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Resumo

Este protocolo descreve um método de purificação SERCA aprimorado, que inclui o dissacarídeo trealose na etapa final de centrifugação. Este carboidrato estabiliza as proteínas em condições adversas. O SERCA purificado foi cataliticamente ativo e apresentou alta pureza, tornando-o adequado para estudos estruturais e funcionais.

Resumo

Algumas ATPases do tipo P, como a sarco/retículo endoplasmático Ca2+-ATPase (SERCA), são proteínas de membrana inerentemente lábeis que requerem condições físico-químicas específicas durante a purificação para obtê-las com alta pureza e qualidade estrutural e em uma forma cataliticamente ativa. O dissacarídeo trealose é um soluto compatível que é sintetizado e acumulado em altas concentrações no citoplasma da levedura para estabilizar as membranas e proteínas. O uso da trealose como aditivo no protocolo de purificação da membrana plasmática H+-ATPase resulta em uma preparação de alta qualidade, cuja estrutura hexamérica é demonstrada por métodos analíticos bioquímicos. A trealose pode, portanto, ser usada como um aditivo estabilizador para a purificação de proteínas de membrana (P-ATPases). Este protocolo descreve a modificação do protocolo clássico para purificação do SERCA submetendo o SERCA à centrifugação em um gradiente de concentração de trealose. A inclusão deste carboidrato levou à purificação do SERCA em uma forma cataliticamente ativa com alta pureza e, mais importante, em uma forma estável. A caracterização bioquímica parcial do SERCA purificado (SDS-PAGE, cinética enzimática, marcação FITC, espectroscopia de dicroísmo circular) mostrou que a enzima é adequada para estudos funcionais e estruturais. Sugere-se o uso de trealose no protocolo de purificação de ATPases do tipo P e outras proteínas lábeis de membrana (e citosólicas).

Introdução

As proteínas/enzimas de membrana são componentes biológicos essenciais das células, pois desempenham papéis críticos em vários processos 1,2,3. Algumas das funções podem incluir o transporte de íons e moléculas para dentro e para fora da célula/compartimentos internos (ativo/passivo), reconhecimento célula-célula, ligação intercelular, ancoragem/fixação e detecção do ambiente externo por meio da integração com a maquinaria de transdução de sinal sob condições físicas e químicas normais e adversas (alto teor de sal, baixa água, alta temperatura, resistência a medicamentos, etc.)3 Portanto, a determinação da estrutura tridimensional (3D) de proteínas e/ou enzimas de membrana tornou-se de grande importância tanto para a pesquisa básica quanto para a aplicada 4,7,6. É importante ressaltar que as proteínas/enzimas de membrana têm sido amplamente utilizadas como alvos para a descoberta de medicamentos (sejam naturais ou por design)7,8,9. Ou seja, as proteínas de membrana têm uma importância inerente à saúde 9,10,11.

O caráter hidrofóbico das proteínas/enzimas de membrana é a propriedade físico-química tecnicamente mais desafiadora para o laboratório experimental 12,13,14, ainda mais quando se trabalha com proteínas de membrana integrais oligoméricas e/ou altamente lábeis 15,16. O isolamento de quantidades adequadas da proteína/enzima de membrana com a mais alta qualidade possível para ensaios experimentais funcionais e estudos estruturais é altamente desejável17. As proteínas de membrana, por serem inerentemente hidrofóbicas, são muito difíceis de purificar, e a escolha do detergente costuma ser uma das questões mais importantes a serem consideradas 17,18,19,20. Nesse sentido, os métodos laboratoriais usados para isolar proteínas de membrana normalmente causam algum grau de dano ao arranjo estrutural 3D da proteína21. Alguns desses métodos incluem o uso de (a) sonicação (ondas ultrassônicas de alta frequência/energia), (b) detergentes solubilizadores de proteínas (agressivos, médios ou suaves)22, (c) pressões relativamente altas em cromatografia em coluna e ultracentrifugação de alta velocidade23, (d) moléculas precipitantes, (e) enzimas digestivas e outros21. Todos esses processos podem contribuir ou ser a principal causa da desestabilização de proteínas durante a purificação21. A esse respeito, alguns protocolos parecem funcionar relativamente bem para uma determinada proteína de membrana. No entanto, a otimização é sempre bem-vinda ao usar novos ensaios modernos ou métodos que requerem uma maior qualidade de preparação de proteínas de membrana para obter resultados satisfatórios24. As etapas de otimização podem incluir, mas não estão limitadas a, melhorar o projeto da construção, encontrar condições ideais para a expressão da proteína da membrana, estabelecer melhores condições de manuseio (ou seja, pH, temperatura, etc.), encontrar o melhor detergente compatível, ajustar as etapas de purificação, como tempo de sonicação, velocidade de centrifugação, reformular soluções tampão adicionando agentes estabilizantes, etc.25,26,27. Portanto, qualquer alteração na metodologia de purificação que leve a um aumento na qualidade (pureza) e na atividade da proteína/enzima de membrana purificada é importante.

