생쥐의 진통 효과를 연구하기 위해 수정된 염증성 통증 모델

요약

여기에서는 진통 효과를 평가하기 위해 양쪽 뒷발 카라기난 주사를 사용한 수정된 염증성 통증 모델을 제시합니다.

초록

핫플레이트 검사는 생쥐의 염증성 통증에 대한 진통 효과를 평가하는 데 널리 사용됩니다. 일반적으로 사용되는 염증성 통증 모델은 한쪽 뒷발에 카라기난을 발바닥 내 주사하여 유도했습니다. 그러나 우리 실험실의 연구 결과에 따르면 카라기난을 단일 뒷발로 주사한 쥐는 핫플레이트 테스트 중에 열 통각을 피하기 위해 발을 들어 올렸습니다. 이러한 반응으로 인해 이전 주입 방법은 열 통증 임계값을 정확하게 반영할 수 없습니다. 따라서 이 문제를 방지하기 위한 새로운 방법을 조사했습니다. 본 연구에서는 염증성 통증 모델을 확립하기 위해 양쪽 뒷발에 카라기난을 주사하여 이전 방법을 수정했습니다. 그 결과, 카라기난을 사용한 양쪽 뒷발 주사가 민감하고 핫플레이트 검사를 사용할 때 단일 뒷발 주사보다 염증성 통증을 유발하는 더 나은 방법임을 보여주었습니다. 이러한 결과를 바탕으로 우리는 카라기난을 양쪽 뒷발 또는 단일 뒷발 주사한 쥐를 셀레콕시브(30mg/kg)로 위내 치료하는 추가 실험을 설계했습니다. 핫플레이트 테스트 결과, 셀레콕시브는 카라기난을 양쪽 뒷발 주사로 마우스에서 열 통증 역치를 증가시켰지만, 카라기난을 단일 뒷발 주사한 마우스에서는 증가하지 않은 것으로 나타났습니다. 요약하면, 우리는 진통 효과를 평가하기 위해 염증성 통증 모델을 유도하는 우수한 방법을 개발했습니다.

서문

통증은 전 세계적으로 공중 보건 문제입니다. 유해한 열적, 기계적 또는 화학적 자극에 의해 유발됩니다. 윤리적 우려 때문에 인간을 대상으로 통증 연구를 수행하는 것은 어렵습니다. 따라서 동물의 통증 모델을 사용하는 것은 통증 메커니즘을 이해하고 치료법을 연구하는 데 중요한 접근 방식입니다¹. 핫플레이트 검사는 열통각(thermal nociception)과 통각과민(hyperalgesia)의 평가에 널리 사용되어 왔다². 현재 열판 검사에 사용되는 염증성 통증 모델은 한쪽 뒷발에 카라기난을 발바닥 내 주사하여 유도합니다. 예를 들어, 로티고틴이 적재된 미세구의 항통각 효과를 조사하기 위해 단일 뒷발 주사로 염증성 통증의 동물 모델을 준비했습니다³. 생쥐의 열 통각에 대한 catechol-o-methyl-transferase 억제제의 효과를 평가하기 위해 카라기난을 오른쪽 뒷발⁴의 발바닥 부위에 투여했습니다. Posidonia oceanica (L.) Delile 추출물의 진통 역할을 조사하기 위해, 오른쪽 뒷발⁵에 카라기난을 발바닥 내 주사하여 마우스에서 염증성 통증 모델을 준비했습니다. 그러나 우리 실험실의 연구 결과에 따르면 카라기난을 단일 뒷발 주사한 쥐는 열적 통각을 피하기 위해 발을 들어 올리는 것으로 나타났으며, 이는 열판 테스트에서 열 자극에 대한 동물의 반응을 부정확하게 확장합니다. 따라서, 우리는 카라기난의 single-hind-paw 주사를 사용한 염증성 통증 모델이 열 통증 역치를 정확하게 반영할 수 없다는 가설을 세웠다. 따라서 양쪽 뒷발에 카라기난을 주입하여 방법을 최적화하여 수정된 염증성 통증 모델을 확립했습니다.

