carragenina nas patas traseiras não tiveram como evitar o estímulo térmico para ambas as patas traseiras ao mesmo tempo. O limiar de dor foi definido como o tempo desde a colocação do mouse na placa quente até o mouse lamber uma das patas traseiras. Os resultados confirmaram que o modelo de dor inflamatória modificado é mais adequado para avaliar o limiar de temperatura nociceptiva. Isso pode melhorar a eficácia do teste da placa quente para a pesquisa e desenvolvimento de medicamentos analgésicos.

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Protocolo

O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Yantai (No. YTDX20220425). Os procedimentos seguiram as Diretrizes do National Institutes of Health para o Uso de Animais de Laboratório.

1. Animais

1. Use camundongos fêmeas ICR pesando 20-25 g para os experimentos.
2. Permitir que os animais se adaptem ao ambiente da sala experimental durante 3 dias antes de iniciar as experiências.
3. Mantenha a sala experimental com um ciclo claro-escuro de 12 horas e forneça aos camundongos livre acesso a água e ração.

2. Preparação da solução de carragenina

1. Pesar 0,1 g de carragenina. Adicione 10 mL de solução salina normal esterilizada a um tubo.
2. Adicione 0,1 g de carragenina ao tubo e vortex o tubo por 30 s.
3. Colete a solução de carragenina esterilizada a 1%.
4. Preparar a solução de carragenina antes das experiências.

3. Injeção intraplantar de carragenina

1. Use uma seringa (0,05 mL, 29G x 1/2 polegada, 0,33 mm × 12,7 mm) para injetar a solução de carragenina a 1%.
2. Agite a solução de carragenina antes de a aspirar para a seringa. Certifique-se de que não há bolhas na seringa.
3. Desinfete o local da injeção (pata traseira) com álcool 75%.
4. Injetar 30 μL ^6,7 de solução de carragenina a 1% por via subcutânea na superfície plantar da pata traseira. Para os camundongos do grupo controle, injete 30 μL de solução salina normal.
   1. Insira a agulha diagonalmente para cima na almofada do pé da pata traseira. Mantenha a estabilidade da seringa.
   2. Após a injeção, retire a seringa lentamente e pressione no local da injeção durante 2 s para evitar fugas.

4. Teste de placa quente

1. Realize o teste da placa quente 3 h após a injeção intraplantar.
2. Limpe e desinfete a superfície da placa de aquecimento.
3. Ligue o aparelho de placa quente. Clique no botão Modo de temperatura . Clique em CONSTANT para definir a temperatura para 55 ± 0.2 °C.
4. Clique no botão Iniciar experimento e clique em REACH. Pegue um rato do contêiner de acomodação. Segure suavemente seu tronco. Coloque o mouse no centro da placa de aquecimento. Clique em INICIAR.
5. Observe e registre o tempo para lamber a pata traseira esquerda (para camundongos com injeção de pata traseira única) ou pata traseira (para camundongos com injeção de pata traseira) em resposta à estimulação do calor. Pressione o pedal da placa de aquecimento para ver a hora na tela da placa de aquecimento. Defina o limiar de dor como o tempo desde colocar o mouse na chapa quente até lamber a pata traseira.
6. Definir um limite de 60 s para o ensaio da placa de aquecimento ^4,8,9. Registre um limiar de dor de 60 s se o limite for atingido.
   NOTA: Limpe o aparelho de placa quente com álcool 75% antes de colocar o próximo mouse para evitar possíveis vieses devido ao odor residual do mouse anterior.

5. Preparação de 1,5 mg/mL de celecoxib suspensão

1. Tome 1 cápsula contendo 200 mg de celecoxib. Pegue o conteúdo da cápsula e triture-a em pó.
2. Adicione 0,5% de carboximetilcelulose de sódio. O volume final é de 13,3 mL. Esta é a suspensão de armazenamento de celecoxibe.
3. Tome 1 mL da suspensão de celecoxibe armazenada. Adicione 9,0 mL de carboximetilcelulose sódica a 0,5% para obter 1,5 mg/mL de suspensão de celecoxibe.
4. Administre 0,2 mL / 10 g da suspensão de celecoxib por via intragástrica aos camundongos.
   NOTA: Selecione a agulha de gavagem com 4,0-4,5 cm de comprimento para camundongos pesando 20-25 g.

6. Avaliação do modelo de dor inflamatória modificada

1. Divida aleatoriamente os camundongos fêmeas ICR em três grupos: grupos controle, modelo e celecoxibe.
2. Injete 30 μL de solução de carragenina a 1% por via subcutânea na superfície plantar da pata traseira (pata traseira simples ou ambas as patas traseiras). Para os camundongos do grupo controle, injete 30 μL de solução salina normal.
3. Após a injeção de carragenina ou soro fisiológico, realize o tratamento imediatamente. Administre celecoxib por via intragástrica na dose de 30 mg/kg para os camundongos do grupo celecoxib. Para os camundongos dos grupos controle e modelo, administre por via intragástrica carboximetilcelulose sódica a 0,5%.
4. Efectuar o ensaio da placa quente (secção 2) 3 h após a injecção de carragenina.

7. Métodos estatísticos

1. Apresente os resultados experimentais como média ± desvio padrão. Realize um teste de distribuição de normalidade com o teste estatístico de qualidade de ajuste de Kolmogorov-Smirnov.
2. Analise a comparação entre os dois grupos usando um teste t não pareado. Realize comparações de vários grupos usando uma análise de variância unidirecional seguida pelo teste de Dunnett. Considere o valor de p < 0,05 estatisticamente significativo.

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Resultados

O limiar de dor em modelos de dor inflamatória
O limiar de dor do modelo de dor inflamatória com injeção única de carragenina na pata traseira foi de 32,23 ± 11,11 s, enquanto o limiar de dor do grupo controle foi de 27,73 ± 7,08 s. Em comparação com o grupo controle, o limiar de dor do modelo de injeção de pata traseira única não mostrou uma redução significativa (p > 0,05, Figura 1A). O limiar de dor do modelo de dor infl...

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Discussão

A dor é uma resposta protetora desencadeada por danos ou lesões nos tecidos. No entanto, também tem um impacto negativo na qualidade de vida¹⁰. Portanto, o desenvolvimento de analgésicos eficazes e a exploração dos mecanismos da dor continuam sendo áreas ativas de pesquisa. Os métodos de avaliação da dor desempenham um papel fundamental no desenvolvimento de drogas analgésicas. A injeção de carragenina com uma única pata traseira é um método cláss...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
AL204 electronic balance	Yuheng Battery Co., Ltd	YH-400A
Carboxymethylcellulose	Tianjin Chemical Co., Ltd	20210326
Carrageenan	Sigma, MO, USA	29H0715
Celecoxib	Pfizer Inc.	8142838
Hot plate	UGO Ltd. Co., Italy	PB-200
ICR female mice	Jinan Pengyue  Co., Ltd.	SCXK20220007
Normal saline	Kelun Pharmaceutical Co., Ltd	H51021157