Na família ATPase do tipo P, a membrana plasmática da levedura H+-ATPase parece ser um dos membros mais lábeis28,29. A H+-ATPase perde sua atividade hidrolisante de ATP após desidratação (liofilização), choque térmico, etc.28,29. O uso da trealose como estabilizador proteico foi testado no isolamento da membrana plasmática H+-ATPase da levedura K. lactis30,31; a preparação de H+-ATPase obtida foi de alta pureza e cataliticamente ativa. É importante ressaltar que isso permitiu que o estado oligomérico da enzima fosse resolvido por métodos bioquímicos, revelando que era um hexâmero e posteriormente confirmado por microscopia crioeletrônica 31,32,33,34,35. Portanto, parece provável que o delicado arranjo tridimensional (3D) das proteínas de membrana possa ser perdido em condições relativamente adversas durante a purificação36. A cinética de inativação bifásica é observada para H+-ATPase durante a inativação mediada por calor29. Nas células de levedura, como em muitos outros organismos, o dissacarídeo trealose se acumula em altas concentrações sob condições de estresse ambiental 37,38,39. A trealose mantém a integridade da membrana e a função de transporte, estabilizando proteínas (tanto incorporadas na membrana quanto citosólicas) e membranas celulares40,41. O mecanismo estabilizador da trealose tem sido extensivamente estudado por vários grupos e por nosso laboratório 42,43,44,45. Experimentos com a H+-ATPase e outras enzimas mostraram que a trealose é o estabilizador proteico mais eficaz entre os mono e dissacarídeos28,29. Isso levou à sua inclusão no protocolo de purificação da H+-ATPase30. Recentemente, a trealose também tem sido usada na purificação do retículo sarcoplasmático Ca2+-ATPase (SERCA) do músculo de contração rápida de coelhos com bons resultados na pureza e atividade proteica46. Portanto, a trealose parece ser um aditivo bom e apropriado para a purificação de ATPases do tipo P e provavelmente outras proteínas de membrana e citosólicas.

Para as P-ATPases, a existência de domínios citoplasmáticos estruturais é uma vantagem experimental, especialmente para estudos de interação substrato/ligante47; A ligação ao ATP foi estudada em domínios N recombinantes altamente puros 47,48,49, eliminando assim as considerações técnicas para a purificação de enzimas de membrana inteiras 47,48,50, entre outras 51. Infelizmente, alguns estudos funcionais (conversão catalítica / energética) e estruturais (arranjo de subunidades e interação com outras proteínas) ainda requerem toda a P-ATPase 52,53. Nesse sentido, a purificação do SERCA tem sido alcançada por vários grupos de pesquisa 54,55,56,57,58. No entanto, melhorias ainda podem ser implementadas46, por exemplo, aumentando a integridade da ATPase purificada59, evitando a desnaturação / ruptura de proteínas de complexos proteicos25, aumentando a solubilização sem desnaturação da proteína de membrana (ou seja, evitando a formação de agregados macromoleculares) 60, levando a uma melhor compatibilidade com ensaios e outros métodos analíticos a jusante61 Além disso, à medida que novas estratégias experimentais, aditivos, inibidores enzimáticos, etc. aparecem na literatura científica 61,62,63,64,65,66, eles às vezes precisam ser testados com toda a P-ATPase. Este trabalho descreve o protocolo para a purificação do SERCA e o uso da trealose como aditivo para estabilizar a estrutura proteica e a atividade da ATPase; Ou seja, além de aumentar a qualidade da enzima (estrutural), a trealose ajuda a prevenir a perda de estrutura e atividade enzimática durante o isolamento e armazenamento da enzima, o que ajuda a economizar material biológico e, assim, reduzir o número de purificações enzimáticas.