카라기난을 양쪽 뒷발로 주사한 쥐는 동시에 양쪽 뒷발에 대한 열 자극을 피할 방법이 없었습니다. 통증 역치는 마우스를 핫플레이트에 올려놓은 시점부터 마우스가 양쪽 뒷발을 핥을 때까지의 시간으로 정의되었습니다. 그 결과, 수정된 염증성 통증 모델이 통각 수용성 온도 역치를 평가하는 데 더 적합하다는 것을 확인했다. 이는 진통제의 연구 개발을 위한 핫플레이트 테스트의 효능을 향상시킬 수 있습니다.

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프로토콜

실험 프로토콜은 Yantai University의 Institutional Animal Care and Use Committee(No. YTDX20220425). 이 절차는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 실험동물 사용에 대한 가이드라인(Guidelines for the Use of Laboratory Animals)을 따랐습니다.

1. 동물

1. 실험을 위해 20-25g 무게의 ICR 암컷 마우스를 사용하십시오.
2. 실험을 시작하기 전에 동물이 3일 동안 실험실 환경에 적응하도록 합니다.
3. 실험실을 12시간의 명암 주기로 유지하고 쥐가 물과 차우에 자유롭게 접근할 수 있도록 합니다.

2. 카라기난 용액의 제조

1. 카라기난 0.1g의 무게를 잰다. 멸균된 생리식염수 10mL를 튜브에 넣습니다.
2. 튜브에 카라기난 0.1g을 넣고 튜브를 30초 동안 소용돌이칩니다.
3. 1% 멸균된 카라기난 용액을 수집합니다.
4. 실험 전에 카라기난 용액을 준비하십시오.

3. 카라기난의 발바닥 내 주사

1. 주사기(0.05mL, 29G x 1/2인치, 0.33mm × 12.7mm)를 사용하여 1% 카라기난 용액을 주입합니다.
2. 카라기난 용액을 주사기에 넣기 전에 흔듭니다. 주사기에 기포가 없는지 확인하십시오.
3. 주사 부위 (뒷발)를 75 % 알코올로 소독합니다.
4. 30 μL ^6,7 1 % 카라기난 용액을 뒷발의 발바닥 표면에 피하로 주입합니다. 대조군 마우스의 경우 30μL의 생리식염수를 주입합니다.
   1. 바늘을 대각선 위쪽으로 뒷발 패드에 삽입합니다. 주사기의 안정성을 유지하십시오.
   2. 주입 후 주사기를 천천히 빼내고 누출을 방지하기 위해 주사 부위를 2초 동안 누릅니다.

4. 열판 테스트

1. 족저내 주사 후 3시간 후에 열판 검사를 실시합니다.
2. 핫 플레이트의 표면을 청소하고 소독하십시오.
3. 핫 플레이트 장치를 시작합니다. 온도 모드 버튼을 클릭합니다. CONSTANT 를 클릭하여 온도를 55 ± 0.2 °C로 설정합니다.
4. 실험 시작 버튼을 클릭하고 REACH를 클릭합니다. 숙박 시설에서 쥐 한 마리를 꺼냅니다. 몸통을 부드럽게 잡습니다. 마우스를 핫 플레이트 중앙에 놓습니다. 시작을 클릭합니다.
5. 열 자극에 반응하여 왼쪽 뒷발(단일 뒷발 주사를 사용한 마우스의 경우) 또는 뒷발(양쪽 뒷발 주사를 사용한 마우스의 경우)을 핥는 시간을 관찰하고 기록합니다. 열판의 페달을 밟으면 열판 화면에서 시간을 볼 수 있습니다. 통증 역치를 핫플레이트에 마우스를 올려놓은 후 뒷발을 핥을 때까지의 시간으로 정의합니다.
6. 핫 플레이트 테스트⁶⁰에 대해 ^4,8,9초 제한을 설정합니다. 한계에 도달한 경우 60초의 통증 임계값을 기록합니다.
   알림: 이전 마우스의 잔류 냄새로 인한 편견을 방지하기 위해 다음 마우스를 놓기 전에 75% 알코올로 핫플레이트 장치를 청소하십시오.

5. 1.5mg/mL 셀레콕시브 현탁액의 제조

1. 200mg의 셀레콕시브가 함유된 캡슐 1정을 복용하십시오. 캡슐의 내용물을 얻어 가루로 갈아줍니다.
2. 0.5% 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스를 추가합니다. 최종 부피는 13.3mL입니다. 이것은 celecoxib의 매장 중단입니다.
3. 상점 현탁액 celecoxib 1mL를 복용하십시오. 0.5% 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨 9.0mL를 첨가하여 1.5mg/mL의 셀레콕시브 현탁액을 얻습니다.
4. 0.2mL/10g의 celecoxib 현탁액을 마우스에 위강내로 투여합니다.
   알림: 무게가 4.0-4.5g인 마우스의 경우 길이가 20-25cm인 개비지 바늘을 선택하십시오.

6. 수정된 염증성 통증 모델 평가

1. ICR 암컷 마우스를 대조군, 모델링 그룹 및 celecoxib 그룹의 세 그룹으로 무작위로 나눕니다.
2. 30μL의 1% 카라기난 용액을 뒷발의 발바닥 표면(단일 뒷발 또는 양쪽 뒷발)에 피하로 주입합니다. 대조군 마우스의 경우 30μL의 생리식염수를 주입합니다.
3. 카라기난 또는 생리 식염수를 주입 한 후에는 즉시 시술을 실시하십시오. celecoxib 그룹의 마우스에 대해 30mg/kg의 용량으로 celecoxib를 위내 투여합니다. 대조군 및 모델 그룹의 마우스에 대해 0.5% 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스를 위내 투여합니다.
4. 카라기난 주입 후 2시간 후 3시간에 핫 플레이트 테스트(섹션 2)를 수행합니다.

7. 통계적 방법

1. 실험 결과를 평균 ± 표준 편차로 표시합니다. Kolmogorov-Smirnov 통계적 적합도 검정을 사용하여 정규성 분포 검정을 수행합니다.
2. 쌍을 이루지 않은 t-검정을 사용하여 두 그룹 간의 비교를 분석합니다. 일원 분산 분석을 사용한 후 Dunnett의 검정을 사용하여 여러 그룹 비교를 수행합니다. p의 값이 통계적으로 유의하다는 점을 고려< 0.05입니다.

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결과

염증성 통증 모델에서의 통증 역치
카라기난을 단일 뒷발 주사한 염증성 통증 모델의 통증 역치는 32.23 ± 11.11초인 반면, 대조군의 통증 역치는 27.73 ± 7.08초였습니다. 대조군과 비교했을 때, single-hind-paw 주사 모델의 통증 역치는 유의한 감소를 보이지 않았다(p > 0.05, 그림 1A). 카라기난을 양쪽 뒷발 주사한 염증성 통증 모델의 통증 역?...

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토론

통증은 조직 손상이나 부상으로 인해 유발되는 보호 반응입니다. 그러나 삶의 질에도 부정적인 영향을 미친다¹⁰. 따라서 효과적인 진통제의 개발과 통증 메커니즘의 탐구는 여전히 활발한 연구 분야로 남아 있습니다. 통증을 평가하는 방법은 진통제 개발에 중요한 역할을 합니다. 카라기난의 단일 뒷발 주입은 열판 테스트를 위한 고전적인 방법입니다. ...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
AL204 electronic balance	Yuheng Battery Co., Ltd	YH-400A
Carboxymethylcellulose	Tianjin Chemical Co., Ltd	20210326
Carrageenan	Sigma, MO, USA	29H0715
Celecoxib	Pfizer Inc.	8142838
Hot plate	UGO Ltd. Co., Italy	PB-200
ICR female mice	Jinan Pengyue  Co., Ltd.	SCXK20220007
Normal saline	Kelun Pharmaceutical Co., Ltd	H51021157