Protocolo

Todos os procedimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes internacionais e locais (NORMA Oficial Mexicana NOM-062-ZOO-1999) para o manejo de animais em laboratórios experimentais 51,67,68. O tecido muscular foi obtido de Oryctolagus cuniculus do tipo selvagem de uma unidade local de manejo de animais (INE/CITES/DGVS-ZOO-E0055-SLP-98)46. Um veterinário com experiência em manejo de animais de laboratório realizou a dissecção e processamento muscular inicial. Os detalhes dos reagentes e dos equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Isolamento do retículo sarcoplasmático do músculo de coelho de contração rápida (Timing, 7 - 9 h)

NOTA: Para detalhes sobre o procedimento, consulte Champeil et al.69.

  1. Obtenha tecido muscular de contração rápida (~ 70 g de ambas as patas traseiras por animal) de Oryctolagus cuniculus do tipo selvagem.
    NOTA: É necessária a identificação visual prévia dos músculos a serem dissecados70,71.
  2. Macerar o músculo de contração rápida no liquidificador, suspendendo-o em três volumes de 100 mM de KCl, com 1 min ligado e 1 min em repouso gelado, repetir três vezes72.
  3. Remover os restos de tecido por centrifugação (1500 × g) a 4 °C durante 5 min; Uma segunda centrifugação (4200 × g) é realizada, se necessário.
  4. Colete o sobrenadante e homogeneize-o usando um triturador de tecidos (10 golpes em baixa velocidade, ou seja, 500-1.500 rpm)72,73. Centrifugar o homogeneizado (10.000 × g) a 4 °C durante 15 min.
    NOTA: Deve-se ter cuidado ao homogeneizar, pois o uso de uma velocidade relativamente alta pode resultar em danos ao sistema e ao operador.
  5. Centrifugar o sobrenadante (contendo o retículo sarcoplasmático) (33.000 × g) a 4 °C durante 120 min.
  6. Suspender os pellets em 40 ml de sacarose 0,5 M e centrifugar (12.000 × g) a 4 °C durante 15 min. Diluir o sobrenadante (0,6 M de KCl e 0,15 M de sacarose) e centrifugar a suspensão (34.000 × g) a 4 °C durante 165 min.
  7. Suspenda o pellet contendo as folhas de vesículas do retículo sarcoplasmático (SRVs) em 0,3 M de sacarose, 0,1 M de KCl e 5 mM de Tris-HCl, pH 7,0. Determine a concentração de proteína usando o ensaio de Lowry74 e albumina sérica humana como padrão de proteína.
  8. Alíquota dos SRVs (30-32 mg/mL) em volume de 1 mL. Armazene as amostras de SRVs a -72 °C para processamento posterior.
    NOTA: O rendimento proteico é de 100-110 mg SRVs por animal.

2. Purificação SERCA (Tempo, 18 - 20 h)

NOTA: Para detalhes sobre o procedimento, consulte Rivera-Morán et al.46.

  1. Dilua a suspensão de SRVs para 2 mg de proteína / mL usando 75 mM gelados de Tris-HCl, pH 7,2, 0,6 M de KCl, 6 mM de EDTA, 1 mM de EGTA e 0,1% (p / v) desoxicolato (DOC). Incube a suspensão SRVs no gelo por 10 min e agitação suave. Centrifugue a suspensão SRVs (100.000 × g) a 4 °C por 60 min.
    NOTA: DOC deve ser adicionado gota a gota.
  2. Suspenda os pellets em <3 mL de 25 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 0,3 M de KCl, glicerol a 45% (v/v) e 2 mM de EDTA. Homogeneizar a suspensão e ajustar para um volume final de 10 ml. Determine a concentração de proteína e, em seguida, ajuste-a para 6,5 mg / mL. Adicionar azolectina a 5 mg/ml e Zwittergent 0,85 (p/p) 3-14.
    NOTA: Azolectina e Zwittergent 3-14 devem ser adicionados gota a gota.
  3. Homogeneizar a suspensão e centrifugar (100.000 × g) a 4 °C durante 60 min. Recolha o sobrenadante e dilua 1:2 com 2 mM de EGTA (pH 7,2).
  4. Despeje a suspensão suavemente em um gradiente de concentração de trealose descontínuo (45, 40, 35 e 30% p / v) em 10 mM de Tris-HCl, pH 7,0, 1 mM de EDTA, 0,1% de desoxicolato e 1 mg / mL de azolectina. Centrifugar (100.000 × g) a 4 °C durante 14 h. Recolha o pellet transparente e ligeiramente amarelado formado no fundo dos tubos.
    NOTA: Tanto a formação do gradiente de trealose como a adição da suspensão da amostra devem ser realizadas utilizando técnicas adequadas. Recomenda-se centrifugação durante a noite.
  5. Suspenda suavemente o pellet em um pequeno volume (<1,5 mL) de 25 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 0,3 de M KCl, 45% de glicerol e 2 mM de EDTA. Determine a concentração de proteína. Ajustar a concentração de proteínas por diluição para 2 mg/ml. Pegue alíquotas (~ 50 μL) da suspensão e armazene o SERCA purificado a -72 ° C até seu uso.
  6. Execute SDS-PAGE do SERCA72 purificado e de amostras de proteínas colhidas em diferentes etapas da purificação. Manchar o gel com Coomassie Blue72.
    NOTA: O uso de trealose 0,6 M em vez de glicerol no tampão de suspensão aumenta a estabilidade da enzima durante os ciclos de armazenamento e congelamento e descongelamento28,29.

3. Ensaio para atividade de ATPase (tempo, 1 - 2 h)

  1. Ensaio acoplado a enzimas: ATPase-Piruvato quinase-lactato desidrogenase
    1. Preparar a mistura de reacção (1 ml): 50 mM MOPS (pH 7,0), 1 mM EGTA, 80 mM KCl, 5 mM MgCl2, 3 mM CaCl2, 5 mM fosfoenolpiruvato, 250 μM NADH. Inclua concentrações variáveis de ATP (0,001 a 0,25 mM).
    2. Homogeneizar cuidadosamente o ensaio de reação por vórtice. Incube o ensaio de reação a 37 ◦C por 10 min. Adicione 0,9 U L-lactato desidrogenase (LDH) e 1,5 U piruvato quinase (PK).
    3. Inicie a reação ATPase pela adição de 10 μg de SERCA.
    4. Determine a formação de NADH. Acompanhe a mudança na intensidade da absorbância a cada segundo durante 600 s a um comprimento de onda (λ) de 340 nm ao longo do tempo usando um espectrofotômetro com um suporte de célula termostatizado.
      NOTA: O intervalo de tempo para a medição da absorbância pode variar, mas tente registrar o maior número possível de pontos de dados para desenhar a linha reta inicial da reação ATPase.
  2. Determine a taxa de hidrólise de ATP
    NOTA: Para detalhes sobre o procedimento, consulte Rivera-Morán et al.46.
    1. Calcule o valor da inclinação (Δabs/min) da porção linear em cada curva formada. Use o coeficiente de extinção molar (ε) de NADH (λ = 6.220 M−1·cm−1) para determinar a atividade da ATPase (μmoles ATP hidrolisado/min.mg prot.)
  3. Determinar os parâmetros cinéticos Km e Vmáx
    1. Plote os dados de velocidade versus concentração de ATP usando software de análise de dados e gráficos.
    2. Ajuste os dados por regressão não linear à Equação de Michaelis-Menten (Eq. 1)46:
      figure-protocol-7359
      onde v é a velocidade, Vmax é a velocidade máxima, [S] é a concentração de ATP e Km é a constante de Michaelis-Menten.
    3. Determine Km e Vmax por iteração.
      NOTA: A inclusão de DOC pode aumentar a taxa de resposta da ATPase; recomenda-se testar diferentes concentrações de DOC para encontrar o ideal.

4. Ensaio de marcação de SERCA com isotiocianato de fluoresceína (FITC) (tempo, 30 - 45 min, apenas para marcação FITC)

NOTA: Para obter detalhes sobre o procedimento, consulte 54,75,76.

  1. Suspenda o SERCA (20 μg) em 50 μL (volume final) de tampão de marcação (100 mM de KCl, 5 mM de MgCl2 e 30 mM de Tris-HCl, pH 8,9) contendo 1 mM de FITC. Misture por vórtice.
  2. Incube as amostras em momentos diferentes (15 min, 10 min, 7 min, 5 min e 2 min) no escuro e em temperatura ambiente.
  3. Pare a reação de marcação adicionando 1 volume de tampão de parada gelado (480 mM de sacarose e 48 mM de MOPS, pH 7,0), contendo ATP (5 mM). Incube no gelo por 5 min no escuro.
  4. Sujeito o SERCA rotulado com FITC à SDS-PAGE72. Exponha os géis transparentes à luz UV (λ = 302 nm). Foto: documente o resultado.
  5. Manchar o gel com azul Coomassie. Foto: documente o resultado.
    NOTA: Realizar a rotulagem FITC em uma sala escura pode melhorar a qualidade do sinal de fluorescência.

5. Espectros de dicroísmo circular (CD) (Tempo, 30 min)

NOTA: Para obter detalhes sobre o procedimento, consulte 11,77.

  1. Suspender SERCA (3 μM) em 400 μL de tampão fosfato 10 mM (pH 7,0) a 25 °C.
  2. Carregue a amostra em uma célula de 0,1 cm de comprimento de caminho. Defina a faixa λ dos espectros de UV distante entre 190-260 nm. Defina a resolução interna e a largura de banda para 1 nm.
  3. Registar o sinal de CD a 50 nm/min a 25 °C.

Resultados

SDS-PAGE de SERCA em diferentes estágios de purificação (Figura 1). O gel corado com azul de Coomassie mostra o enriquecimento da banda da proteína SERCA (peso molecular aparente >100 kDa) à medida que o protocolo de purificação avança. A banda de proteína correspondente ao SERCA mostra uma pureza de >90% após centrifugação em um gradiente de concentração de trealose. Gráfico da taxa de hidrólise de ATP versus concentração de ATP (...

Discussão

A maioria das moléculas e íons não pode atravessar livremente as membranas celulares, por exemplo, o próton (H+) requer um transportador de membrana na membrana plasmática de uma variedade de organismos e organelas, como as mitocôndrias83,84. As membranas celulares são seletivas e as moléculas e íons que atravessam as membranas celulares são diversos, portanto, vários tipos de proteínas de membrana podem se...

Divulgações

O autor declara que não tem interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

O autor agradece a ajuda de Edmundo Mata-Morales na edição do vídeo, VM, Valentín de la Cruz-Torres na purificação dos SRVs, Miguel A. Rivera-Moran na purificação e análise do SERCA e Juan C. Gonzalez-Castro, Franco E. Juarez, Alejandra Nevarez, Nicolas Rocha-Vizuet e Jocelin I. Ramírez-Alonso na produção do vídeo. Nenhum fundo, subsídio ou outro apoio foi recebido para conduzir este estudo.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
ATPSigma-Aldrich CorpA2383
Azolectin from soybeanSigma-Aldrich Corp44924
Benchtop UV transilluminator Cole-ParmerEW-97623-08Dual intensity High setting is ideal for analytical documentation. Low setting reduces photonicking or photobleaching of gel samples while doing preparative work.
CaCl2 • 2H2OSigma-Aldrich Corp223506
Coolpix B500 camera Nikon CorpS210
Coomassie brilliant blue G-250Bio-Rad1610406
Dodecyl maltosideSigma-Aldrich CorpD4641
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acidSigma-Aldrich CorpE4378
Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate Sigma-Aldrich CorpE6511
Fluorescein isothiocyanateSigma-Aldrich CorpF3651
KClJT Baker7447-40-7
MgCl2 • 6H2OSigma-Aldrich CorpM9272
MOPSSigma-Aldrich CorpM1254
NADHChem-Impex International Inc230
N-tetradecyl-N,N- dimethyl-3-ammonium-1-propanesulfonateSigma-Aldrich CorpD0431
Phosphoenolpyruvate (PEP)Chem-Impex International Inc9711
Rabbit muscle lactate dehydrogenaseRoche10003557103
Rabbit muscle pyruvate kinaseSigma-Aldrich CorpP1506
Sodium deoxycholateSigma-Aldrich CorpD6750
Sodium dodecyl sulfateBio-Rad1610302
Spectropolarimeter Jasco Corp.Jasco J1500 
SucroseSigma-Aldrich Corp84100
TrehaloseSigma-Aldrich CorpT0167Dihydrate
Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochlorideSigma-Aldrich Corp857645
UltracentrifugeBeckmanOptima XPN
UV/VIS spectrophotometer Agilent Technologies8453The Agilent 8453 UV-Vis Spectrophotometer uses a photodiode array for simultaneous measurement of the complete ultra-violet to visible light spectrum
WiseStir HS- 30EDaihan Scientific Co.DH.WOS01010Ideal for all disperging and homogenizing applications, designed for tissue grinders.

Referências

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